專利名稱:一株適合純生啤酒釀造的蛋白酶a缺陷型酵母及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一株適合純生啤酒釀造的蛋白酶A缺陷型酵母及使用方法，本發(fā)明涉及針對解決純生啤酒泡沫穩(wěn)定性差而從生產(chǎn)菌株出發(fā)改造而得的一株蛋白酶A缺陷型工業(yè)酵母，以及其實(shí)際使用的配套關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
純生啤酒是指采用無菌釀造、無菌過濾、無菌包裝生產(chǎn)的新興的非巴氏殺菌的啤酒品種。由于在生產(chǎn)過程中沒有經(jīng)過熱殺菌，避免了加熱造成的風(fēng)味物質(zhì)變化和營養(yǎng)成分的破壞，保持了啤酒的新鮮口味和成分。與普通啤酒相比，純生啤酒更純正、更爽口、更新鮮、營養(yǎng)更豐富，該啤酒已成為啤酒消費(fèi)的新潮。
由于純生啤酒未經(jīng)過巴氏殺菌，釀造過程中酵母分泌的蛋白酶會使成品啤酒仍具有酶活，進(jìn)而在貯存過程中分解泡沫蛋白，造成其在貯存過程中泡沫衰減，達(dá)不到國標(biāo)的要求，影響飲用的感官，破壞產(chǎn)品形象。酵母能分泌多種蛋白酶，主要有蛋白酶A、蛋白酶B、羧肽酶Y和S，氨肽酶Co和I等。而在酸性條件下只有酵母蛋白酶A(E.C.3.4.23.25)的活性最高，其對啤酒泡沫穩(wěn)定性的負(fù)面影響已被國內(nèi)外專家證實(shí)。
將生產(chǎn)菌株改造成蛋白酶A缺陷型，是解決純生啤酒在貯存期泡沫下降的根本途徑。國外有將單倍體營養(yǎng)缺陷型實(shí)驗室酵母改造成蛋白酶A缺陷型酵母的報道，但國內(nèi)外尚無將二倍體生產(chǎn)菌株成功改造成蛋白酶A缺陷型酵母的報道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的得到一株可在純生啤酒釀造中應(yīng)用的蛋白酶A缺陷型的工業(yè)酵母菌株，并提出其在實(shí)際應(yīng)用中的配套關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)。
本發(fā)明的技術(shù)方案一株適合純生啤酒釀造的蛋白酶A缺陷型酵母，其分類命名為下面發(fā)酵釀酒酵母(Saccharomyces Carlsbergensis)QD06-2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No1858，該菌株為通過基因改造獲得的不帶任何外源基因的蛋白酶A缺陷型的二倍體釀酒酵母，在啤酒釀造過程中不分泌蛋白酶A，其它發(fā)酵性能正常。
用菌株CGMCC No1858進(jìn)行純生啤酒釀造的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)為(1)生產(chǎn)用定型麥汁麥芽∶大米為7∶3，浸出法糖化，最終麥汁濃度控制為11°P；麥汁的α-氨基氮含量不低于200mg/100mL，充氧量達(dá)12mg/L，麥汁接種量QD06-2酵母細(xì)胞濃度1.8×106～2.1×106個/mL；(2)酵母回收使用在釀造過程中酵母建議使用代數(shù)不超過8代，不能有雜菌污染；(3)其它釀造參數(shù)同普通菌株純生啤酒釀造過程。
分析方法蛋白酶A測定的方法取1500μL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH5.5)于一玻璃試管中，加入1368μL去離子水，加入待測樣品120μL，最后加入12μL的1mM熒光底物MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu(Dnp)-NH2。試樣混合均勻，放入30℃水浴鍋，反應(yīng)30min后，放入80℃水浴鍋滅活5min，快速冷卻到室溫，用熒光光度計測量熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長Ex328nm，發(fā)射波長Em393nm。空白樣品用去離子水代替樣品。啤酒樣品需要震蕩除氣處理。當(dāng)樣品為發(fā)酵液時，用雙層濾紙過濾。
蛋白酶A活力單位的定義在25℃，pH為6.0下，每分鐘水解1mg胰島素的氧化B鏈，為一個活力單位(unit)。
其它指標(biāo)的測定參見國標(biāo)。
本發(fā)明的有益效果結(jié)果顯示，該菌發(fā)酵速度正常，生產(chǎn)出來的啤酒口味純正，理化指標(biāo)合理，雙乙酰還原速度較快。釀造過程中酵母的增殖和凝聚性較好，便于酵母回收，圖1為5次該菌株發(fā)酵過程中酵母數(shù)目的變化圖，可見重顯性好，性能穩(wěn)定。蛋白酶A的活性跟蹤檢測值均為零，表明釀造過程中該菌株不分泌蛋白酶A。所生產(chǎn)的成品純生啤酒的理化指標(biāo)合理。符合國標(biāo)要求，見表1。成品啤酒的泡持時間，在保值期內(nèi)能始終高于國標(biāo)要求，6個月后仍大于230秒，泡持測定的跟蹤值見圖2。本發(fā)明可以獲得具有與熟啤酒泡沫穩(wěn)定性一致的純生啤酒，解決了現(xiàn)有純生啤酒泡沫穩(wěn)定性差的行業(yè)難題，該菌株使用方法適合在純生啤酒生產(chǎn)中推廣和應(yīng)用。
圖1CGMCC No1858菌株5次發(fā)酵過程中酵母數(shù)目的變化圖。
圖2啤酒的泡持時間在保質(zhì)期內(nèi)的變化。
生物材料樣品保藏一株適合純生啤酒釀造的蛋白酶A缺陷型下面發(fā)酵釀酒酵母(Saccharomyces Carlsbergensis)QD06-2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱為CGMCC，保藏編號為No1858，保藏日期2006年11月22日。
具體實(shí)施方式實(shí)施例1用CGMCC No1858釀造純生啤酒(1)種子和擴(kuò)培液11°P全麥芽麥汁。
(2)生產(chǎn)用定型麥汁麥芽∶大米＝7∶3，浸出法糖化，最終麥汁濃度控制為11°P；麥汁的α-氨基氮含量不低于200mg/100mL，充氧量達(dá)12mg/L，麥汁接種量QD06-2酵母細(xì)胞濃度1.8×106-2.1×106個/mL。
(3)發(fā)酵條件主酵控溫9.5±0.5℃，降糖至4.2～4.5°P時升溫至12℃還原雙乙酰；降糖至3.5～4.0°P，封罐保壓0.01Mpa。
(4)貯酒升溫4天后回收酵母，雙乙酰降至0.06mg/L后，降溫至0℃；一天后排廢酵母，以后貯酒期間每三天排酵母一次。
(5)膜過濾、包裝0℃貯酒7-10天后，用純生膜濾酒，無菌包裝。
(6)酵母回收使用在釀造過程中酵母建議使用代數(shù)不超過8代，不能有雜菌污染。
酵母的增殖和回收釀造過程中酵母的增殖和凝聚性較好，便于酵母回收，圖1為該菌株5次發(fā)酵過程中酵母數(shù)目的變化圖，可見重顯性好，性能穩(wěn)定。蛋白酶A的活性跟蹤檢測值均為零，表明釀造過程中該菌株不分泌蛋白酶A。所生產(chǎn)的成品純生啤酒的理化指標(biāo)合理。符合國標(biāo)要求，見表1。
表1所得成品啤酒的理化指標(biāo)(主要依據(jù)GB/T4928-2001測定)
實(shí)施例2泡持測定跟蹤成品啤酒的泡持時間，在保值期內(nèi)能始終高于國標(biāo)要求，6個月后仍大于230S，泡持測定的跟蹤值見圖2。
權(quán)利要求
1. 一株適合純生啤酒釀造的蛋白酶A缺陷型酵母，其分類命名為下面發(fā)酵釀酒酵母(Saccharomyces Carlsbergensis)QD06-2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No1858，該菌株為通過基因改造獲得的不帶任何外源基因的蛋白酶A缺陷型的二倍體釀酒酵母，在啤酒釀造過程中不分泌蛋白酶A，其它發(fā)酵性能正常。
2.用權(quán)利要求
1所述菌株CGMCC No1858進(jìn)行純生啤酒釀造的使用方法，其特征是關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)為1)生產(chǎn)用定型麥汁麥芽∶大米為7∶3，浸出法糖化，最終麥汁濃度控制為11°P；麥汁的α-氨基氮含量不低于200mg/100mL，充氧量達(dá)12mg/L，麥汁接種量QD06-2酵母細(xì)胞濃度1.8×106～2.1×106個/mL；2)酵母回收使用在釀造過程中酵母建議使用代數(shù)不超過8代，不能有雜菌污染；3)其它釀造參數(shù)同普通菌株純生啤酒釀造過程。
專利摘要
一株適合純生啤酒釀造的蛋白酶A缺陷型酵母及使用方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明菌株為下面發(fā)酵釀酒酵母(Saccharomyces Carlsbergensis)QD06－2，保藏編號為CGMCC No1858。該菌為二倍體工業(yè)菌株的蛋白酶A缺陷型改造株，不含任何外源基因，在啤酒釀造過程中不分泌蛋白酶A，發(fā)酵性能正常，釀造的配套關(guān)鍵控制技術(shù)參數(shù)為11°P麥汁，α－氨基氮不低于200mg/100mL，充氧達(dá)12mg/L，麥汁接種量為酵母細(xì)胞濃度1.8×10
文檔編號C12C11/02GK1995324SQ200610155976
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月27日
發(fā)明者李崎, 鄭飛云, 郝俊光, 李永仙, 顧國賢, 蔣凱 申請人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan