專利名稱:水溶性呫噸衍生物底物的制備方法及其應用的制作方法
本發(fā)明是關于水溶性呫噸鎓衍生物底物，其合成方法以及這類合成底物在測定單獨或以彼此結(jié)合形式存在的蛋白酶、抑制劑、輔助因子、活化劑和阻活劑之活性方面的應用。
如Leytus等人所報導的〔詳見Biochem.Journal 209299-307(1983)和Biochem.Journal215253-260(1983)〕，此前已將合成的若丹明110(rhodamine 110)衍生物底物用于熒光測定蛋白酶活性。Leytus等人的這種底物與先前報導的底物相比較，對于測定酶活性具有極好的敏感性。然而也發(fā)現(xiàn)，Leytus等人的若丹明110衍生物底物的水溶性很差，即37℃時溶解度約為120微摩爾，因此必須添加有機溶劑添加劑如二甲基甲酰胺和乙醇，以促進底物溶解。但已了解到，作酶分析時加有機溶劑會干擾分析程序，即會使蛋白變性，降低反應速率以及(或者)引起其它反應物或產(chǎn)物的沉淀，以致不能達到最佳試驗效果。
除Leytus等人所公開的底物外，Smith等人(見美國專利4，294，923)公開了一種用于熒光或分光光度法測定生物體液中蛋白水解酶的香豆素衍生物底物。Gargiulo等人(見美國專利4，275，153和4，336，186)公開了用于測定生物學樣品中蛋白酶活性的發(fā)生熒光的aminoisophalate底物。
本發(fā)明涉及用于熒光和分光光度法測定蛋白酶活性的水溶性呫噸鎓衍生物底物-下文稱之為若丹明110和若道爾(rhodoe);因其在工作濃度有較好的水溶性，故不必使用如二甲基甲酰胺和乙醇等有機增溶劑，也就不存在它們在試驗過程中產(chǎn)生的干擾作用。此外，水溶性若丹明110和若道爾衍生物底物用于測定蛋白酶活性水平時，較之先有技術中的若丹明110衍生物底物表現(xiàn)有更大的敏感性。鑒于這種增加了的敏感性，所以水溶性若丹明110和若道爾衍生物底物可用于分光光度試驗方法;而先有技術的低水溶性若丹明110衍生物底物在用較小體積的樣品和底物進行分光光度和螢光法測定時，不能表現(xiàn)足夠的敏感度。本發(fā)明的水溶性呫噸鎓衍生物底物可用于測定單獨或以彼此結(jié)合形式存在的蛋白酶、輔助因子、活化劑和阻活劑的活性，特別是用于測定胰蛋白酶樣酶的活性。
本發(fā)明的一個目的是提供一種帶有可被酶水解之側(cè)鏈的水溶性呫噸鎓衍生物底物的復合物，這樣，側(cè)鏈的水解是與酶活性成正比的。
本發(fā)明的另一個目的是提供具有較好水溶性的呫噸鎓衍生物底物。
本發(fā)明再一個目的是消除在測定蛋白酶、輔助因子、抑制劑、活化劑和阻活劑，特別是凝血酶形成的分析方法中使用有機溶劑的需要。
本發(fā)明還有一個目的，即提供呫噸鎓衍生物，該衍生物用于分光光度及螢光法測定時有足夠的敏感性。
本文所述的合成底物及其水解產(chǎn)物在工作濃度下是水溶性的，因此可在不使用有機溶劑添加劑和(或)特殊的水增溶劑的情況下，用于分光光度和螢光測定。這種新的水溶性底物具有下列結(jié)構(gòu)通式，也包括它們的水溶性鹽。
其中R1是增加水溶性的基團，選自肌氨酰基、焦谷氨?；臀於；?
R2是呫噸鎓，3′，6′-二氨基-9′-(2-羧苯基);R3是呫噸鎓，3′-氨基-6′-羥基-9′-(2-羧苯基)。
若丹明110和若道爾的化學結(jié)構(gòu)式如下若丹明110 若道爾
由于蛋白酶對這些化合物的敏感度增加，使得能夠檢測以前已知方法所不易測到的低水平的酶、抑制劑、輔助因子、活化劑和阻活劑;敏感度定義為最小可檢測量。經(jīng)過這些改進，即可使用本發(fā)明的新的水溶性若丹明110和若道爾衍生物底物，通過凝血酶原時間(PT)的測定、部分活化的組織促凝血酶原激酶(凝血因子Ⅲ)時間(APTT)的測定和血栓形成試驗(TT，thrombotest)來檢測凝血酶。
實施例以下敘述合成水液劑呫噸鎓衍生物底物的方法、分析試驗如果及使用這些底物的實施例。下述實施例并不意味著對本發(fā)明范圍的限定。
除特別指出者外，所使用的所有氨基酸均為L構(gòu)型。以下實施例中所用縮寫符號是Arg＝精氨酸Cbz＝芐氧羰基DMF＝二甲基甲酰胺EDAC＝1-乙基-3-(3′-二甲氨丙基)-碳二亞胺HCIGlt＝戊二酰基Pro＝醋酸Pro＝脯氨酸Pyro＝焦谷氨?；鵖ar＝肌氨酸基在洗脫液和產(chǎn)物的薄層色譜(TLC)分析中，使用預涂布玻璃板，以硅膠60，254(EM，試劑公司)作吸附介質(zhì)。展開薄層色譜使用的是下列溶劑體系S1＝2-丁酮∶丙酮∶H2O;8∶1∶1(V/V)S2＝甲醇∶醋酸∶H2O;9∶0.5∶0.5(V/V)合成底物的合成水溶性呫噸鎓衍生物底物是通過首先制備結(jié)構(gòu)為(H-L-Pro-Arg)2-若丹明110的呫噸衍生物底物來合成的。(H-L-Pro-Arg)2若丹明110的合成完全按Leytus等人介紹的方法進行。
實施例1先有技術步驟Ⅰ在攪拌下，將0.96克(2.62毫摩爾)若丹明110溶于400毫升4℃冰溶下冷卻的二甲基甲酰胺(DMF)與吡啶的混合物(1∶1，V/V)中，爾后于其中加入25.6克(133.5毫摩爾)EDAC。約攪拌1分鐘后，迅速加入溶有11.52克(33.41毫摩爾)Cbz-L-Arg-HCl的96毫升冷DMF∶吡啶(1∶1，V/V)溶液。約24小時后，加1.6升無水乙醚以分離所得產(chǎn)物，隨后以10，000g離心約10分鐘，形成一種油狀產(chǎn)物。將所得油狀產(chǎn)物溶于50毫升冷DMF中，并加1.3升冷丙酮使發(fā)生沉淀。在10，000g離心分離油狀物10分鐘。將油狀物重新溶于50毫升冷DMF并加500毫升冷的1.2N HCl。以10，000g離心10分鐘，分離出一種紅色沉淀物。將此紅色沉淀物溶于50毫升冷甲醇并加350毫升冷乙酸乙酯使之沉淀。以10，000g離心10分鐘收集所得沉淀物，即(Cbz-L-Arg)2-若丹明110。最后一步重復三次。
產(chǎn)量2.08克(+79.4%)(Cbz-L-Arg)2-若丹明110。
步驟Ⅱ?qū)?.4克(3.40毫摩爾)按步驟Ⅰ制備的(Cbz-L-Arg)2-若丹明110溶于75毫升32%HBr-HAc溶液中。所得紅色溶液于室溫(RT)下攪拌約1小時。加800毫升無水乙醚，離心分離所得產(chǎn)物。離心步驟再重復三次后，將所得褐色固體-(H-L-Arg)2-若丹明110真空干燥16小時。
產(chǎn)量3.4克(+100%)(H-L-Arg)2-若丹明110。
TLC，S2∶Rf0.09。
步驟Ⅲ
在攪拌下，將步驟Ⅱ中制備的2.75克(2.79毫摩爾)(H-L-Arg)2-若丹明110溶于在4℃冰結(jié)冷卻的330毫升DMF∶吡啶(1∶1，V/V)溶液內(nèi)，然后加入32克(166.9毫摩爾)EDAC。攪拌約1分鐘以加速溶解，隨后迅速加入溶于60毫升DMF∶吡啶(1∶1)的10.4克(41.7毫摩爾)Cbz-L-脯氨酸的溶液。約24小時后，依步驟Ⅰ的方法分離產(chǎn)物。將所得褐色固體-(Cbz-L-Pro-Arg)2-若丹明110真空干燥16小時。
產(chǎn)量1.86g(52.0%)(Cbz-L-Pro-Arg)2-若丹明110。
TLC，S2∶Rf0.44。
步驟Ⅳ將1.80克(1.40毫摩爾)按步驟Ⅲ制備的(Cbz-L-Pro-Arg)2-若丹明110溶于45毫升32%HBr-HAc溶液內(nèi)，所得紅色溶液在室溫(RT)下攪拌約1小時。按步驟Ⅰ所述的方法，加無水乙醚離心分離所得產(chǎn)物。將所得褐色固體-(H-L-Pro-Arg)2-若丹明110真空干燥16小時。
產(chǎn)量1.90克(+100%)(H-L-Pro-Arg)2-若丹明110。
TLC，S2∶Rf0.03。
實施例Ⅱ制備(H-Sar-Pro-Arg)2-若丹明110的方法步驟A
將按步驟Ⅰ-Ⅳ方法制備的1.90克(1.63毫摩爾)(H-L-Pro-Arg)2-若丹明110溶于190毫升在4℃冰浴中冷卻的1∶1的DMF∶吡啶溶液內(nèi)，然后再加入17.85克(93.1毫摩爾)EDAC。攪拌約1分鐘以加速溶解，隨后迅速加入5.20克(23.3毫摩爾)Cbz-肌氨酸在40毫升DMF∶吡啶(1∶1)中的溶液。約24小時后，按步驟Ⅰ所述的方法分離所得的產(chǎn)物。將所得粉紅色固體-(Cbz-Sar-Pro-Arg)2-若丹明110真空干燥24小時。
產(chǎn)量1.1克(49.6%)(Cbz-Sar-Pro-Arg)2-若丹明110。
步驟B將1.1克(0.78毫摩爾)步驟A中制備的(Cbz-Sar-Pro-Arg)2-若丹明110溶于24毫升32%HBr-HAc溶液中，在室溫下攪拌所得深紅色溶液約1小時。加入350毫升無水乙醚，離心分離所得產(chǎn)物。此步驟再重復三次后，將所得褐色固體-(H-Sar-Pro-Arg)2-若丹明110真空干燥24小時。
(H-Sar-Pro-Arg)2-若丹明110.5 1/2 氫溴酸鹽五水合物的產(chǎn)量為1.00克(84.7%)。
C48H64N14O9·5 1/2 HBr5H2O的元素分析計算值，% 實驗值，%C＝38.00 37.84，38.11H＝5.24 5.17，4.81N＝12.93 12.69，12.76Br＝29.03 29.58
TLC，S2∶Rf0.01。
實施例Ⅲ制備(H-L-Pyro-Pro-Arg)2-若丹明110的方法步驟A把380毫克(0.325毫摩爾)按步驟Ⅰ-Ⅳ方法制備的(H-L-Pro-Arg)2-若丹明110溶解于50毫升在冰浴(4℃)中冷卻的DMF∶吡啶(1∶1)溶液中，然后于其中加入3.58克(18.62毫摩爾)EDAC。攪拌約1分鐘以加速溶解，隨后迅速加入溶于11毫升冷DMF∶吡啶(1∶1)的1.23克(4.66毫摩爾)Cbz-L-焦谷氨酸的溶液。約24小時后，按步驟Ⅰ中所述分離所得產(chǎn)物。將所得褐色固體-(Cbz-L-Pyro-Pro-Arg)2-若丹明110真空干燥16小時。
(Cbz-L-Pyro-Pro-Arg)2-若丹明110的產(chǎn)量為278毫克(57.1%)。
步驟B將78毫克(0.0521毫摩爾)(Cbz-L-Pyro-Pro-Arg)2-若丹明110溶解于3毫升32%的HBr-HAc溶液中，室溫攪拌所得紅色溶液約1小時。加入75毫克無水乙醚離心分離所得產(chǎn)物。該離心步驟再重復三次后，將所得褐色固體-(H-L-Pyro-Pro-Arg)2-若丹明110真空干燥16小時。
(H-L-Pyro-Pro-Arg)2-若丹明110·4 1/2氫溴化物·5 1/2 水合物的產(chǎn)量為57毫克(71.7%)。
C52H66N14O11·4 1/2 HBr。5 1/2 H2O的元素分析計算值，% 實驗值，%C＝40.90 40.54，40.32H＝5.01 5.08，5.06N＝12.85 12.55，12.73Br＝23.60 23.56，實施例Ⅳ制備(Glt-Pro-Arg)2-若丹明110的方法步驟A把110毫克(0.094毫摩爾)按步驟Ⅰ-Ⅳ制備的(H-L-Pro-Arg)2-若丹明110溶于12毫升冰浴(4℃)中冷卻的DMF∶吡啶(1∶1)溶液中，然后加入171毫克(1.5毫摩爾)戊二酸酐。約24小時后，按步驟Ⅰ中所述分離所得產(chǎn)物。將所得褐色固體-(Glt-Pro-Arg)2-若丹明110真空干燥16小時。
(Glt-Pro-Arg)2-若丹明110的產(chǎn)量為118.3毫克(97.5%)。
實施例Ⅴ制備Cbz-Arg-若道爾的方法步驟A在室溫攪拌下，將3.5克(0.54毫摩爾)若丹明110溶于25毫升濃硫酸中，然后在約20分鐘內(nèi)緩緩加入700毫克(1.45毫摩爾)亞硝酸鈉和10毫升濃硫酸的溶液。約16小時后，將所得混合物傾入250克冰水內(nèi)。把所得暗紅色溶液-重氮化合物-加熱至65-70℃并保持約30分鐘，有氮氣放出。不經(jīng)冷卻即過濾所得淺色溶液。冷卻后，過濾所得紅褐色絮狀沉淀，用少量水洗，在90℃真空干燥16小時。經(jīng)TLC分析，該紅褐色絮狀產(chǎn)物-若道爾半硫酸鹽(含量)顯示為75%。
若道爾半硫酸鹽的產(chǎn)量為35克(96%)。
TLC，Si∶Rf0.70。
步驟B將1.4克(3毫摩爾)若道爾半硫酸鹽溶于500毫升冰浴(4℃)冷卻的DMF∶吡啶(1∶1)溶液中，然后加入8.98克(75毫摩爾)EDAC的溶液。約攪拌1分鐘后，迅速加入溶于60毫升DMF∶吡啶(1∶1)溶液的6.55克(19毫摩爾)Cbz-L-Arg-HCl的溶液。約24小時后，按步驟Ⅰ的方法分離所得產(chǎn)物。將所得帶紅褐色的固體-Cbz-L-Arg-若道爾真空干燥16小時。
Cbz-L-Arg-若道爾的產(chǎn)量為0.2克(10%)。
TLC，S1∶Rf0.20。
(Sar-Pro-Arg)2-若丹明110與先有技術中(Cbz-Pro-Arg)2若丹明110的溶解度比較水溶性若丹明110衍生物底物的敏感性提高了的一個實例通過下列數(shù)據(jù)加以說明用水溶性底物-(Sar-Pro-Arg)2-若丹明110和先有技術中的低水溶性底物-(Cbz-Pro-Arg)2-若丹明110測定凝血酶的反應速率。所用的試驗條件完全相同，包括溫度為37℃，體積為1.0毫升，緩沖液為0.10MAces(PH7.0)，含0.05MKCI。因為肌氨?；?Sar)和芐氧羰基(Cbz)有相似的分子量，故兩者的試驗濃度均用100微克(μg)/毫升。需使用15%乙醇以促進(Cbz-Pro-Arg)2-若丹明110的溶解。即使加入15%乙醇，Cbz衍生物底物的溶解度在37℃也只能達到120微摩爾。與此相反，37℃時(Sar-Pro-Arg)2-若丹明110的溶解度高達120毫摩爾，即其溶解度增加了一千倍。
吸光率改變，460毫微米/單位凝血酶/毫升先有技術 本發(fā)明(Cbz-Pro-Arg)2若丹明110 (Bar-Pro-Arg)2-若丹明11080微摩爾 80微摩爾 80微摩爾0.122 1.700 2.872比較先有技術底物與本發(fā)明底物的上列數(shù)據(jù)可見，在摩爾濃度相同時，本發(fā)明的水溶性衍生物底物比先有技術中的低水溶性底物敏感14倍以上。使用較高的水溶性底物濃度時，本發(fā)明的底物比先有技術的底物敏感24倍以上。
使用水溶性呫噸鎓衍生物底物進行的各種分析新的水溶性呫噸鎓衍生物底物可用于分光光度和螢光檢測法測定蛋白水解酶、抑制劑、輔助因子、活化劑和阻活劑的活性。在基于血纖維蛋白凝固的血凝試驗中，該新的水溶性呫噸鎓衍生物底物可代替天然底物-血纖維蛋白原。
為了更充分地了解這一發(fā)明，下面舉出幾個檢測實例。
檢測實施例實施例Ⅰ用(Pyro-Pro-Arg)2-若丹明110對凝血酶進行分光光度分析通過測定468毫微米和496毫微米處吸光率的增加，確定三種不同濃度凝血酶的劑量反應曲線。按下述方法制備凝血酶的工作稀釋液將純化的人α-凝血酶(Dr.John Fenton，N.Y.state Dept.of Health)稀釋成PH8.0的含0.25M NaCl的0.05MHEPES中的濃度為1.04單位/毫升、0.52單位/毫升和0.26單位/毫升的各個稀釋液，并使各稀釋液保持在4℃。將底物(Pyro-Pro-Arg)2-若丹明110溶解為PH8.0的含0.3MKCl的0.20MHEPES中的溶液，其濃度為78微克/毫升。采用光程為1厘米的一次性使用的丙烯酸比色杯(Centaur S
iences，Inc.)。用吸管將1毫升等份的底物吸入比色杯內(nèi)，在一加熱裝置中加溫到37℃。往比色杯內(nèi)加入1毫升工作凝血酶稀釋液的樣品。凝血酶與底物混合后，用Hewlett-Packard 8450B型分光光度計測468毫微米和496毫微米處的吸光率(測30秒)。在此確定的時間間隔內(nèi)增加了吸光率為
吸光率，0-30秒凝血酶，單位/毫升 468毫微米 496毫微米0.26 0.0461 0.04620.52 0.0912 0.08601.04 0.1766 0.1670在各波長測得的吸光率與凝血酶濃度間存在一線性關系相關系數(shù)，γ＝ (468毫微米)/0.9999 (496毫微米)/0.9996在468毫微米和496毫微米測得的吸光率之間的關系是相關系數(shù)，γ＝0.9998。
上述數(shù)據(jù)證明，能夠在468毫微米或496毫微米波長處測到吸光讀數(shù)。
實施例Ⅱ用(Sar-Pro-Arg)2-若丹明110對凝血因子作螢光分析用底物(Sar-Pro-Arg)2-若丹明110，基于活化部分組織促凝血酶原激酶時間(APTT)分析，對凝血因子Ⅷ和Ⅸ進行螢光檢測。用合成的底物代替存在于人和動物血漿中的天然底物血纖維蛋白原檢測凝血酶生成。用正常血漿的測定結(jié)果繪出標準校正曲線。該血漿即得自Curtin Matheson Scientific公司的Thromboscreen，TM用于糾正因子Ⅷ和Ⅸ缺乏血漿(George King Biomedical)。APTT試劑包含有純化的大豆磷脂和鞣花酸活化劑(Dade Diagnostics)。將125微克/毫升的底物樣品溶解于含0.05MKCI和5mM CaCl2的0.10MACES中，PH7.0。用具有溫控吸收池架(37℃)的Turner 430型分光光度計進行動力學螢光檢測。激發(fā)和發(fā)射波長分別定在468毫微米和525毫微米。用玻璃試管完成血漿活化，并用一次性使用的丙烯酸比色杯進行螢光測定。
在試管內(nèi)加入100微升等份的0.85%鹽水或在鹽水中稀釋的正常血漿，然后相繼加入100微升因子缺乏血漿和100微升APTT試劑。將試管在一加熱裝置中于37℃保溫2分鐘，此時向其中加入100微升25mMCaCl2并繼續(xù)保溫30秒鐘。將保溫混合物轉(zhuǎn)移到含2.0毫升底物溶液(預加溫至37℃)的比色杯內(nèi)，并測定螢光速率。得到因子Ⅷ和Ⅸ的線性劑量反應曲線(正常的1%和100%之間的水平)相對螢光＊血漿稀釋度 因子水平，%正常 因子Ⅷ 因子Ⅸ- ＜1 0.119 0.1211∶250 1 0.121 0.1271∶25 10 0.148 0.1541∶25 100 0.333 0.333＊除了激發(fā)和發(fā)射波長分別為350毫微米時外，在同樣測定條件下，0.85微克硫酸喹寧/毫升0.1NH2SO4的相對螢光為1.0。
實施例Ⅲ用(Sar-Pro-Arg)2-若丹明對血纖維蛋白溶酶原進行分光光度分析測定血漿樣品中鏈激酶活化的血纖維蛋白溶酶原，將結(jié)果與Pochron，S.P.等人的標準螢光分析法(Pochron，S.P.et al，Thrombosis Research 13，733-739，1978)相比較。將得自Hyland Diagnostics公司的冷融的正常檸檬酸化血漿用于分析標準校正曲線的繪制，將鏈激酶(Calbiochem-Behring公司)在0.02M HEPES中重新配成2000單位/毫升(PH 7.5)。將(Sar-Pro-Arg)2-若丹明110溶解于含0.05MKCL的0.10M ACES(PH 7.0)中，至濃度為375微克/毫升。分析過程是將每份20毫升血漿樣品及50微升H2O加入半微量一次性使用的比色杯(光程1厘米，Evergreen Scientific公司產(chǎn)品)內(nèi)。在一加熱裝置中加溫至37℃后，向其中加入500微升鏈激酶溶液并混合之，隨后于37℃保溫2分鐘零48秒。之所以將活化時間定為2分48秒，是因為它是COULTER
DACOS
化學系統(tǒng)的固定計時增量。在大約2分鐘時血纖維蛋白溶酶原完全活化，但活化時間亦可長達15分鐘。以后在37℃加入500微升-等份的底物溶液，混合后，使用Hewlett-Packard 8450A型分光光度計于460毫微米波長檢測其吸光率，測3分鐘。以使鏈激酶充分發(fā)揮活性。與對照血漿檢測結(jié)果比較，血纖維蛋白溶酶原以%正常值來表示。12份血漿樣品的結(jié)果，讀數(shù)為40-140%正常，比與參比分析結(jié)果十分相近。比較數(shù)據(jù)的相關系數(shù)為γ＝0.990，最小二乘方程(the least squares equation)按y＝0.956x+4.08計算。
實施例Ⅳ用(Sar-Pro-Arg)2-若丹明110以分光光度法測定凝血酶原時間用凝血酶原時間(PT)用于監(jiān)測血凝的非固有途徑。該試驗是將組織促凝血酶原激酶加入血漿樣品內(nèi)，導致凝血因子蛋白酶的活化，以最終形成血纖維蛋白凝塊。測定血凝塊形成速率，該速率與血漿樣品中的非固有凝血因子活性直接相關。在這一試驗中，可用合成底物(Sar-Pro-Arg)2-若丹明110代替天然底物-血纖維蛋白原。最后的非固有途徑凝血因子-凝血酶是通過合成底物檢測的。
底物是在濃度為40μM，PH為7.5的0.05M Aces緩沖液中制得的。以每毫升底物0.05毫升的比例，將組織促凝血酶原激酶加入含底物的緩沖液中，并將混合物加溫至37℃。在光程為1厘米的半微量丙烯酸比色杯(Evergreen Scientific公司)內(nèi)加入25微升血漿樣品。在含有血漿樣品的比色杯內(nèi)加入0.5毫升組織促凝血酶原激酶底物混合物，并用Hewlett-Packard 8450A型分光光度計測定496毫微米處吸光率的改變。對56份病人血漿樣品-其中包括部分接受了抗凝劑肝素和(或)香豆定(coumadin)的病人的樣品-用合成底物進行試驗，其結(jié)果同血塊形成的凝血酶原時間相比較。試驗中使用了三種商品組織促凝血酶原激酶試劑即General Diagnostics、Ortho Diagnostics和Dade Diagostics公司的產(chǎn)品。用Coag-a-Mate
2001-光學照相凝血檢測系統(tǒng)(General Diagnostics公司)檢測病人樣品，測得凝固時間為9.8至40.6秒。合成底物試驗結(jié)果與血凝分析值反相關，用三種組織促凝血酶原激酶所得對比數(shù)據(jù)的相關系數(shù)為-0.944、-0.953和-0.963。
實施例Ⅴ用(Sar-Pro-Arg)2-若丹明110以分光光度法測定抗凝血酶Ⅲ-肝素輔助因子使用水溶性底物(Sar-Pro-Arg)2-若丹明110和Mitchell等人的參比螢光底物分析法(Thrombosis Research 12，219-225，1978)檢測血漿樣品中的抗凝血酶Ⅲ，比較所得結(jié)果。向半微量一次性使用的聚苯乙烯比色杯(光程1厘米，Evergreen Scienfific公司出品)內(nèi)加入5微升血漿和50微升純化水。加溫至370℃后，再加入含有5單位/毫升凝血酶和10單位/毫升肝素、溶于緩沖鹽水的0.5毫升一份的溶液。將該混合物于37℃保溫2分48秒。采用2分鐘48秒的活化時間是因為它是COULTER DACOS系統(tǒng)的固定時間增量。于比色杯內(nèi)加入500微升水溶性底物的溶液，底物系溶于含0.05M KCL的0.1M ACES(PH 7.0)中，其濃度為375微克/毫升(37℃)。于460毫微米波長測定吸光率改變，測20秒鐘?？鼓涪笏綖檎Ｖ档?0-115%的26份血漿樣品的測定結(jié)果與參比分析值密切相關。比較數(shù)據(jù)的相關系數(shù)為γ＝0.983，最小二乘方程y＝1.026x-2.90計算。
亦可按Dr.P.A.Owren首先描述的方法(Lancet Ⅱ，754-758，1959)，通過人所熟知的血栓形成試驗(thrnmbotest)，用該新的水溶性呫噸鎓衍生物底物同時監(jiān)測非固有的和固有的凝血酶形成途徑。血栓形成試驗對非固有和固有途徑的各因子均很敏感，而且由這兩種途徑產(chǎn)生的凝血酶差不多相等。血栓形成試驗的試劑包括組織促凝血酶原激酶、部分的組織促凝血酶原激酶、吸附了的血漿和血纖維蛋白原。在該試驗中，新的水溶性呫噸鎓衍生物底物可代替天然底物-血纖維蛋白原，以檢測已形成的凝血酶的活性。
在各種凝血試驗-凝血酶原時間、活化的部分組織促凝血酶原激酶和血栓形成試驗中可以使用水溶性若丹明110和若道爾衍生物底物，這一點在上述實施例中得到了支持。
雖然本文中給出并詳細描述了本發(fā)明的特定實施方案和實施例，但決不是要由此限制本發(fā)明的范圍。相反地，本發(fā)明通過本說明書和待審批的權利要求
，在不違反本發(fā)明之精神實質(zhì)和范圍的前提下，概括了本發(fā)明主題所涉及的所有改動、替代、實施方案、應用和等價內(nèi)容。
文件名稱 頁 行 補正前 補正后說明書 16 倒1 “以使” 刪去17 1 “鏈激酶充分發(fā)揮活性” 刪去1 比較， 比較，鏈激酶(活化的)1 原 原活性
權利要求
1.一種選自
以及它們的酸鹽的呫噸鎓衍生物底物的制備方法，其中R1是增加水溶性的基團，選自肌氨酰基、焦谷氨?；臀於；?，R2是呫噸鎓，3′，6′-二氨基-9′-(2-羧苯基)，R3是呫噸鎓，3′-氨基-6′-羥基-9′-(2-羧苯基)。
2.根據(jù)權利要求
1的方法，其中R1是肌氨?；?br>3.根據(jù)權利要求
1的方法，其中R1是焦谷氨?；?br>4.根據(jù)權利要求
1的方法，其中R1是戊二酰基。
5.一種測定含有蛋白水解酶、抑制劑、輔助因子、活化劑和阻活劑-它們單獨或以結(jié)合形式存在-中至少一種的樣品的活性的方法，該方法包括步驟將如權利要求
1中所列舉的呫噸鎓衍生物底物與至少含有一種所說的蛋白水解酶、抑制劑、輔助因子、活化劑和阻活劑的樣品相混合并靜置該混合物足夠時間，以得到能夠用來測定所說樣品中活性的水解產(chǎn)物。
6.根據(jù)權利要求
5的方法，其中所說的蛋白酶包括血纖維蛋白溶酶原，該法還包括下述步驟在所說的樣品與所說的底物相混合前，將所說的蛋白水解酶預活化。
7.根據(jù)權利要求
5的方法，其中所說的抑制劑包括抗凝血酶Ⅲ，該法還包括下述步驟所說的含凝血酶樣品在與所說的底物混合之前預保溫。
8.根據(jù)權利要求
7的方法，包括下述步驟用熒光和分光光度法中至少一種手段測定所說樣品的活性。
9.根據(jù)權利要求
5的方法，包括下述步驟測定所說樣品的活性。
10.根據(jù)權利要求
9的方法，其中所說的樣品中含有所說的蛋白水解酶、抑制劑、輔助因子、活化劑和阻活劑中的至少兩種，該方法還還包括下述步驟用組織促血酶原激酶處理所說的底物并測定所形成之凝血酶的活性。
11.根據(jù)權利要求
9的方法，其中所說的樣品中含有所說的蛋白水解酶、抑制劑、輔助因子、活化劑和阻活劑中的至少兩種，該法還包括下述步驟用活化的部分組織促凝血酶原激酶處理所說的底物并測定所形成之凝血酶的活性。
12.根據(jù)權利要求
9的方法，其中所說的樣品含有所說的蛋白水解酶、抑制劑、輔助因子、活化劑和阻活劑中的至少兩種，該方法還包括如下步驟用組織促凝血酶原激酶、部分組織促凝血酶原激酶和吸附了的血漿來處理所說的底物，并測定由非固有和固有途徑所產(chǎn)生的凝血酶活性。
13.在一種制備呫噸鎓衍生物底物的方法中采取的如下步驟選擇式為(Cbz-Pro-Arg)2-若丹明110的呫噸鎓衍生物底物并用選自肌氨?；?、焦谷氨?；拔於；茉黾铀苄缘幕鶊F替代Cbz團。
專利摘要
在沒有使用有機溶劑添加劑和
或
特殊水增溶劑的情況下，可用水溶性呫噸衍生物底物若丹明110和若道爾，以分光光度和螢光測定法檢測胰蛋白酶樣酶。這些新的底物表現(xiàn)增加了檢測低水平胰蛋白酶樣酶——如蛋白水解酶、輔助因子、溶化劑、阻活劑及抑制劑等的敏感度?？捎眠@些底物代替血纖維蛋白原，以監(jiān)測血液凝固的途徑。
文檔編號C07K5/08GK86103598SQ86103598
公開日1987年2月25日 申請日期1986年5月26日
發(fā)明者加里·A·米特凱爾, 格拉德·E·扎夫, 馬里利恩·M·索洛薩諾 申請人:科特電子公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan