1:0. 2-0. 6,例如可為 1:0. 2、1:0. 4 或 1:0. 6。
[0031] 其中，在步驟B1中，得到殘渣酶溶液后，調(diào)節(jié)該溶液的pH為6. 5-7. 5,例如可為 6. 5、7或7. 5,調(diào)節(jié)的手段例如可通過加入lmol/L的鹽酸水溶液或lmol/L的NaOH水溶液 來實現(xiàn)。
[0032] 其中，在步驟B1中，所述溫度T1為35-45°C，例如可為35°C、40°C或45°C;在該溫 度下酶解50-120分鐘，例如50分鐘、70分鐘、90分鐘、110分鐘或120分鐘。
[0033] 其中，在步驟B2中，所述溫度T2為60-75°C，例如可為60°C、65°C或70°C。
[0034] 其中，在步驟B2中，所述梯度升溫（即"將初次酶解液進行梯度升溫"中的"梯度 升溫"）為4-6°C /分鐘，優(yōu)選為5°C /分鐘。
[0035] 其中，在步驟B2中，所述木瓜蛋白酶與步驟B1中干燥殘渣的質(zhì)量比為 1:0. 008-0. 012,例如可為 1:0. 008、1:0. 01 或 1:0. 12。
[0036] 其中，步驟B2中的溫度T2與步驟B1中的溫度T1的差值應為21-29°C，即 21°C 彡 T2-T1 彡 29°C，優(yōu)選 T2-T1 = 25°C。
[0037] 在本發(fā)明的紅毛五加粗多糖的提取方法中，所述步驟C具體如下（也即步驟C包 括如下步驟）：
[0038] C1 :將步驟B2得到的二次酶解液過濾，將所得濾液濃縮至其體積的1/10-1/20,得 到濃縮液，然后離心，分離出上清液1 ;將上清液1再次離心，分離出上清液2 ;
[0039] C2 :將乙酸乙酯加入到上清液2中，充分振蕩、混合，靜置分層，分出水相。
[0040] 其中，在步驟C1中，將濾液濃縮至其體積的1/10-1/20,例如1/10、1/15或1/20。
[0041] 其中，在步驟C1中，"上清液1"和"上清液2 "中的數(shù)字" 1"和" 2 "只是對所得到 的不同上清液的指代，并無特定的具體含義。
[0042] 其中，在步驟C2中，乙酸乙酯與上清液2的體積比為1.5-3:1，例如可為1.5:1、 2:1、2. 5:1 或 3:1〇
[0043] 在本發(fā)明的紅毛五加粗多糖的提取方法中，所述步驟D具體如下（也即步驟D包 括如下步驟）：
[0044] D1 :向步驟C2得到的水相中加入無水乙醇，攪拌，靜置，過濾，得沉淀；
[0045] D2 :將沉淀充分干燥，用水復溶后，冷凍干燥，得到凍干粉，即紅毛五加粗多糖。
[0046] 其中，在步驟D1中，所述水相與無水乙醇的體積比為1:3-4,例如可為1:3、1:3. 5 或 1:4。
[0047] 其中，在步驟D2中，冷凍干燥的溫度為-30~-20°C，例如可為-30°C、-25°C 或-20°C。
[0048] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用上述方法得到的紅毛五加粗多糖，具有良好的收率和純度：其 收率要顯著高于現(xiàn)有技術(shù)中的收率，而且純度良好，從而為紅毛五加多糖的提取提供了一 種全新的方法，具有良好的研宄價值和應用潛力。
[0049] 第二個方面，本發(fā)明涉及一種紅毛五加多糖的提純方法，所述方法包括如下步 驟：
[0050] S1 :按照上述紅毛五加粗多糖的提取方法，即按照上述步驟A-D的提取方法，得到 紅毛五加粗多糖；
[0051] S2 :離子柱層析，得到離子柱層析液；
[0052] S3 :凝膠柱層析，后處理，得到提純后紅毛五加多糖。
[0053] 在本發(fā)明的紅毛五加多糖的提純方法中，所述步驟S2具體如下（也即步驟S2包 括如下步驟）：
[0054] S2-1 :將所述紅毛五加粗多糖（即步驟D2中得到的凍干粉）溶于Tris-HCl緩沖 溶液1中，得到上樣溶液；
[0055] S2-2 :將上樣溶液用規(guī)格為2. 6cmX60cm(即直徑2. 6cm，高度60cm)的 DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱進行層析分離，先用Tris-HCl緩沖溶液2洗脫，流速為 lml/分鐘，洗脫200-220分鐘，完成后再用含梯度濃度NaCl的Tris-HCl緩沖溶液3進行洗 脫，流速為2ml/分鐘，繼續(xù)洗脫260-300分鐘（即重新計時，不在Tris-HCl緩沖溶液2洗 脫的200-220分鐘內(nèi)），并收集第80-180分鐘內(nèi)（即為該次洗脫所用時間260-300分鐘的 第80-180分鐘內(nèi)）的洗脫液；將該洗脫液減壓濃縮至原體積的1/10-1/15,得到離子柱層 析液。
[0056] 其中，在步驟S2-1中，所述紅毛五加多糖凍干粉與Tris-HCl緩沖溶液1的質(zhì)量體 積比為1:80-120g/ml，即每lg紅毛五加多糖凍干粉溶于80-120ml所述Tris-HCl緩沖溶液 1 中，例如可為 l:80g/ml、l: 100g/ml 或 1:120g/ml。
[0057] 其中，在步驟S2-1和步驟S2-S2中，所述Tris-HCl緩沖溶液1、Tris-HCl緩沖溶 液2和Tris-HCl緩沖溶液3的濃度均為0. 05mol/L，pH值均為7. 3。
[0058] 其中，步驟S2-1中的所述紅毛五加多糖凍干粉與步驟S2-2中的Tris-HCl緩沖溶 液2 (即用來洗脫的Tris-HCl緩沖溶液）的質(zhì)量體積比為1:180-250g/ml，即相對于每lg紅 毛五加多糖凍干粉使用180-250ml所述Tris-HCl緩沖溶液2進行洗脫，例如可為1:180g/ ml、l:200g/ml、l:220g/ml、l:240g/ml 或 l:250g/ml。
[0059] 其中，在步驟S2-2中，所述"含NaCl的Tris-HCl緩沖溶液3"中的NaCl的梯度濃 度為從0線性增大至0. 8mol/L(具體可見附圖1，即圖1中的對應右縱坐標的斜直線）。
[0060] 其中，在步驟S2-1和S2-2中的"Tris-HCl緩沖溶液l"、"Tris-HCl緩沖溶液2" 和"Tris-HCl緩沖溶液3"中的數(shù)字和"3"只是對不同Tris-HCl緩沖溶液的指 代，并無特定的具體含義。
[0061] 在本發(fā)明的紅毛五加多糖的提純方法中，所述步驟S3具體如下（也即步驟S3包 括如下步驟）：
[0062] S3-1:將2ml步驟S2所得的離子柱層析液用規(guī)格為1. 6X60cm的Superdex 200pg 凝膠柱進行進一步純化，以0. 15mol/L的NaCl水溶液進行洗脫，流速為0. 3-0. 7ml/分鐘， 收集第110-140分鐘內(nèi)的洗脫液；
[0063] S3-2:向步驟S3-1得到的洗脫液濃縮至原體積的1/10-1/15,加入為其3-5倍體 積的無水乙醇，攪拌，靜置，過濾，得沉淀物，將沉淀物依次用氯仿和無水乙醇進行洗滌，真 空干燥完全，得到提純后紅毛五加多糖。
[0064] 其中，在步驟S3-2中，濃縮后洗脫液與無水乙醇的體積比為1:3-5,例如可為1:3、 1:4 或 1:5〇
[0065] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用上述提純方法得到的紅毛五加多糖為單一組分，不含蛋白、核 酸成分，經(jīng)過測定發(fā)現(xiàn)其相對分子質(zhì)量為80. 2kd，即為80200道爾頓。
[0066] 其中，純度鑒定方法如下：
[0067] 使用Silent 1100高效液相色譜，將所得的提純后紅毛五加多糖用0. 2mol/L的 NaCl水溶液配制成2mg/ml的溶液，流動相為0. 2mol/L的NaCl水溶液；工作條件：流速 0. 8ml/分鐘，柱溫箱溫度40°C，示差檢測器檢測溫度30°C，進樣量20 y