一種基于磁珠法快速提取革蘭氏陽性菌基因組dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于磁珠法快速提取革蘭氏陽性菌基因 組DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 革蘭氏陽性菌是能夠用革蘭氏染色染成深藍或紫色的細菌，而革蘭氏陰性菌不 能被染色（但會涂成紅色以對比）。革蘭氏陽性菌細胞壁中含有較大量的肽聚糖，但經(jīng)常 缺乏革蘭氏陰性菌所擁有的第二層膜和脂多糖層。革蘭氏陽性細菌的細胞壁較厚（20? 80nm)，主要是由肽聚糖和磷壁酸組成的，僅有一層結(jié)構(gòu)，主要成分為肽聚糖，占細胞壁干重 的50%?90%。在染色過程中，當用乙醇處理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小， 通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍紫色
[0003] 現(xiàn)在，人們開始對革蘭氏陽性菌進行快速檢測技術(shù)的研宄以及各種生物學特征的 研宄，目前研宄主要集中在毒力調(diào)控機制、超抗原作用機制、耐藥性、菌膜形成與感染等方 面，然而這些研宄的基礎(chǔ)是進行基因組DNA的提取。因為革蘭氏陽性菌其細胞壁較厚，基因 組DNA提取難度較大，費時較長。
[0004] 有效的提取革蘭氏陽性菌基因組DNA，能夠為進行基因分析與基因克隆提供重要 保證，從而豐富基因組學的研宄內(nèi)容。因此，研制一種適用于革蘭氏陽性菌基因組DNA提取 的，方便、快捷、實用的方法，解決使用常規(guī)方法提取革蘭氏陽性菌基因組DNA樣品所需提 取時間長的問題，意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種方便、快捷、實用的基于磁珠法快速提取革蘭氏陽性 菌基因組DNA的方法，解決使用常規(guī)方法提取革蘭氏陽性菌基因組DNA所需提取時間長的 問題。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 一種基于磁珠法快速提取革蘭氏陽性菌基因組DNA的方法，包括革蘭氏陽性菌細 胞的破碎，DNA的游離與雜蛋白的抽除，磁珠法快速純化基因組DNA，所述方法具體包括以 下步驟：
[0008] 1)革蘭氏陽性菌細胞的破碎：取3ml革蘭氏陽性菌過夜培養(yǎng)液到離心管中， 10000_13000rpm/min離心l_5min后棄上清，往菌體沉淀中加入0. 2-0. 5ml雙蒸水懸浮 沉淀，并加入50-80 μ 1工作液A，于40°C保溫10_50min，然后加入30-60 μ 1工作液B和 5-10 μ 1工作液C，混合均勻后于37°C保溫30-60min，然后加入0. 4-0. 6ml工作液D，混合均 勻；
[0009] 2)DNA的游離與雜蛋白的抽除：在步驟1)得到的混合液中加入200-600 μ 1工作 液E抽提，然后10000-13000rpm/min離心10_30min，取一次上清液至滅菌的I. 5ml離心管 中，加入200-600 μ 1工作液F抽提，然后10000-13000rpm/min離心10-30min，取二次上清 液至無菌的I. 5ml離心管中；
[0010] 3)磁珠法快速純化基因組DNA :往含有二次上清液的離心管中加入與二次上清液 等體積的工作液G，震蕩10-30s后，室溫放置Ι-lOmin，然后將離心管放在磁力架上，進行磁 珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時吸去液體，保留磁珠，然后往含有磁珠的離心管中加入 0. 5-1. 5ml工作液H，打勻后室溫靜置5-10min，然后將離心管放在磁力架上，進行磁珠分 離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時吸去液體，吸去液體，保留磁珠，然后往含有磁珠的離心管 中加入30-60 μ 1工作液I，將離心管放在磁力架上，進行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一 側(cè)時吸取液體，此液體即為革蘭氏陽性菌基因組DNA ;后續(xù)于1 %瓊脂糖凝膠中電泳檢測；
[0011] 所述工作液A為10-50mg/ml溶菌酶；
[0012] 所述工作液B為質(zhì)量濃度10-20 %十二烷基硫酸鈉（SDS);
[0013] 所述工作液C為20-50mg/ml蛋白酶K ;
[0014] 所述工作液D為4-6mol/L氯化鈉（Nacl);
[0015] 所述工作液E是體積比為酷：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液；
[0016] 所述工作液F是體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液；
[0017] 所述工作液G是體積比為異丙醇：磁珠混懸液=24:1的混懸液，所述磁珠混懸液 由磁珠和水按照體積比1:2混合配置而成，所述磁珠為硅基生物磁珠，粒徑為lum，購買自 溫州安科納米科技有限公司，產(chǎn)品編號：AK1-G1000 ;
[0018] 所述工作液H由終濃度4. 3-21. 4mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris),終濃度 2. 1-4. 2mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)，終濃度42. 9-85. 7mmol/L Nacl和體積終濃度 60-80 %無水乙醇組成；
[0019] 所述工作液I為5-10mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris)，pH = 7. 0-9. 0。
[0020] 本發(fā)明所述終濃度是指溶液在工作液中的終濃度，例如所述工作液H由終濃度 4. 3-21. 4mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris),終濃度2. 1-4. 2mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)， 終濃度42. 9-85. 7mmol/L NaCl和體積終濃度60-80%無水乙醇組成，是指Tris在工作液H 中的濃度為4. 3-21. 4mmol/L，EDTA在工作液H中的濃度為2. 1-4. 2mmol/L，NaCl在工作液 H中的濃度為42. 9-85. 7mmol/L，無水乙醇在工作液H中的體積終濃度為60-80%。
[0021] 進一步，所述工作液A為20mg/ml溶菌酶。
[0022] 進一步，所述工作液B為質(zhì)量濃度10 %十二烷基硫酸鈉。
[0023] 進一步，所述工作液C為20mg/ml蛋白酶K。
[0024] 進一步，所述工作液H由終濃度8. 6mmol/L三羥甲基氨基甲烷Tris,終濃度 3. 4mmol/L乙二胺四乙酸，終濃度60mmol/L Nacl和體積終濃度70%無水乙醇組成。
[0025] 進一步，所述工作液I為8mmol/L三輕甲基氨基甲燒，pH = 8. 0。
[0026] 本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，使用工作液E以及工作液F去除細胞溶液中的蛋白等 雜質(zhì)，以獲得純度較高的革蘭氏陽性菌基因組DNA。常規(guī)的革蘭氏陽性菌基因組DNA提取 方法主要是利用無水乙醇低溫沉淀基因組，往往需要耗時IOh以上，而本發(fā)明基于磁珠法 提取革蘭氏陽性菌基因組DNA，硅基磁珠表面固定有親水性陰離子交換劑，可以特異的吸 附帶負電的基因組DNA分子，而對其他生物材料基本不吸附，磁珠具有磁性，可以被磁鐵吸 附，通過磁力架可以將附有基因組DNA的磁珠吸附在離心管壁上，可以保障最大程度地回 收樣品中的核酸，同時去除其他雜質(zhì)，整個提取過程僅需要不到2h的時間即可實現(xiàn)。
[0027] 與常規(guī)的革蘭氏陽性菌基因組DNA提取方法相比，本發(fā)明不僅節(jié)省了大量提取時 間，同時簡化了實驗步驟，能夠更有效、快速、經(jīng)濟地提取到革蘭氏陽性菌基因組DNA。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明方法提取的革蘭氏陽性菌基因組DNA的電泳檢測圖：泳道1，2,3分 別是提取的葡萄球菌，鏈球菌，放線菌基因組DNA ;泳道4為TAKARA公司的DL4500Marker。
【具體實施方式】
[0029] 一種基于磁珠法快速提取革蘭氏陽性菌基因組DNA的方法，包括革蘭氏陽性菌細 胞的破碎，DNA的游離與雜蛋白的抽除，磁珠法快速純化基因組DNA，所述方法具體包括以 下步驟：
[0030] 1)革蘭氏陽性菌細胞的破碎：取3ml革蘭氏陽性菌過夜培養(yǎng)液到離心管中，每 次10000-13000rpm/min離心l_5min后棄上清，往菌體沉淀中加入0. 2-0. 5ml雙蒸水懸浮 沉淀，并加入50-80 μ 1工作液A，于40°C保溫10_50min，然后加入30-60 μ 1工作液B和 5-10 μ 1工作液C，混合均勻后于37°C保溫30-60min，然后加入0. 4-0. 6ml工作液D，混合均 勻；
[0031] 2)DNA的游離與雜蛋白的抽除：在步驟1)得到的混合液中加入200-600 μ 1工作 液E抽提，然后10000