專利名稱：抗血栓劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及阻止血栓發(fā)展或促進其溶解的抗血栓劑。
背景技術(shù)：
血栓癥是本來必須在血管內(nèi)保持流動性的血液因血小板等凝血、纖溶系統(tǒng)平衡失調(diào)引起的在機體血管內(nèi)凝固的疾病。血栓在心臟冠脈內(nèi)形成則引起心肌梗塞，在下肢靜脈系等處形成則發(fā)生深部靜脈血栓癥。在重度感染和腫瘤等的影響下，凝血系統(tǒng)被異常激活，全身微血管內(nèi)廣泛發(fā)生血栓，則出現(xiàn)稱作彌漫性血管內(nèi)凝血綜合征(以下稱作DIC)的病狀。其中，因重度感染等引起的DIC每每并發(fā)多臟器功能不全，預(yù)后極嚴重。這樣，血栓癥因發(fā)病部位不同而有極其不同的病癥，因而開發(fā)了各種各樣的治療方法。在藥物方面，對心肌梗塞和深部靜脈血栓等，可用尿激酶、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(以下稱作t-PA)或肝素等，對于DIC，仍然可用肝素。然而，尿激酶存在所謂對纖維蛋白親和性低的問題，而t-PA則價格高、半衰期極短，或在經(jīng)皮冠脈內(nèi)血栓溶解療法和未梢靜脈內(nèi)直接投與t-PA的再開通療法上存在易發(fā)生再閉塞等問題。還有為使肝素的藥效得到發(fā)揮，抗凝血酶原III必須達到一定濃度等問題。而且，所用的這樣的藥物的共同之處在于引起嚴重出血的副作用。為了解決此問題，也已開發(fā)了合成抗蛋白酶藥物，但未完全解決出血的副作用，卻仍保留了半衰期極短等問題。
關(guān)于硫酸皮膚素，以往報告了肝素輔因子-II介導(dǎo)的抗凝血活性，而在纖溶活性上，硫酸皮膚素有促進t-PA游離的報告(Abbadi—ni M.et al.，Blood 1987，70，1858—1860)，硫酸皮膚素也有不影響t-PA量和纖溶活性的報告(Tripodi A.et al.，Thromb Res.1991 62，663—672)，但對纖溶系統(tǒng)的影響并不明了。
迄今，各種實驗中使用或在作為醫(yī)藥開發(fā)中的硫酸皮膚素是從豬或牛的腸或皮膚而來的(Fareed J.et al.Recent Advances inBlood Coagulation，1993，6，169—187)，關(guān)于其他來源的硫酸皮膚素的活性則一無所知。
發(fā)明的描述本發(fā)明者們研究了硫酸皮膚素對纖溶系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)硫酸皮膚素具有比該化合物不存在時增強血栓溶解的作用。本發(fā)明者們還發(fā)現(xiàn)，在給予機體后，可從抗凝和纖溶活性兩方面均起作用來考慮抗血栓作用。即，對于抑制血栓形成，促進溶解作用等的綜合作用，硫酸皮膚素中極限粘度為0.8 100ml/g以上的特定的硫酸皮膚素，或從雞冠而來的特定的硫酸皮膚素，或構(gòu)成二糖組成中ΔDi-OS為2％以上7％以下的特定的硫酸皮膚素、或用下面的測定法得到的平均分子量為2.5萬道爾頓以上10萬道爾頓以下的硫酸皮膚素，或特別是上述硫酸皮膚素中那些肝素或硫酸乙酰肝素含量極低的特定的硫酸皮膚素，作用極強，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及的上述硫酸皮膚素為有效成份的抗血栓劑，或硫酸皮膚素與組織血纖維蛋白溶酶原激活劑合用的抗血栓劑。
硫酸皮膚素以N-乙酰基-D-半乳糖胺-4-硫酸與由L-艾杜糖醛酸組成的二糖的重復(fù)結(jié)構(gòu)為主，也含少量D-葡糖醛酸，硫酸含量、硫酸等的結(jié)合位置、D-葡糖醛酸含量等因動物品種和臟器而異。
硫酸皮膚素通常從牛、豬等哺乳動物腸粘膜、皮膚或雞冠等生物原料制成。
本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，從這些原料得到的硫酸皮膚素或其藥理上可容許的鹽，與其不存在時相比，提高了單鏈或雙鏈t-PA的血纖維蛋白溶酶原激活作用。而且，在體內(nèi)投與時，本發(fā)明的特定硫酸皮膚素，即極限粘度為0.8 100ml/g以上，較佳者為0.9—2.0 100ml/g的硫酸皮膚素，或得自雞冠的硫酸皮膚素，或構(gòu)成二糖組成中ΔDi-OS為2％以上7％以下，較佳者為3％以上6％以下的硫酸皮膚素，或后述Biochim.Biophys.Acta，1117，60—70，1992上記載的用凝膠過濾法測得平均分子量為2.5萬以上10萬以下道爾頓，較佳者為3萬以上6萬以下道爾頓的硫酸皮膚素，或特別是上述硫酸皮膚素中那些肝素或硫酸乙酰肝素含量極低的特定的硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上可容許的鹽，與其他硫酸皮膚素相比，血中維持時間長，不僅纖溶活性，還有抗凝血作用，相加起來在總的抗血栓作用上顯示出有效的藥理效應(yīng)。
硫酸皮膚素的藥理學(xué)上容許的鹽有鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、鈣鹽等，而通常以鈉鹽的形式給藥。t-PA無論內(nèi)因性或外因性、單鏈或雙鏈、特別無論是天然型或基因重組型，均可。而且，無論其一部分氨基酸缺乏或添加氨基酸，只要具有血纖維蛋白溶酶原激活作用即可(參見EP-A-112122)。
硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽(以下也稱作DS)單獨單次給藥或單獨連續(xù)給藥都顯示其藥理活性。給藥途徑，靜脈內(nèi)注射，動脈內(nèi)注射，冠脈內(nèi)注射均好，也可皮下注射和肌肉注射等。在將DS與t-PA合用時，可將DS與t-PA以同一途徑同時給藥，也可分別給藥。
在DS血濃度與t-PA血濃度可預(yù)期達到有效濃度以上時，除上述冠脈內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥之外，也可進行皮下給藥等。
在配制這些制劑時，可適當(dāng)使用醫(yī)藥上容許的穩(wěn)定劑、乳化劑或滲透壓調(diào)節(jié)劑，pH調(diào)節(jié)劑等輔助劑。
給藥量，在對成人單獨使用DS時，一日總量為50—3000mg，將其與t-PA合用時，可使用DS 50—3000mg、t-PA 10000—500000 I.U.(國際單位)。它們的有效成份可一日單次或隔適當(dāng)?shù)拈g隔分成2次至數(shù)次給藥。也可歷時數(shù)日連續(xù)靜注。
如上所述，DS或其藥理學(xué)上容許的鹽激活纖溶活性，可作為有用的血栓溶解促進劑加以利用。特別是本發(fā)明的特定的DS，即極限粘度為0.8 100ml/g以上2.0 100ml/g以下的DS，或來自雞冠的DS，或構(gòu)成二糖組成中ΔDi-OS為2％以上7％以下的DS，或以后面所述測定法測得平均分子量為2.5萬以上10萬以下道爾頓的DS，或上述DS中那些肝素或硫酸乙酰肝素含量極低的特定的DS或其藥理學(xué)上容許的鹽，其效果顯著。而極限粘度超過2.0 100ml/g，平均分子量大于10萬道爾頓的DS，在以特別高濃度使用時，粘稠度增高，恐有使血液流動變差之虞，故不理想。此外，若上述DS或藥理學(xué)上容許的鹽與t-PA合用，則能顯著提高溶解血栓的作用，可使t-PA的用量減少，作為有用的血栓溶解劑，可用于血栓癥的治療和預(yù)防。
特別是，上述本發(fā)明的特定的DS或其藥理學(xué)上容許的鹽等向生物體內(nèi)投與時，與其他DS或其藥理學(xué)上容許的鹽相比，有效血濃度維持時間長，顯示預(yù)防血栓發(fā)展、抑制其生成或促進溶解的效應(yīng)，對彌漫性血管內(nèi)凝血綜合征，多發(fā)性血栓所伴有的多臟器功能不全、深部靜脈血栓癥等能發(fā)揮優(yōu)良的效果。該效果不僅在上述疾患，而且在不論是動脈系、毛細血管系、靜脈系一切類型的血栓病上發(fā)揮出來，除了可用于治療、預(yù)防外，還可在用于腎透析等體外循環(huán)時為了防止血液凝固的目的而加以使用。
除去了DS中混有的肝素(以下稱作Hep)或硫酸乙酰肝素(以下稱作HS)的DS(以下稱作DS-H(—))作為注射劑在血管內(nèi)或皮下或肌肉進行注射時，更能抑制出血等副作用的出現(xiàn)。特別是將DS-H(—)給血小板、凝血因子低下、具有出血傾向的患者投藥時，出血等副作用的出現(xiàn)較低，安全性高。
附圖簡述

圖1表示大鼠被投予來自雞冠的硫酸皮膚素鈉鹽(見參考例1)(RCDS)與來自小腸的硫酸皮膚素鈉鹽(見參考例2)(BIDS)后硫酸皮膚素鈉鹽的血中持續(xù)時間(見實施例1)。
●為投予BIDS，○為投予RCDS，▲為投予BIDS-H(—)，□為投予RCDS-H(—)，X表示●○▲□重迭。
圖2表示BIDS對單鏈組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(sc-tPA)激活血纖維蛋白溶酶原的促進作用，以促進率表示。
圖3表示BIDS對雙鏈組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(tc-tPA)激活血纖維蛋白溶酶原的促進作用，以促進率表示。
圖4為以促進率表示的RCDS對SC-tPA激活血纖維蛋白溶酶原的促進作用。
圖5為以促進率表示的RCDS對tc-tPA激活血纖維蛋白溶酶原的促進作用。
圖6表示BIDS對血漿塊的溶解促進作用。
實施發(fā)明的最佳情況下面列舉參考例和實施例對本發(fā)明作具體的說明。
參考例1(1)從雞冠制備DS將1kg雞冠切碎后煮沸，在殘渣中加入5g鏈霉蛋白酶(科研制藥公司，商品名プロナ—ゼ)，50℃消化12小時。將消化液經(jīng)硅藻土過濾，將濾液的pH調(diào)節(jié)至pH5.8—6.3，加入來自鏈霉菌屬的透明質(zhì)酸酶(生化學(xué)工業(yè)公司)1000TRU，50℃消化3小時。在消化液中添加食鹽，調(diào)整為0.65M，加到用0.5M食鹽溶液平衡過的DiaionHPA-10(三菱化成工業(yè)公司，商品名)陰離子交換樹脂柱(3×20cm)上。依次用0.65M食鹽溶液0.5升和1.1M食鹽溶液0.3升洗凈柱后，收集用1.8M食鹽溶液洗脫的部分，減壓濃縮。濃縮液用蒸餾水透析一夜，濃縮成10ml后，加5M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)終濃度至0.5M。將此堿溶液37℃保溫90分鐘后，冷卻，加醋酸中和。在中和液中加入2倍量乙醇，生成的沉淀依次用70％乙醇、純乙醇和乙醚洗凈后，在五氧化二磷存在下減壓干燥。
將5g干燥物在125ml水中放置一夜后，離心(10℃，10000rpm，15分鐘)除去少量不溶物。加入10％乙酸鈉水溶液125ml，在冰浴中加乙醇使終濃度為45％。于4℃放置20小時后離心，以90％乙醇、純乙醇和乙醚依次洗凈沉淀，在五氧化二磷存在下減壓干燥，得DS鈉鹽精制品(以下稱作RCDS)。
從雞冠分離精制硫酸皮膚素，不受上述方法所限定，也可按特公昭60-9042、特公昭61-21241來進行。
(2)從DS去除肝素(Hep)和硫酸乙酰肝素(HS)DS中微量混入的Hep和HS的去除按以下方法之一進行。
1)離子交換色譜法將(1)中所得的RCDS 50g加在用1.1M NaCl進行平衡后的Diaion HPA11(三菱化成工業(yè)公司，商品名)陰離子交換樹脂柱(4.5×27cm)上，用1.1M NaCl 8升洗凈后，收集用1.5M NaCl 8升洗脫的部分，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器濃縮后，透析，以42％乙醇使其沉淀，冷凍干燥，得到除去Hep和HS的RCDS樣品(RCDS-H(—))。
2)亞硝酸分解法按Shively和Conrad的方法(Biochemistry 15，3932—3942，1976)進行。即在-10℃下將亞硝酸鋇·一水合物0.124mg/ml，400ml與1N硫酸400ml混合，3000rpm離心2分鐘后，取上清液500ml。在0.1mg/ml濃度的RCDS500ml中加入上述上清液500ml，混合，室溫下放置10分鐘。在其中加入適量碳酸鈉溶液進行中和，濃縮以下的操作與1)同樣地進行，得到除去Hep和HS的RCDS樣品(RCDS—H(—))。
參考例2來自牛小腸粘膜的DS的制備將牛小腸10kg切斷，除去糞和脂肪后，回收粘膜。加氫氧化鈉，調(diào)整到2.5N，3升，37℃提取2小時。將此提取液中和后經(jīng)硅藻土過濾，濾液透析，離心除去形成的不溶物。在上清液中加入乙醇和5g乙酸鈉，得沉淀物。將此沉淀物溶于0.65M食鹽溶液，以后與參考例1同樣地上陰離子交換樹脂柱，依次用0.65M和1.1M食鹽溶液洗凈后，用1.5m食鹽溶液洗脫。洗脫部分用蒸餾水透析，在透析內(nèi)液中加入乙酸鈣和乙酸，終濃度分別調(diào)整到5％和0.5M。在此液中加入乙醇，收集以15—30％(v/v)沉淀的部分。用離子交換樹脂將沉淀物轉(zhuǎn)變?yōu)殁c鹽，按與參考例1同樣的方法洗凈和干燥，得DS鈉鹽(以下稱作BIDS)。
用與參考例1(2)2)同樣的方法，從BIDS除去Hep或HS，得到BIDS-H(—))。
為了比較硫酸皮膚素的性質(zhì)，來自豬腸粘膜的硫酸皮膚素，來自豬皮膚的硫酸皮膚素分別用Celsus Lab Inc制(コスモバイォ銷售)、生化學(xué)工業(yè)公司制(銷售，同)的產(chǎn)品進行研究。
參考例3來源不同的各種硫酸皮膚素的理化性質(zhì)比較(a)平均分子量的測定DS的平均分子量按Arai等的方法(Biochim.biophys.Acta，1117，60—70，1992)測定。即以已知分子量的葡糖胺基聚糖為標準品，用高速液相色譜凝膠過濾，由洗脫部位決定。柱采用TSK凝膠G4000 PWXL、G3000PWXL和G2500PWXL(均為300×7.8mm內(nèi)徑，東ソ—社制)三連柱，溶劑采用0.2M氯化鈉溶液，以0.6ml/分，檢測采用示差折射。
(2)二糖組成分析DS硫酸基位置的分析按新生物化學(xué)實驗講座3、糖類II，第49—62頁的記載進行。即，用軟骨素酶ABC消化DS，將生成的含不飽和鍵的二糖(不飽和二糖)部分不經(jīng)分離，用HPLC進行分析，以及將上述不飽和二糖部分用軟骨素-6-硫酸酶處理，再作HPLC分析，兩者結(jié)果進行比較。軟骨素酶ABC消化、軟骨素-6-硫酸酶的脫硫酸化和HPLC分析的條件記錄如下。
a)軟骨素酶ABC消化按Yoshida的方法[Anal.Biochem.77，327—332，(1989)]，在20μlDS水溶液(10mg/ml)中，加入0.4M Tris—HCl(pH8.0)20μl、0.4M乙酸鈉20μl、0.1％牛血清白蛋白20μl和水120μl，加入軟骨素酶ABC(5U/ml)20μl，37℃反應(yīng)2小時。
b)軟骨素-6-硫酸酶消化在上述軟骨素酶ABC消化物100μl中，加入溶于20mM Tris—HAc緩沖液(pH7.0)的軟骨素-6-硫酸酶(5U/ml)20μl，37℃反應(yīng)2小時。
c)HPLC分析將進行軟骨素ABC酶消化后的溶液或該溶液經(jīng)軟骨素-6-硫酸酶消化后的溶液50μl用HPLC(日立制作所)進行分析。使用離子交換柱(YMC-Pack PA-120-S5柱，250×2.6mm內(nèi)徑)，測定232nm處的吸光度。以流速1.5ml/分，800mM磷酸氫鈉在60分鐘內(nèi)從0％上升到100％的梯度進行洗脫。鑒定各部位具有硫酸根基的不飽和二糖的峰。
(3)極限粘度的測定DS極限粘度的測定按第12版日本藥典進行。測定裝置采用自動粘度測定裝置(離合社制，VMC-052型)。溶劑采用0.2m氯化鈉，在烏伯婁德型粘度管流下時間的測定上也用同樣的溶液。粘度測定在30±0.1℃進行，將流下時間之差連續(xù)三次在0.1秒以內(nèi)的測定值用于計算極限粘度。流下時間1/100秒四舍五入后作為測定值，極限粘度的計算應(yīng)用下式。
溶液的流下速度ts；溶劑的流下速度to；試樣濃度(重量％)CO以還原粘度(η還原＝(tS/to-1)/c)為縱座標、濃度為橫座標作圖，得到的直線延伸到濃度0處，在縱軸上的截距，即為極限粘度。
(4)結(jié)果將(1)—(3)的結(jié)果整理于表1。與來自雞冠的DS的平均分子量38,000道爾頓、極限粘度1.21相比，其余三個平均分子量在14，000—16,000道爾頓范圍內(nèi)，極限粘度也是在0.44—0.68之間，證明來自雞冠的DS具有不同的性質(zhì)。另外，關(guān)于牛、豬腸來源的DS的平均分子量，有報道為25,000(Thromb.Res.71，417—422，1993)或35,700(Blood 74，1577—1582，1989)，而用本發(fā)明者的方法，如表1所示，分別為16,000道爾頓和18,500道爾頓。表1各種硫酸皮膚素的物性硫酸皮膚素 牛腸 豬腸 豬皮膚 雞冠平均分子量 16,00018,50014,000 38,000極限粘度(100mL/g) 0.68 0.58 0.441.21二糖組成(％)ΔDi—OS0.69 0.69 0.344.97ΔDi—6S2.52 4.85 0.854.41δDi—4S87.22 83.83 90.22 82.91ΔDi—diSD 0.16 0.51 0.220.92ΔDi—diSB 7.65 6.31 8.386.13ΔDi—diSE 1.58 3.59 0.000.65ΔDi—triS 0.18 0.24 0.000.00
表示二糖組成的簡略符號參見表2。
表2 R1R2R3ΔDi-OSH H HΔDi-6SSO3- H HΔDi-4SH SO3- HΔDi-diSD SO3- H SO3-ΔDi-diSE SO3- SO3- HΔDi-diSB H SO3- SO3-ΔDi-triS SO3- SO3- SO3-下面列舉具體的實例，進行發(fā)明的詳述。
參考例4DS中Hep或HS的定量1)實驗方法DS中Hep或HS的定量按如下三種方法進行。
a)酶消化法下面三種酶只消化Hep或HS，而不消化DS(新生物化學(xué)實驗講座3，糖類II，p.244—249)。利用這一性質(zhì)進行測定。即、在參考例1或參考例2所得DS500μg中，加入溶于20mM Tris—HCl緩沖液、10mM CaCl2(pH7.0)10μl的三種酶—肝素酶I 20mU、肝素酶II20mU和肝素酶IV50mU，于37℃反應(yīng)2小時，在與測平均分子量同樣的條件下，對消化產(chǎn)物作HPLC分析，于230nm處定量檢測生成的不飽和二糖。
b)由Hep或HS的抗凝血酶III激活作用產(chǎn)生活性型第X因子阻斷作用的測定方法。
Hep或HS具有激活抗凝血酶III，阻斷凝血因子之一的第X因子的活性型(Xa)的作用(如下稱作抗Xa作用)與此相反，DS無此作用(Tollfsen，In″Heparin″，PP.257—273.EdsDavid A.Laneand Uif Lindahl，Edward Arnold，London 1989)。利用這種性質(zhì)，用各種濃度的Hep，測定抗Xa活性，求得阻斷活性與Hep用量的劑量依賴性范圍，再求得產(chǎn)生最大阻斷的Hep的最少用量，以這時的阻斷率為100％，在無Hep的情況下，只有抗凝酶III時的阻斷率為0％，將此關(guān)系作圖，得到標準曲線。用本發(fā)明的DS樣品作同樣的測定，比照標準曲線，從所得的抗Xa活性換算成Hep或HS，從而進行定量。
具體操作如下。將50mM Tris—HCl緩沖液(pH8.0)、150mMNaCl、10mm CaCl20.3ml，抗凝血酶III(來源于牛，シゲマ社制)(1U/ml)0.1ml，0.03—2μg/ml Hep(來自牛腸，シンテックス社制)或50—100μg/ml的上述除去Hep或HS的DS樣品0.1ml于4℃下混合后，37℃保溫2分鐘。然后加入0.1ml Xa(7.1nkat/ml，來自牛，クロモジェニックスAB社制，生化學(xué)工業(yè)銷售)，于37℃反應(yīng)5分鐘后，加入合成基質(zhì)Boc—ILe—Glu—Gly—Arg—MCA(code3094V，ペプド研)100μM 0.1ml，37℃反應(yīng)3分鐘。加入30％乙酸0.3ml以停止反應(yīng)，再加入上述緩沖液與30％乙酸按7∶3比率混合的液體1ml作為測定試劑。用熒光光度計(日本分光FP-777)進行測定。激發(fā)波長350nm，熒光波長444nm。還在此測定條件下，確認了在不存在Hep或HS時抗凝血酶III自身的抗Xa活性完全可以忽略。阻斷率的計算按下式進行。 A有Hep或DS的樣品的測定值B按上述操作，不加抗凝血酶III、Hep或DS及Xa，代之以緩沖液時的測定值。
C按上述操作，僅不加抗凝血酶III，代之以緩沖液時的測定值C)由Hep或HS的抗凝血酶III激活作用產(chǎn)生的活性型第II因子阻斷作用的測定方法Hep或HS具有激活抗凝血酶III、阻斷凝血因子之一的第II因子的活性型(IIa)的作用、即抗凝血酶作用(以下稱作抗IIa作用)，與此相反，DS無此作用(Tollfsen，In″Heparin″，pp.257—273.EdsDavid A.Lane and Ulf Lindahl，Edward Arnold，London1989)。利用這種性質(zhì)，用各種濃度的Hep，測定抗IIa活性，求得阻斷活性與Hep用量的劑量依賴性的范圍，再求得產(chǎn)生最大阻斷的Hep的最少用量，以這時的阻斷率為100％，在無Hep的情況下，只有抗凝酶III時的阻斷率為0％，將此關(guān)系作圖，得到標準曲線。用本發(fā)明的DS樣品作同樣的測定，比照標準曲線，從所得的抗IIa活性換算成Hep或HS，從而進行定量。
具體操作如下。將20mM Tris—HCl緩沖液(pH7.4)、150mMNaCl、10mM CaCl2、0.1％中血清白蛋白0.35ml，抗凝血酶III(來自牛，シゲマ社制)(1U/ml)0.1ml，0.3—20μg/ml的Hep(來自牛腸，シンテックス社制)或50—100μg/ml的上述除去Hep或HS的DS0.1ml于4℃混合后，37℃保溫2分鐘。然后，加入IIa(50mU/ml，來自牛，ベ—リンガ—社制)0.05ml，37℃反應(yīng)5分鐘后，加入合成基質(zhì)Boc-Val-Pro-Arg-MCA(code 3093 V，ペプチド研)(70μM)0.1ml，37℃反應(yīng)3分鐘。加入30％乙酸0.3ml以停止反應(yīng)，再加入上述緩沖液與30％乙酸按7∶3比率混合的液體1ml作為測定試劑。用熒光光度計(日本分光FP-777)進行測定。激發(fā)波長350nm，熒光波長444nm。還在此測定條件下，確認了在不存在Hep或HS時抗凝血酶III自身的抗IIa活性完全可以忽略。阻斷率的計算按下式進行。

A有Hep或DS的樣品的測定值B按上述操作，不加抗凝血酶III、Hep或DS及IIa，代之以緩沖液時的測定值。
C按上述操作，僅不加抗凝血酶III，代之以緩沖液時的測定值2)結(jié)果上述三種方法所得結(jié)果列于表3。
表3ND未測定*參考例1(2)的1)中記載的用離子交換色譜法除去Hep或HS的樣品實施例1RCDS、RIDS和RCDS-H(—)、BIDS-H(—)投與大鼠后血中持續(xù)時間的差異的研究(1)實驗方法動物采用6.5—7.5周齡的SD(Sp

rague—Dawley)系雄性大鼠(チャ—ルスリ—バ—)。受試藥采用RCDS、BIDS和RCDS-H(—)、RIDS-H(—)四種。將大鼠乙醚麻醉后，以10mg/kg劑量尾靜脈注射各受試藥。給藥5分鐘和120分鐘后，在乙醚麻醉下從腔靜脈取血，按1/10用量使用3.2％枸櫞酸抗凝，離心分離出血漿。按《新生物化學(xué)實驗講座3》(糖類II)p.175—179的方法測定血漿中的DS量。即，將血漿用PD-10R柱(Pharmacia)脫鹽后冷卻干燥，殘渣經(jīng)軟骨素酶消化，用濾過分子量5000(cut)的膜超濾后，所得濾液用HPLC進行分析。
(2)結(jié)果結(jié)果以對應(yīng)于0時間的百分率(殘留率)在圖1中表示。給藥5分鐘后DS的殘留率為RCDS和RCDS-H(—)分別比BIDS和BIDS-H(—)高出約2倍。給藥120分鐘后，RCDS和RCDS-H(—)還殘留10％，而BIDS基本不能檢出。RCDS與RCDS-H(—)略有差別，后者的殘留率在5分鐘、120分鐘時均較高。實施例2關(guān)于DS對血栓形成抑制的影響采用大鼠下腔靜脈血栓模型進行研究。
(1)實驗材料動物用6.5—7.5周齡的SD(Sprague—Dawley)系雄性大鼠(チャ—ルスリ—バ—)。DS用RCDS和BIDS兩種。
(2)實驗方法1)血栓模型的制備大鼠血栓模型按Reyers[Thromb.Res.18，669—674(1980)]的方法進行制備。即，大鼠在戊巴比妥鈉nembutalR(ダィナポット社，大日本制藥(株)銷售)麻醉下剖腹，用外科用絲線(No.7，Φ0.48—0.56mm進榮醫(yī)科)結(jié)扎下腔靜脈的左腎靜脈支。受試藥用RCDS、BIDS，在結(jié)扎1分鐘前以1、3、10mg/kg劑量尾靜脈注射。對照組注射生理鹽水。結(jié)扎3小時后，將大鼠在乙醚麻醉下剖腹，打開靜脈取出血栓，于37℃放置一夜后，測干重。所得數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理用Newman—Keuls法。
(3)結(jié)果結(jié)果列于表3。相對于對照組干燥血栓重量的相對重量，兩種DS在1mg/kg給藥水平時均抑制為60％，而3mg/kg和10mg/kg以上劑量時，則RCDS使血栓重量分別降低至對照的2.4％和0.0％，而BIDS僅分別使之降低至34.1％和2.4％，表明RCDS的有用性。
表3用大鼠下腔靜脈模型進行血栓形成抑制試驗受試藥用量 平均血栓干燥相對重量比(mg/kg)重量(mg)(％)生理鹽水4.1±0.7100(對照)RCDS 1 2.5±0.961.03 0.1±0.1**2.410 0.0±0.0**0.0BIDS 1 2.6±0.663.43 1.4±0.8*34.110 0.1±0.1**2.4(與對照組相比*；P＜0.05，**；P＜0.01)對照組14例，DS二種給藥組均6例，重復(fù)進行，取得平均值。
實施例3關(guān)于DS對血栓形成和血栓溶解的影響，用大鼠下腔靜脈血栓模型進行研究。
(1)實驗材料動物用6.5—7.5周齡的SD(Sprague—Dawley)系雄性大鼠(チャ—ルスリ—バ—)，DS用RCDS和BIDS兩種。
(2)實驗方法1)血栓模型的制備大鼠血栓模型采用與實施例2同樣的操作，結(jié)扎下腔靜脈。結(jié)扎后6小時，以0.5ml/kg(3、10、30mg/kg)劑量尾靜脈注射受試藥。對照組注射生理鹽水。結(jié)扎后6小時(僅限于對照組)和注射受試藥后2小時(結(jié)扎后8小時)，將大鼠在乙醚麻醉下剖腹，取血后，打開靜脈，取出血栓，于37℃放置一夜后，測干重。所得數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理用Newman—Keuls法。
2)優(yōu)球蛋白部分的制備將血漿0.5ml放入塑料試管中，加入用冰充分冷卻的0.01N乙酸緩沖液(pH4.85)9.5ml，在冰箱中靜置1小時，3000rpm離心分離5分鐘后，得到優(yōu)球蛋白部分。在此沉淀物中加入Tris—HCl緩沖液(pH7.4)0.5ml，將其溶解。
3)纖溶活性測定在纖維蛋白平板的試樣孔中加入優(yōu)球蛋白部分10μl，在培養(yǎng)箱中37℃放置18小時，測纖維蛋白溶解面積(直徑的平方)。溶解面積的大小與血纖維蛋白溶酶活性的強度成比例。纖維數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理用Newman—Keuls法。
(3)結(jié)果結(jié)果列于表4。
表4的對照—6小時表示在靜脈結(jié)扎6小時后麻醉下剖腹、采血、取出血栓的大鼠組，對照—8小時表示在靜脈結(jié)扎后6小時注射生理鹽水，再在2小時后采血、取出血栓的大鼠組。
1)對抑制血栓形成和溶解的影響雖然在各組均可見血栓，但如表4所示，各組間可見顯著差異。RCDS和BIDS組與對照—8小時組相比，血栓重量均出現(xiàn)劑量依賴性的減少，而與對照—6小時組的血栓重量值比較，BIDS30mg/kg組和RCDS 10mg/kg以上組的血栓重量值小，從而確認它們不僅有抑制血栓形成而且有溶解血栓的作用。而RCDS比BIDS較少量即顯示強的抑制血栓形成和溶解作用。
2)對纖溶系的影響將RCDS和BIDS各注射3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg，測定2小時后(靜脈結(jié)扎8小時后)血漿中纖維蛋白溶酶活性。結(jié)果見表4。在注射RCDS10mg/kg和BIDS30mg/kg以上時，血纖維蛋白溶酶活性比對照組有顯著意義地提高。從本實驗也證明RCDS的優(yōu)異效果。
表4試樣 劑量 干燥血栓重量纖溶活性(mg/kg) (％對照-8小時) FA1)(％對照-8小時)對照-6小時 — 70±9 未測定對照-8小時 — 100±11 100±4RCDS 373±9 110±510 56±12 165±10**30 54±11 204±15**BIDS 390±18 108±610 79±16 114±530 60±8 158±6**1)纖維蛋白溶解面積。與對照-8小時相比**P＜0.01血栓重量是以對照-8小時組為100％、用相對比率求出。對照-8小時組16例，其他組各8—9例進行實驗，分別得到平均值。
實施例4
在內(nèi)毒素誘發(fā)大鼠DIC模型上DS的抗血栓效果比較試驗(1)實驗方法動物采用5.5—6.5周齡SD(Sprague—Dawley)系雄性大鼠(チャ—ルスリ—バ—)。給大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉nembutalR麻醉后，切開左側(cè)大腿部，將聚乙烯導(dǎo)管(PE-10，IMAMURA)從該部位向離腹腔靜脈4cm處逆行插入并固定。大鼠清醒后，通過裝在輸液泵(Model—22M，HARVARD)上的注射器以3.75mg/kg/小時的比例連續(xù)注入內(nèi)毒素(大腸桿菌0.55∶B5，Difeo公司)4小時。與此同時，將受試藥[用RCDS—H(—)和BIDS-H(—)]經(jīng)右側(cè)靜脈導(dǎo)管連續(xù)輸入4小時。將與各輸入液量相當(dāng)?shù)纳睇}水輸入4小時的大鼠作為正常組。
(2)檢查項目注完內(nèi)毒素后，取血液和腎臟，測定以下項目。
1)血小板數(shù)用自動血球計數(shù)器(Celltac MEK—4500日本電工)測定血液中的血小板數(shù)目。
2)纖維蛋白原分離血漿，用纖維蛋白原測定用試劑(サン ァッセイFibR，銷售三光純藥，制造日東紡織)測定。
3)纖維蛋白原—纖維蛋白分解產(chǎn)物(FDP)分離血清，用FDP測定用乳膠試劑(FPDLR試驗，帝國臟器制藥(株)制售)進行測定。
4)腎小球體纖維蛋白沉著率(％GFD)用10％中性緩沖甲醛溶液固定腎臟，石蠟包埋，切片后，進行磷鎢酸—蘇木精染色。用顯微鏡觀察腎標本全視野的腎小球體，將可見纖維蛋白沉著的腎小球數(shù)以百分率表示。數(shù)據(jù)處理用Newman－Kleus法。
(3)結(jié)果結(jié)果列于表5。正常組血小板75×104μl，纖維蛋白原216mg/dl，F(xiàn)DP 2.5μg/ml以下，未檢出％GFD，而內(nèi)毒素誘發(fā)DIC的大鼠組分別為4×104μl、35mg/dl、34.3μg/ml、61％，顯示為異常值。
注射DS-H(—)組中，這些數(shù)值均得到改善，而RCDS-H(—)的各個項目均超過BIDS-H(—)引起的改善，特別是在成為腎功能不全原因的％GFD方面，RCDS-H(—)使其降至1％，改善顯著，而BIDS-H(—)停留于16.1％，表明RCDS-H(—)的有用性。
表5在內(nèi)毒素誘發(fā)大鼠DIC模型上DS抗血栓效果的比較試驗給藥量血小板纖維蛋白原 FDP ％GFD(mg/kg/小時) (×104μL) (mg/dL) (μg/mL)正常 75±1 216±5 ＜2.50.0對照(僅LPS&) 14±1 35±3 34.3±2.560.7±5.3RCDS＋LPS 5.0 22±3 120±6*4.6±0.4*1.2±0.7*BIDS-H(-)＋LPS 5.0 18±3 107±10*8.6±2.6*16.1±5.5*(a內(nèi)毒素*與對照相比 ＜P0.01)正常組19例、對照組20例、DS組各7例，進行實驗，求得平均值。
實施例5DS對t-PA的Glu-血纖維蛋白溶酶原(天然的血纖維蛋白溶酶原，以下只稱作血纖維蛋白溶酶原)激活反應(yīng)的促進效果(1)實驗方法將各種濃度的DS(BIDS、RCDS)或硫酸軟骨素(對照)50μl、1.6μM血纖維蛋白溶酶原25μl、20nM的單鏈或雙鏈t-PA25μl，及0.6mM的合成底物S-2251(H-D-Val-L-Leu-L-Lys-對硝基苯胺·二鹽酸鹽100μl混合后，加在自動微量滴定板讀取機上，每2分鐘測定405nm的吸收值。反應(yīng)于37℃下進行，將上述混合液溶于含吐溫R80的50mM Tris—HCl緩沖液后使用。
血纖維蛋白溶酶原激活的初速度是將時間t時405nm的吸收值A(chǔ)405與時間平方的曲線斜率(ΔA405/Δt2)用40,000除而得到(Chibber，B.A.K.et a1.，Biochemistry，1985，3429—3434)，促進率是將無DS和硫酸軟骨素時的初速度作為1，以與其相對比表示。
(2)結(jié)果圖2和圖3表示BIDS的結(jié)果。如這些圖所示，DS劑量依賴性地促進血纖維蛋白溶酶原的激活，分別在單鏈t-PA(sc-tPA)時為1.5—4.5倍，在雙鏈t—PA時為1.5—3.5倍。與DS相比，作為對照用的硫酸軟骨素在單鏈t-PA存在下最大2.5倍，在雙鏈t-PA存在下最大為1.5倍，與DS相比，其促進率弱。圖4與圖5表示RCDS的結(jié)果。RCDS也分別在單鏈t-PA(sc—tPA)時2.0—4.5倍，在雙鏈t-PA(tc-tPA)時2.0—4.0倍地促進血纖維蛋白溶酶原的激活。
實施例6(1)試驗方法就DS對大鼠纖溶系統(tǒng)的影響進行了研究。
在以戊巴比妥鈉SomnopentylR(共立商事)麻醉的9—11周齡Wistar系雄性大鼠背部皮下注射DS(BIDS)40mg/kg后，1、6、12，24小時后取血，枸櫞酸抗凝。以與實施例3同樣的操作，從血漿制備優(yōu)球蛋白部分，用血纖維蛋白平板法評價纖溶活性。所得數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理采用Newman—Kleus法。
同時測定血漿，優(yōu)球蛋白部分中的DS量[《新生物化學(xué)實驗講座3》(糖類II)，p175—179]。用生理鹽水作對照。考慮到大鼠凝血纖溶活性在一天內(nèi)存在變動，這些實驗均在相同時間進行。
(2)結(jié)果所得結(jié)果列于表6和表7。
如表6所示，DS在給藥后1.2小時內(nèi)顯示纖溶活性。如表7所示，血漿中的DS的約70—80％存在于優(yōu)球蛋白部分，證明優(yōu)球蛋白部分是顯示纖溶活性的部分。RCDS也得到同樣的結(jié)果。
表6用血纖維蛋白平板法測定纖溶活性給藥時間藥劑6小時12小時 24小時對照 57.4±3.654.1±3.942.3±4.6DS85.3±8.4*71.9±3.546.1±3.71)血纖維蛋白溶解面積(mm2)，與對照相比p＜0.01對照組、DS組各4—5例，進行重復(fù)實驗，求其平均值。
表7血漿和優(yōu)球蛋白部分中的DS(μg/ml)部分 給藥后時間1小時6小時 12小時24小時血漿 3.62±0.61 3.58±0.272.20±0.260.47±0.04優(yōu)球蛋白 2.51±0.62 2.80±0.271.60±0.16未測定對照 0.03±0.02對照組與DS組各4—5例，進行重復(fù)實驗，求其平均值。
實施例7關(guān)于DS對人血漿塊的促進溶解效果的研究(1)實驗方法在96孔微量板上加入各種濃度的DS(BIDS)40μl(最終濃度50.0—200μg/ml)、單鏈t-PA(最終濃度166.7U)20μl、凝血酶40μl(最終濃度20U/ml)和人血漿100μl，混合，然后立即和其后每10分鐘測定波長340nm處的吸光度，直至側(cè)得吸光度變成最小值(Min)。纖溶活性使用最大吸光度(Max)與Min之和被2除所得的PLT1/2(分)，以加DS時的值DS-PLT 1/2與對照的Cont—PLT1/2之比表示。
(2)結(jié)果結(jié)果見圖6。如圖6所示，DS具有劑量依賴性地促進血漿塊溶解的活性。RCDS也得到同樣的結(jié)果。
實施例8硫酸皮膚素給小鼠單次靜脈注射的毒性試驗(1)實驗方法動物采用5周齡雌雄Crj；CD—1小鼠(日本チャ—ルス·リバ—公司)。用無菌蒸餾水和無菌生理鹽水將RCDS-H(—)和BIDH-H(—)溶液分別配制成等滲溶液，用玻璃注射器從小鼠尾靜脈分別單次注射2000mg/kg，觀察14日。
(2)結(jié)果如表8所示，這兩種DS中任何一種在2000mg/kg的高劑量下均未見死亡例，可推斷在本試驗條件下致死量在2000mg/kg以上。表8靜脈注射量死亡數(shù)/使用動物數(shù)受試物質(zhì)(mg/kg) 雄 雌RCDS—H 2000 0/5 0/5BIDS—H(—) 2000 0/5 0/5實施例9制劑(1)將參考例1所得的雞冠DS鈉鹽(RCDS或RCDS-H(—))500—5000mg進行無菌處理，加入適量無菌生理鹽水和無菌蒸餾水，配制成100ml等滲液，在每一安瓿中注入10ml，用于血管注射、皮下注射或肌肉注射。
(2)將參考例1所得的雞冠DS鈉鹽(RCDS或RCDS-H(—))250mg和t-PA 1,000,000 I.U.分別包裝，配制成使用時溶于溶解液中使用的用時溶解型注射用劑，用于冠脈注射或靜脈內(nèi)注射。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽激活纖溶活性，可用作血栓溶解促進劑。
將其與組織血纖維蛋白溶酶原激活劑合用時，溶解血栓的作用顯著提高，可減少組織血纖維蛋白溶酶原激活劑的用量。
使用本發(fā)明的特定的硫酸皮膚素，即極限粘度為0.8 100ml/g以上的硫酸皮膚素，或從雞冠而來的硫酸皮膚素，或構(gòu)成二糖的組成中ΔDi-OS為2％—7％或用下面的測定法(Biochim.Biophys，Ac-ta，1117，60—70，1992記載的凝膠濾法)得到的平均分子量為2.5萬道爾頓—10萬道爾頓的硫酸皮膚素，或特別是上述硫酸皮膚素中那些肝素或硫酸乙酰肝素含量極低的特定的硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽，有效血濃度維持時間長，顯示預(yù)防血栓發(fā)展、抑制血栓生長等效果。
從而，本發(fā)明的抗血栓劑對心肌梗塞，彌漫性血管內(nèi)凝血綜合征、伴多發(fā)性血栓的多臟器功能不全、深部靜脈血栓癥等的治療或預(yù)防是有用的。另外，在腎透析等體外循環(huán)時使用，可防止血液的凝固。而且，DS與Hep相比，出血等副作用少，特別是從DS中除去Hep的DS-H(—)，由于出血等副作用更小，安全性提高，因而對有出血傾向的血小板和凝血因子下降的患者更為有用。
權(quán)利要求
1.硫酸皮膚素及其鹽，其特征在于按照使用烏伯婁德型粘度管的測定法、用0.2M氯化鈉為溶劑、于30±0.1℃測得的極限粘度為0.8 100ml/g以上。
2.如權(quán)利要求1所述的硫酸皮膚及其鹽，其極限粘度為0.9—2.0 100ml/g。
3.如權(quán)利要求1所述的硫酸皮膚素及其鹽，其來源為雞冠。
4.如權(quán)利要求1所述的硫酸皮膚素及其鹽，其特征還在于用酶分解和高速液相色譜法測得二糖組成中ΔDi—OS為2％以上，7％以下。
5.如權(quán)利要求1所述的硫酸皮膚素及其鹽，其特征在于還在于用Biochim.Biophys.Acta，1117，60—70，1992記載的凝膠過濾法測得平均分子量為2.5萬道爾頓以上，10萬道爾頓以下。
6.如權(quán)利要求1所述的硫酸皮膚素及其鹽，其特征還在于用肝素或硫酸乙酰肝素分解酶和高速液相色譜測定法測得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.15％以下，用在抗凝血酶III存在下測定活性型第X因子的阻斷作用的方法，以來自牛腸的肝素為標準物質(zhì)，測得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.07％以下，或用在抗凝血酶III存在下測定活性型第II因子的阻斷作用的方法，以來自牛腸的肝素為標準物質(zhì)，測得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.05％以下。
7.以硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽為有效成份的抗血栓劑。
8.以來自雞冠的硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽為有效成份的抗血栓劑。
9.抗血栓劑，其特征在于其有效成份為用酶分解和高速液相色譜法測得構(gòu)成二糖的組成中含ΔDi—OS 2％以上、7％以下的硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽。
10.抗血栓劑，其特征在于其有效成分為用Biochim.Biophys.Acta，1117，60—70，1992記載的凝膠過濾法測得的平均分子量為2.5萬道爾頓以上、10萬道爾頓以下的硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽。
11.抗血栓劑，其特征在于其有效成份為按使用烏伯婁德型粘度管的測定法、用0.2M氯化鈉為溶劑、于30±0.1℃測得的極限粘度為0.8 100ml/g以上的硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽。
12.如權(quán)利要求1所述的抗血栓劑，其中有效成分為極限粘度為0.9—2.0 100ml/g的硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽。
13.抗血栓劑，其特征在于其有效成份為權(quán)利要求7—12之一的硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽，其中用肝素或硫酸乙酰肝素分解酶和高速液相色譜測定法測得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.15％以下，用在抗凝血酶III存在下測定活性型第X因子的阻斷作用的方法，以來自牛腸的肝素為標準物質(zhì)，測得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.07％以下，或用在抗凝血酶III存在下測定活性型第II因子的阻斷作用的方法，以來自牛腸的肝素為標準物質(zhì)，測得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.05％以下。
14.各種血栓癥的預(yù)防或治療方法，其特征在于對有血栓形成可能性者、血栓正在形成者或已經(jīng)形成者投與硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽。
15.如權(quán)利要求14所述的血栓癥的預(yù)防或治療方法，其中硫酸皮膚素為權(quán)利要求1—6之一所述的硫酸皮膚素。
16.如權(quán)利要求14或15所述的預(yù)防或治療方法，投與對象為因血小板數(shù)目降低、凝血因子低下等有出血傾向者、有血栓形成可能性者、血栓正在形成者或已形成者。
17.彌漫性血管內(nèi)凝血綜合征的預(yù)防或治療方法，其特征在于對有彌漫性血管內(nèi)凝血綜合征發(fā)病可能性者、正在發(fā)病者或已發(fā)病者投與硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽。
18.如權(quán)利要求16所述的預(yù)防或治療方法，其中硫酸皮膚素為權(quán)利要求1—6之一所述的硫酸皮膚素。
19.由組織血纖維蛋白溶酶原激活劑與硫酸皮肪素或其藥理學(xué)上容許的鹽組成的抗血栓劑。
20.如權(quán)利要求19所述的抗血栓劑，其中硫酸皮膚素或其藥理下上容許的鹽為來自雞冠的硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽。
21.如權(quán)利要求19所述的抗血栓劑，其中硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽為用酶分解和高速液相色譜測定法測得的構(gòu)成二糖的組成中含ΔDi—OS 2％以上、7％以下的硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽。
22.如權(quán)利要求19所述的抗血栓劑，其中硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽為用Biochim.Biophys.Acta，1117，60—70，1992記載的凝膠過濾法測得平均分子量為2.5萬道爾頓以上、10萬道爾頓以下的硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽。
23.如權(quán)利要求19所述的抗血栓劑，其中硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽按使用烏伯婁德型粘度管的測定法、用0.2m氯化鈉為溶劑、于30±0.1℃測得的極限粘度為0.8 100ml/g以上。
24.如權(quán)利要求23所述的抗血栓劑，其中硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽的極限粘度為0.9—2.0 100ml/g。
25.如權(quán)利要求19—24之一所述的抗血栓劑，其中用肝素或硫酸乙酰肝素分解酶和高速液相色譜測定法測得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.15％以下，用在抗凝血酶III存在下測定活性型第X因子的阻斷作用的方法，以來自牛腸的肝素為標準物質(zhì)，測得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.07％以下，或用在抗凝血酶III存在下測定活性型第II因子的阻斷作用的方法，以來自牛腸的肝素為標準物質(zhì)，測得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.05％以下。
26.心肌梗塞的治療方法，其特征在于對心肌梗塞發(fā)病者投與組織血纖維蛋白溶酶原激活物與硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽。
27.如權(quán)利要求26的治療方法，其中硫酸皮膚素為權(quán)利要求1—6之一所述的硫酸皮膚素。
全文摘要
本發(fā)明提供以硫酸皮膚素或其藥理學(xué)上容許的鹽(DS)為有效成分的抗血栓劑。使用來自雞冠、構(gòu)成其二糖組成中ΔDi-OS為3％以上、分子量2.5萬以上的DS時，有效血濃度維持時間長，可有效預(yù)防血栓發(fā)展。DS與組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)合用時，顯著提高血栓的溶解，可減少t-PA的用量。本發(fā)明的產(chǎn)品可用于心肌梗塞、彌漫性血管內(nèi)凝血綜合癥等各種血栓癥的治療和預(yù)防和腎透析等體外循環(huán)時防止血液凝固。
文檔編號C08B37/00GK1115182SQ94190743
公開日1996年1月17日 申請日期1994年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月30日
發(fā)明者高田明和, 女屋純一, 荒井幹雄, 宮內(nèi)聰, 京ク島守, 吉田圭一 申請人:生化學(xué)工業(yè)株式會社