05%，七水合硫酸鋅0. 05%，無水氯化鈣0. 05%，瓊脂2. 0%，pH6. 5,115°C滅菌 25min〇
[0077] 乙成份：6. 7%的大豆混合磷脂水溶液，調(diào)節(jié)pH為6. 5，115°C，25min滅菌。滅菌后， 按照甲成份ll〇ml和乙成份90ml的比例進(jìn)行混合并制備平板。
[0078] 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA)培養(yǎng)基制備方法如下：
[0079] 取新鮮馬鈴薯去皮后稱取200g，切成小塊，而后加入約1L的去離子水，煮爛后，過 濾得到清液。加入20g的葡萄糖和15-20g的瓊脂粉，補(bǔ)水至體積1000ml后，于121°C滅菌 20min，即可制備得到PDA培養(yǎng)基。
[0080] 察氏培養(yǎng)基：
[0081] 硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀lg、七水合硫酸鎂0. 5g、氯化鉀0. 5g、七水合硫酸亞鐵 〇? 〇lg、鹿糖30g、瓊脂20g、蒸饋水1000ml。
[0082] 麥芽汁培養(yǎng)基：
[0083] 麥芽汁粉20g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml。
[0084] 查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基：
[0085] 硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀lg、酵母膏5g、七水合硫酸鎂0. 5g、氯化鉀0. 5g、七水合硫 酸亞鐵0.Olg、鹿糖30g、瓊脂20g、蒸饋水1000ml。
[0086] 枝孢霉產(chǎn)磷脂酶C的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(單位wt%):
[0087] 蔗糖 1.0,蛋白胨 0. 5,酵母浸出粉 0. 5,玉米漿膏 0. 5，K2HP040. 15，Na2HP040. 25， MgS04 *711200.l，CaC120.l，ZnS04 *711200. 2,硫酸銨 0? 1，吐溫 800. 2,磷脂 0? 5,玉米粉 1. 0， pH7. 0 ；
[0088] 實(shí)施例1 :枝孢霉（Cladosporiumsp. )WBRD00050的分離及鑒定
[0089] 取新鮮藏酥油樣品，去除約1cm厚度表層后，切取約10g左右的藏酥油樣品置于 100mL含1. 0%混合磷脂（購自北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司）的無菌水溶液中。充分振蕩 30min后，將溶液分別稀釋101、102、103、10 4倍，并將各個稀釋度的樣品涂布于篩選平板上， 于28 °C培養(yǎng)。
[0090] 每24h觀察篩選平板上是否有菌落出現(xiàn)。培養(yǎng)96h后，挑取渾濁圈較大較明顯的 微生物進(jìn)行進(jìn)一步的劃線分離以獲得純種菌株。用篩選平板對這些純種菌株進(jìn)行胞外磷脂 酶檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一株渾濁圈十分顯著的菌株命名為WBRD00050。
[0091] 將菌株WBRD00050分別在察氏培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基和 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，25°C培養(yǎng)96h后，觀察檢測菌株的生態(tài)學(xué)形態(tài)和形 態(tài)學(xué)特征。
[0092] 結(jié)果顯示，WBRD00050在察氏培養(yǎng)基上25°C溫度下生長速度極慢，培養(yǎng)7天時菌 落直徑為l〇mm，菌絲呈絨狀、暗黃綠色、質(zhì)地致密、背面呈黑綠色；該菌在麥芽汁培養(yǎng)基上 25°C溫度下生長7天時達(dá)菌落直徑可達(dá)30mm，菌絲厚絨狀，灰色、質(zhì)地致密、背面墨黑色；在 查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上25°C溫度下生長7天時的菌落直徑約20mm，菌絲絨狀，形成同心 環(huán)紋，中間橄欖色，外圍暗黃綠色，質(zhì)地致密，背面黃綠至褐色；該菌在PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊 月旨）培養(yǎng)基上25°C溫度下培養(yǎng)7天時的菌落直徑約15mm，菌絲絨狀或絮狀，黃綠色，質(zhì)地致 密，背面綠黑色。
[0093] 在顯微鏡下觀察，分生孢子梗單生、叢生、直立或曲屈狀，偶有分枝，具隔膜；枝孢 0-3個，隔膜，平；分生孢子橢圓形近球形，孢臍明顯，褐色，頂生。
[0094] 根據(jù)以上結(jié)果，篩選獲得的WBRD00050與枝孢霉（Cladosporium)屬菌最相似。
[0095] 經(jīng)過對該菌的18SrDNA測序，測序結(jié)果如SEQIDN0:1所示，進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)該菌 與Cladosporiumsp.CBS280.49(GENBANK號EU167574. 1)，Cladosporiumcladosporioides (GENBANK號EU375523. 1)，Cladosporiumbruhnei(GENBANK號AY251096. 2)，Cladosporium uredinicola(GENBANK號AY251097. 2)以及Cladosporiumcellare(GENBANK號 NG016540. 1)等的同源性均超過99%。
[0096] 該菌株已于2013年4月22日在"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心"（CGMCC)保藏，保藏號是CGMCCNo. 7508,分類命名為枝孢霉（Cladosporiumsp.)。
[0097] 實(shí)施例2 :枝孢霉胞外磷脂酶C的制備和鑒定
[0098] ( 1)枝孢霉胞外磷脂酶C的發(fā)酵
[0099] 將枝孢霉WBRD00050接種至PDA斜面培養(yǎng)基，于28 °C培養(yǎng)120h，獲得枝孢霉 WBRD00050斜面。取2支枝孢霉WBRD00050斜面各加入10ml的無菌水，充分洗滌獲得孢子 懸浮液，合并所有的孢子懸浮液。以lml/瓶的接種量將孢子懸浮液接種至枝孢霉發(fā)酵培養(yǎng) 基，于 28°C、200rpm，培養(yǎng) 110h。
[0100] 取枝孢霉WBRD00050發(fā)酵培養(yǎng)液于12000g離心10min，收集獲得離心清液約 400ml，檢測離心清液的磷脂酶C酶活，結(jié)果顯示離心清液的磷脂酶C的酶活約為0. 042u/ ml〇
[0101] (2)枝孢霉磷脂酶C粗酶液的濃縮
[0102] 按廠商提供的方法，采用10kDa的膜（Omega，美國PALL公司）對離心清液進(jìn)行超 濾濃縮，獲得濃縮酶液約40ml。檢測濃縮后的枝孢霉磷脂酶C酶活，結(jié)果顯示，濃縮后的枝 孢霉芽孢桿菌磷脂酶C酶活約為0. 34u/ml。
[0103] (3)枝孢霉WBRD00050胞外磷脂酶C的鑒定
[0104] 用枝孢霉WBRD00050所產(chǎn)的胞外磷脂酶水解磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine, PC)，酶液用量0? 5ml，pH值8. 0的Tris-HCL緩沖液2. 0ml，2%磷脂酰膽堿2. 5ml(購自阿 拉丁試劑有限公司，純度超過98%)，150rpm、37°C水浴振蕩反應(yīng)24小時。反應(yīng)結(jié)束后，取 樣lml，等體積加入正己烷萃取，振蕩混勻，12000rpm離心2分鐘，取出上層有機(jī)相部分，加 入至一新管中。此操作進(jìn)行兩次，收集兩次的正己烷萃取液，開蓋，置于通風(fēng)櫥中將有機(jī)相 揮發(fā)完全。而后每管中加15ul異丙醇，充份溶解。取5ul點(diǎn)薄層板。TLC檢測結(jié)果如圖2 所示，結(jié)果顯示水解產(chǎn)物中出現(xiàn)大量甘油二酯，由此判定該酶為磷脂酶C。
[0105] 實(shí)施例3 :枝孢霉磷脂酶C催化水解大豆混合磷脂
[0106] 配制2%的大豆混合磷脂(購自北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司，總磷脂含量不低于 95%)的水溶液，分裝兩管，每管4. 45ml并標(biāo)記為甲管和乙管，其中甲管為對照樣，乙管為酶 作用樣。
[0107] 分別往甲乙兩管中加入0. 05ml的250mM的CoC12水溶液，混合均勻。往甲管中 加入0.5ml的蒸餾水，往乙管中加入0.5ml的實(shí)施例2所制備的磷脂酶C濃縮酶液。充 分混勻后于40°C水浴反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，分別加入等體積的氯仿進(jìn)行萃取，離心，取 甲乙兩管的下層有機(jī)相各約3ml置于通風(fēng)櫥中進(jìn)行風(fēng)干，而后用31P-NMR的方法（Glonek T. 31PNuclearMagneticResonancePhospholipidAnalysisofAnionic-Enriched Lecithins.JA0CS. 1998, 75 (5):569-573)來檢測其中的磷脂組成情況，混合磷脂對照樣結(jié) 果見圖3,枝孢霉磷脂酶C的水解樣品結(jié)果見圖4。
[0108] 結(jié)果顯示，與對照樣品相比，經(jīng)過磷脂酶C催化后，大豆混合磷脂中幾乎所有的磷 脂均被水解去除。因此，本發(fā)明所提供的磷脂酶C是一種對多種磷脂底物都能起作用的磷 脂酶C。
[0109] 實(shí)施例4 :枝孢霉WBRD00050所產(chǎn)胞外磷脂酶C的部分酶學(xué)性質(zhì)
[0110] (1)枝孢霉胞外磷脂酶C的最適作用溫度
[0111] 分別在01：、101：、201：、251：、301：、351：、401：、451：、501：、551：和601：水浴溫度 下測定實(shí)施例2濃縮制備所得的枝孢霉磷脂酶C的酶活。以最高PLC酶活的溫度點(diǎn)的PLC 酶活作為100%酶活，其它溫度點(diǎn)的PLC酶活除以該最高酶活，從而得到該溫度點(diǎn)的相對酶 活，以相對酶活為縱坐標(biāo)，溫度點(diǎn)為橫坐標(biāo)，以平滑曲線依次連接各溫度點(diǎn)的相對酶活，結(jié) 果見圖5。
[0112] 圖5結(jié)果顯示，WBRD00050發(fā)酵粗酶液PLC酶活的最適反應(yīng)溫度為4