自體表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞同時制備方法及其生物美容產(chǎn)品的制作方法
【專利說明】自體表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞同時制備方法及其生物美容產(chǎn)口叩
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及自體表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞同時制備的方法以及通過所述方法獲得的生物美容產(chǎn)品。特別地，本發(fā)明涉及通過從自體皮膚中獲取表皮細(xì)胞和培養(yǎng)得到成纖維細(xì)胞，將其中一種或兩種細(xì)胞添加到自體外周血富含血小板的血漿中，同時還可以添加營養(yǎng)因子，生產(chǎn)出含自體活細(xì)胞的生物美容產(chǎn)品，本發(fā)明的生物美容產(chǎn)品可用于白癜風(fēng)祛斑、疤痕修復(fù)、皮膚祛皺以及除斑等美容作用。
【背景技術(shù)】
[0002]日前，市場上已經(jīng)出現(xiàn)了各種細(xì)胞用于美容方面的產(chǎn)品，也被商家賦予了各種神奇的功效和希望，尤其是干細(xì)胞在美容方面的應(yīng)用。事實上，活細(xì)胞在醫(yī)學(xué)美容的應(yīng)用上取得一些很好的效果，主要體現(xiàn)在皺紋填充、祛斑等方面起到一定作用。但是現(xiàn)在市場上應(yīng)用的活細(xì)胞多數(shù)都為同源異體的，進(jìn)入皮膚內(nèi)容易發(fā)生免疫排斥而被清除，因而在皮膚中發(fā)揮作用的細(xì)胞微乎其微。
[0003]細(xì)胞生長因子也是一直受追捧的美容方法，出現(xiàn)很多細(xì)胞生長因子被應(yīng)用到美容中，包括干細(xì)胞因子、表皮細(xì)胞生長因子、肝細(xì)胞生長因子、神經(jīng)生長因子及纖維母細(xì)胞生長因子等。各種細(xì)胞因子需要在低溫條件下保存，以保持其蛋白活性。然而在化妝品制作過程中，由于無法保證整個生產(chǎn)過程均處在低溫條件下，那么添加該產(chǎn)品極易造成細(xì)胞因子的失活和變性，從而失去細(xì)胞因子對組織和細(xì)胞的修復(fù)活性。同時，細(xì)胞因子加入到化妝品中，其有效濃度必然被降低，不能保證細(xì)胞因子對細(xì)胞核組織的修復(fù)效果。消費者在使用過程中很難對該產(chǎn)品進(jìn)行定量使用，可能會造成效果不穩(wěn)定的現(xiàn)象。
[0004]另外，羊胎素和肉毒桿菌內(nèi)毒素作為目前備受消費者青睞的產(chǎn)品，因其使用簡便、效果顯著、安全可靠而廣受歡迎。但它們使用后的副反應(yīng)較多，常見的有表情不自然、畏光流淚、局部腫脹、淤斑、注射部位麻木、頭痛、額部緊繃感、鄰近部位皺紋加深等。這兩種因子應(yīng)用易產(chǎn)生較明顯的依賴性，隨著注射的次數(shù)增多，人對其的敏感性降低，而導(dǎo)致病人使用該方法更為頻繁，每次的使用量也會逐漸增多。
[0005]綜上，因為各種原因和問題，目前市場上生物美容產(chǎn)品存在各種效果不佳，對人們的皮膚美容的療效還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，即使其中加入各種營養(yǎng)成分。本發(fā)明利用個體化的材料和營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)揮其細(xì)胞生物學(xué)活性和自分泌營養(yǎng)因子的功能，將對消費者的美容效果達(dá)到更佳的美容作用，并且聯(lián)合美容物理療法將產(chǎn)生更好的白癜風(fēng)祛斑、疤痕修復(fù)、皮膚祛皺以及除斑等效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明是我們研發(fā)團(tuán)隊通過多年的科研工作，發(fā)現(xiàn)了能從自體皮膚中獲得表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，通過體外體內(nèi)實驗證實這兩種細(xì)胞對皮膚產(chǎn)生更好地白癜風(fēng)祛斑、疤痕修復(fù)、皮膚祛皺以及除斑等作用。本發(fā)明利用自體皮膚來源的表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生物學(xué)作用，可以高效產(chǎn)生皮膚美容作用，而且聯(lián)合美容物理療法將產(chǎn)生更好功效。本發(fā)明中的表皮細(xì)胞是成對存在，中間的孔隙中氣孔，可以進(jìn)行氣體交換，細(xì)胞內(nèi)有葉綠體，對皮膚起重要保護(hù)作用。
[0007]本發(fā)明中成纖維細(xì)胞是皮膚真皮中的主體細(xì)胞成分，其分泌的膠原纖維，彈性纖維及基質(zhì)成分，與成纖維細(xì)胞一同構(gòu)成了真皮的主體。盡管很多化妝品公司和美容醫(yī)生聲稱非介入的美容方法能達(dá)到使皮膚皺紋消失的效果，但科學(xué)研宄表示這一方法的效果是有限的。皮膚衰老反映在細(xì)胞水平即為細(xì)胞衰老。當(dāng)紫外線和其他外界環(huán)境能刺激成纖維母細(xì)胞，上調(diào)膠原酶的基因表達(dá)，從而使膠原酶生成增多，這導(dǎo)致了膠原蛋白被降解，水分流失，皮膚組織失去支撐，皺紋和黃斑即生成。
[0008]本發(fā)明提供了自體表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞同時制備的方法，其中，所述方法包括通過從自體皮膚中獲取表皮細(xì)胞和培養(yǎng)得到成纖維細(xì)胞。
[0009]本發(fā)明所述的自體表皮細(xì)胞由自體皮膚經(jīng)酶消化法和機(jī)械法直接獲得表皮單細(xì)胞懸液，減去了中間復(fù)雜的過程，并保證了表皮細(xì)胞的活性和數(shù)量。獲得的表皮細(xì)胞經(jīng)western blotting蛋白質(zhì)表達(dá)檢測，其高表達(dá)特異高表達(dá)表皮生長因子(Epidermalgrowth factor, EGF)。
[0010]同時，本發(fā)明所述的自體成纖維細(xì)胞由同一皮膚的真皮經(jīng)酶消化法和機(jī)械法獲得細(xì)胞懸液后，在體外培養(yǎng)條件下獲得足量的成纖維細(xì)胞，并western blotting蛋白質(zhì)表達(dá)檢測特異高表達(dá)成纖維生長因子(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)。
[0011]本發(fā)明所述的自體皮膚來源于耳后取皮、眼袋割除后皮膚、手臂取皮和腿上取皮等，優(yōu)選地，選擇耳后取皮。
[0012]本發(fā)明還提供了含自體表皮細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的生物美容產(chǎn)品，其中，所述產(chǎn)品包括將其中一種或兩種細(xì)胞添加到自體外周血富含血小板的血漿中，同時可以添加營養(yǎng)因子，生產(chǎn)出含自體活細(xì)胞的生物美容產(chǎn)品。
[0013]本發(fā)明所述的自體富含血小板血漿是通過采集抗凝外周血兩次離心獲得的富含血小板的血漿，其富含各種生長因子，其中成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、血小板衍生生長因子與血管內(nèi)皮生長因子等。
[0014]含自體表皮細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的生物美容產(chǎn)品主要由如下成分組成:
[0015]I) 1-20 X 16自體表皮細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞；
[0016]2) l_50ml自體富含血小板血漿；
[0017]3)任選的1ng-1ug營養(yǎng)因子；
[0018]生物美容制劑裝入1ml無菌的塑料針管中，可用蓋子密封包裝，形成產(chǎn)品。
[0019]該生物美容制劑保存在4°C條件下，保質(zhì)期為48小時。
[0020]本發(fā)明所述的一種或兩種自體表皮細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞，優(yōu)選地包括加入自體表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞兩種細(xì)胞。
[0021]本發(fā)明所述的營養(yǎng)因子，即為超氧化歧化酶、靈芝多糖、胎盤提取多肽素和銀杏葉提取液等，優(yōu)選地，含有兩種以上。
[0022]通過本發(fā)明的方法，通過自體皮膚獲取的表皮細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞，加入到自體外周血來源的富含血小板血漿，優(yōu)選添加一種或多種皮膚營養(yǎng)因子，制備成生物美容產(chǎn)品。由本發(fā)明提供的方法得到含有自體皮膚獲取的表皮細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的生物美容產(chǎn)品，能夠?qū)Π遵帮L(fēng)祛斑、皮膚疤痕修復(fù)、皮膚祛皺以及除斑等功能。特別當(dāng)聯(lián)合物理美容療法使用時，將產(chǎn)生更佳的美容療效，即白癜風(fēng)磨削術(shù)、高溫深藍(lán)射頻美容療法、微針療法等，能打開表皮毛孔或微創(chuàng)表皮皮層，為營養(yǎng)因子和細(xì)胞進(jìn)入皮膚的通道，有助于皮膚的再生增殖。
【附圖說明】
[0023]圖1表示由實施例2所制備的成纖維細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察的生長圖片。
[0024]圖2表示由實施例3制備的自體成纖維細(xì)胞表達(dá)成纖維細(xì)胞生長因子WesternBlotting 圖片。
[0025]圖3表示I名女性經(jīng)由實施例5所制備的自體表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生物美容廣品治療后腿部白癒風(fēng)改善的圖片。
【具體實施方式】
[0026]本發(fā)明提供了自體表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞同時制備的方法，其中，所述方法包括通過從自體皮膚中獲取表皮細(xì)胞和培養(yǎng)得到成纖維細(xì)胞。
[0027]所述自體表皮細(xì)胞由取人0.l-2cm2皮膚，用IX磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4，含100活性單位/ml青霉素和0.lmg/ml鏈霉素)5ml浸潤15分鐘，用Iml移液槍吸棄，再用I XPBS (pH值7.4，含100活性單位/ml青霉素和0.lmg/ml鏈霉素)同樣反復(fù)中洗，洗滌后用disperse II消化，放置4°C冰箱過夜，第二天取出皮膚用鑷子將表皮和真皮撕開。
[0028]表皮用眼科剪刀剪碎至Imm3左右，用I XPBS洗滌后加入到15ml離心管中，1000轉(zhuǎn)每分種離心5分鐘后棄上清，加入3ml 0.25% (質(zhì)量體積比)胰酶消化1_60分鐘，其中胰酶含質(zhì)量體積比0.01% EDTA ;消化后過40 μπι細(xì)胞篩，過濾后加入5-10ml 1XPBS，經(jīng)1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘得到細(xì)胞沉淀，再次5-15ml IXPBS重懸后，經(jīng)1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘獲得表皮細(xì)胞沉淀，加l_5ml 0.9%生理鹽水重懸，苔盤蘭計數(shù)，得到的17-1O8表皮細(xì)胞放置4°C冰箱存放備用。獲得的表皮細(xì)胞經(jīng)western blotting蛋白質(zhì)檢測表皮細(xì)胞生長因子表達(dá)水平，經(jīng)灰度分析結(jié)果顯示其灰度值達(dá)到9000以上。
[0029]獲得的表皮細(xì)胞經(jīng)western blotting蛋白質(zhì)檢測，其高表達(dá)表皮細(xì)胞生長因子。本發(fā)明的制造方法中對表皮細(xì)胞進(jìn)行凍存，凍存液優(yōu)選為90%胎牛血清和10%二甲基亞砜。復(fù)蘇后培養(yǎng)的表皮細(xì)胞仍高表達(dá)EGF。
[0030]所述自體成纖維細(xì)胞由上述獲得真皮用眼科剪刀剪碎至Imm3左右，用IXPBS洗滌后加入到15ml離心管中，1000轉(zhuǎn)每分種離心5分鐘后棄上清，加入3ml 0.25%胰酶消化1-60分鐘，消化后過40 μπι細(xì)胞篩，過濾后加入5-10mllXPBS，經(jīng)1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘得到單