一種融合多肽及其制備方法和應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種融合多肽，同時(shí)還涉及該融合多肽的制備方法和應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]棉鈴蟲，夜蛾科鈴夜蛾屬昆蟲的一種，是棉花蕾鈴期的大害蟲，廣泛分布在世界各地，中國棉區(qū)和蔬菜種植區(qū)均有發(fā)生，主要蛀食蕾、花、鈴和嫩葉。棉鈴蟲天敵很多，有寄生性天敵一寄生蜂、寄生蠅等，捕食性天敵烏雀類及一些細(xì)菌、真菌、病毒等可對(duì)棉鈴蟲的卵和幼蟲起到抑制作用。[0003]利尿激肽helicokininI(HKI)對(duì)棉鈴蟲的水分代謝活動(dòng)刺激最為強(qiáng)烈（Seinscheetal.，2000)，在極微量的HKI注射進(jìn)入棉鈴蟲幼體后，即可使其過度排泄，進(jìn)而導(dǎo)致死亡，HKI作為殺蟲物質(zhì)進(jìn)行應(yīng)用的潛力巨大。由于其來源于生物體，對(duì)高等生物和環(huán)境安全，因此作為殺蟲物質(zhì)進(jìn)行應(yīng)用具有先天的環(huán)境優(yōu)勢。如何將HKI作為一種殺蟲活性物質(zhì)進(jìn)行使用，是否可以利用害蟲的取食行為將其攝入體內(nèi)發(fā)揮作用；如何使有活性的短肽分子穿透消化道進(jìn)入體內(nèi)位點(diǎn)，同時(shí)保證短肽在運(yùn)送過程中的穩(wěn)定，這是亟待解決的問題。【
發(fā)明內(nèi)容】[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的之一在于提供一種對(duì)棉鈴蟲具有強(qiáng)的毒殺活性的融合多肽。[0005]本發(fā)明的目的之二在于提供一種融合多肽的制備方法。[0006]同時(shí)，本發(fā)明還在于提供一種融合多肽的應(yīng)用。[0007]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：[0008]一種融合多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。具體為：甲硫氨酸-酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-脯氨酸-色氨酸-甘氨酸。[0009]所述融合多肽的N端乙?；0010]上述融合多肽的制備方法，包括以下操作步驟：[0011]1)以2-(lH-苯并三偶氮L-1-基）-1，1，3,3_四甲基脲四氟硼酸酯為縮合劑，以聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂為起始樹脂，采用FM0C固相合成法逐一耦合每一個(gè)保護(hù)氨基酸，合成得到全保護(hù)的肽鏈樹脂；[0012]2)制備的融合多肽N端進(jìn)行乙?；0013]3)用切割試劑對(duì)乙?；幚砗蟮臏y鏈全保護(hù)的肽鏈樹脂進(jìn)行切割，將肽鏈從樹脂上裂解下來并取出側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，得到多肽粗品；[0014]4)將步驟3)制備的多肽粗品經(jīng)冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，分離純化，冷凍干燥即得所述的融合多肽。[0015]步驟2)所述乙?；噭橐宜狒蚇-甲基咪唑的混合液。[0016]步驟3)中切割試劑為氟化氫、對(duì)甲苯酚、對(duì)疏基苯酚按照體積比90:5:5的比例配制而成的混合物。[0017]步驟3)中切割試劑的用量為10~15mL/g。[0018]上述融合多肽在制備防治棉鈴蟲藥物方面的應(yīng)用。[0019]TAT(transactivatoroftranscription，TAT)為病毒有效轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必須的多肽序列。TAT能夠?qū)⑴c之共價(jià)連接的生物大分子非特異地轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)部，這種過程既不依賴于受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也與溫度和能量無關(guān)，而且對(duì)宿主細(xì)胞幾乎沒有毒性。這種具有攜帶外源蛋白穿透細(xì)胞膜能力的特異多肽序列稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（ProteintransductionDomains，PTDs)，也稱細(xì)胞穿膜肽（cellpenetratingpeptides，CPP)。[0020]利尿多肽Helicokinin是屬于昆蟲激肽家族的一類小分子昆蟲神經(jīng)肽，整個(gè)家族成員都具有類似的碳末端五肽序列Phe-Tyr-Pr〇-Trp-Gly-NH2(FYPWGa)，這個(gè)核心5肽對(duì)于其刺激肌肉活動(dòng)和利尿活動(dòng)是必需的，研宄表明微量昆蟲激肽及其類似物可以對(duì)昆蟲生理代謝造成較大的影響（Smaggheetal.AntifeedantactivityandhighmortalityinthepeaaphidAcyrthosiphonpisum(Hemiptera:Aphidae)inducedbybiostableinsectkininanalogs，，2010;Nachmanetal.Nachmanetal.BiostableandPEGpolymer-conjugatedinsectpyrokininanalogsdemonstrateantifeedantactivityandinducehighmortalityinthepeaaphidAcyrthosiphonpisum(Hemiptera:Aphidae,2012)[0021]本發(fā)明融合多肽，在利尿多肽HKI的序列的C端連接蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT多肽序列，將HKI同蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域進(jìn)行融合表達(dá)，構(gòu)建TAT-HKI融合肽，借助TAT的高效跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使HKI快速地穿過食道系統(tǒng)內(nèi)膜進(jìn)入體內(nèi)位點(diǎn)，確保利尿多肽序列在體內(nèi)運(yùn)送過程中穩(wěn)定發(fā)揮作用，使融合多肽進(jìn)入棉鈴蟲體內(nèi)后，使棉鈴蟲過度排泄，導(dǎo)致死亡。本發(fā)明融合多肽可通過棉鈴蟲自然取食的行為進(jìn)入棉鈴蟲體內(nèi)，并在體內(nèi)高效穩(wěn)定的表達(dá)，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的毒殺活力，克服了HKI經(jīng)昆蟲消化道毒力差得缺陷。[0022]本發(fā)明融合多肽的制備方法采用FM0C法制備融合多肽，氨基酸接枝成功率高，操作簡便，易于實(shí)現(xiàn)，適于工業(yè)化推廣應(yīng)用。[0023]本發(fā)明融合多肽在棉鈴蟲體內(nèi)高效表達(dá)，表現(xiàn)出毒殺活性的特性，使其可用于制備防治棉鈴蟲的藥物?！揪唧w實(shí)施方式】[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。[0025]實(shí)施例1[0026]本實(shí)施例融合多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，具體為甲硫氨酸-酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-脯氨酸-色氨酸-甘氨酸。[0027]本實(shí)施例融合多肽N端乙?；?。[0028]本實(shí)施例融合多肽的制備方法，具體操作步驟為：[0029]1)以2-(lH_苯并三偶氮L-1-基）-1，1，3,3_四甲基脲四氟硼酸酯為縮合劑，以聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂為起始樹脂，采用FMOC固相合成法逐一耦合每一個(gè)保護(hù)氨基酸，合成得到全保護(hù)的肽鏈樹脂；[0030]2)用乙酸酐和N-甲基咪唑的混合液對(duì)步驟1)制備的全保護(hù)的肽鏈樹脂進(jìn)行乙?；幚?；[0031]3)用13mg/L切割試劑對(duì)乙?；幚砗蟮臏y鏈全保護(hù)的肽鏈樹脂進(jìn)行切割，將肽鏈從樹脂上裂解下來并取出側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，得到多肽粗品；所述切割試劑為氟化氫、對(duì)甲苯酚、對(duì)疏基苯酚按照體積比90:5:5的比例配制而成的混合物；[0032]4)將步驟3)制備的多肽粗品經(jīng)冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，分離純化，加入乙酸酐和N-甲基咪唑的混合液進(jìn)行乙酰化處理，冷凍干燥即得所述的融合多肽。[0033]性能檢測：實(shí)施例制備的融合多肽的毒力測定[0034]測定方法，具體操作步驟為：[0035]1)首先配制新鮮的棉鈴蟲人工飼料：將瓊脂8g煮沸融化，溫度低于90°C后依次加入無菌麥麩70g，干酵母10g，玉米油3ml，山梨醇lg，抗壞血酸15g，溶劑為水，邊加邊攪拌均勻；[0036]2)試驗(yàn)分為3組：融合多肽TAT-HKI試驗(yàn)組：將實(shí)施例制備的融合多肽TAT-HKI溶于無菌水中，待人工飼料溫度加熱至45°C時(shí)，加入TAT-HKI融合多肽攪拌均勻，作為融合多肽TAT-HKI試驗(yàn)組；利尿激肽HKI試驗(yàn)組：將HKI溶于無菌水中，待人工飼料溫度加熱至45°C時(shí)，加入HKI多肽攪拌均勻，作為HKI試驗(yàn)組；空白對(duì)照組：人工飼料中不添加任何添加劑；[0037]3)將步驟2)制備的3組飼料分別切成1cm3方塊，放入2.5X10cm平底試管中（棉塞封口），并接入正常的棉鈴蟲初孵化2齡初的幼蟲，每處理組接蟲200頭，每管1頭，置于培養(yǎng)箱中；處理后試蟲的飼養(yǎng)條件：溫度27±1°C，相對(duì)濕度65~70%，光照比（L:D)16:8h，每隔4天更換一次飼料，每隔4天觀察棉鈴蟲的存活狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)死亡率，判斷融合多肽的毒力；其中統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用DSP軟件進(jìn)行方差分析。[0038]棉鈴蟲存活狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)：以小毛筆輕觸蟲體，不能協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)認(rèn)為死亡。[0039]檢測結(jié)果如下表1所示：[0040]表1不同多肽的毒力檢測比較[0041]【主權(quán)項(xiàng)】1.一種融合多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.如權(quán)利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述融合多肽的N端乙?；?.-種如權(quán)利要求1所述的融合多肽的制備方法，其特征在于，包括以下操作步驟：1)以2-(1H-苯并三偶氮L-I-基）-1，1，3,3-四甲基脲四氟硼酸酯為縮合劑，以聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂為起始樹脂，采用FMOC固相合成法逐一耦合每一個(gè)保護(hù)氨基酸，合成得到全保護(hù)的肽鏈樹脂；2)將步驟1)制備的融合多肽N端進(jìn)行乙?；?)用切割試劑對(duì)乙?；幚砗蟮臏y鏈全保護(hù)的肽鏈樹脂進(jìn)行切割，將肽鏈從樹脂上裂解下來并取出側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，得到多肽粗品；4)將步驟3)制備的多肽粗品經(jīng)冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，分離純化，冷凍干燥即得所述的融合多肽。4.一種如權(quán)利要求1所述的融合多肽在制備防治棉鈴蟲藥物方面的應(yīng)用?！緦＠勘景l(fā)明公開了一種融合多肽及其制備方法和應(yīng)用，屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明融合多肽，在利尿多肽HKI的序列的C端連接蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT多肽序列，將HKI同蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域進(jìn)行融合表達(dá)，構(gòu)建TAT-HKI融合肽，借助TAT的高效跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使HKI快速地穿過食道系統(tǒng)內(nèi)膜進(jìn)入體內(nèi)位點(diǎn)，確保利尿多肽序列在體內(nèi)運(yùn)送過程中穩(wěn)定發(fā)揮作用，使棉鈴蟲過度排泄，導(dǎo)致死亡。本發(fā)明融合多肽可通過棉鈴蟲自然取食的行為進(jìn)入棉鈴蟲體內(nèi)，并在體內(nèi)高效穩(wěn)定的表達(dá)，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的毒殺活力，克服了HKI經(jīng)昆蟲消化道毒力差得缺陷，可用于制備防治棉鈴蟲的藥物?！綢PC分類】C07K19-00,C07K1-04,A01N47-44,A01P7-04,C07K1-06【公開號(hào)】CN104650242【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510017417【發(fā)明人】周洲,李永麗,崔林開,李紅英,源春彥,吳建【申請(qǐng)人】河南科技大學(xué)【公開日】2015年5月27日【申請(qǐng)日】2015年1月13日