專利名稱:重組人纖溶酶原Kringle 5(hk5)生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，特別是涉及一種重組人纖溶酶原h(huán)K5(HumanPlasminogen Kringle 5)的生產方法，以及用于該方法的表達載體和宿主菌株。
背景技術：
腫瘤是一類常見病和多發(fā)病，對人類的生命和健康威脅很大。全世界每年約有500萬人死于腫瘤。在有些國家，腫瘤已占據死亡原因的第二位，甚至第一位。
惡性腫瘤細胞，包括癌和肉瘤的細胞，通稱為癌細胞。癌細胞是從相應正常組織的細胞轉變而來，它既不同于正常細胞，又不同程度地保持著來源組織細胞的某些固有特征。對大多數惡性腫瘤，很容易錯過早期發(fā)現(xiàn)的機會，可以作出臨床診斷時，癌細胞往往已經經歷了10-30次倍增，細胞數達到百億甚至千億，重10-100g，直徑22-47mm。當到達40次倍增時，已發(fā)展到萬億個癌細胞，重約1kg，直徑100mm；而正常成年人大約有50萬億個細胞(5×1013)，此時的癌足以使宿主致死。
五十多年來，在腫瘤治療領域占主導地位的是直接策略，即所選擇的靶目標是腫瘤細胞本身。體外能夠殺死腫瘤細胞的細胞毒藥物被用作體內化療侯選藥物。直到現(xiàn)在，癌癥病人仍主要依賴手術或放療來切除腫瘤或使原發(fā)瘤消退，再緊接著進行放化療，以消除體內殘留的癌細胞。然而，正常細胞也對化療藥物敏感，而且癌細胞的遺傳不穩(wěn)定，經常暴露于化療下最終導致抗藥性。腫瘤治療的另一方法是間接策略，即抗血管生成治療，它不直接破壞腫瘤，而是通過限制腫瘤的血液供給，使腫瘤阻止腫瘤生長或使其消退。應用這一策略，腫瘤學家的注意力就不僅僅局限于單獨的腫瘤細胞本身，而是總體腫瘤組織，尤其是血管生成過程?；谶@種概念，人們采用新方法來尋找新型抗癌藥物。
70年代Folkman提出腫瘤是一個涉及腫瘤細胞和內皮細胞交叉旁相互作用的生態(tài)系統(tǒng)，血管生成對腫瘤從小的細胞簇轉化為大的惡性腫瘤，以及腫瘤的轉移都很關鍵。通過抑制新生血管形成，腫瘤可能會由此產生“饑餓”而導致死亡。在1989年，第一次開始抗血管生成藥物的臨床試驗—將IFN-α用于治療嬰幼兒血管瘤。目前已發(fā)現(xiàn)Angiostatin、K5、endostatin、vasostatin、VEGF單克隆抗體等都能抑制或完全阻斷小鼠腫瘤的生長。許多抗血管生成試劑，如Marimastat、Primostat、Neovastat、Bay-12-9566m、IFN-α、SU101、retinoids、IM862都已進入或正進行III期臨床試驗，而MMPs抑制劑、VEGF/R抑制劑、Endostatin、somatostatin結構類似物、COX-2抑制劑等也在臨床或基礎研究中取得令人振奮的結果。
纖溶酶原含有5個Kringle結構域，其蛋白水解片段顯示具有抗血管增生的活性。纖溶酶原Kringle5(K5)能抑制內皮細胞增生，且其活性比血管抑素即(Kringle1～4，angiostatin更強)。而且，K5也抑制內皮細胞遷移。而內皮細胞遷移在血管生成過程中是一個很重要的過程。近期發(fā)現(xiàn)，K5能抑制視網膜血管增生，可能具有潛在的治療糖尿病性視網膜病(早產兒視網膜病和年齡相關性黃斑變性等疾病的價值。K5通過誘導細胞周期停滯而發(fā)揮作用，具有高效、高細胞選擇性以及短的氨基酸序列的特點，因此具有治療血管增生性疾病的潛在臨床應用價值。
與傳統(tǒng)的抗腫瘤化療藥物比較，K5屬于抗血管生成療法，不產生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，對BCE細胞的半數致死濃度(ED50)約為50-60nM，遠遠低于angiostatin的140nM。因此，K5似乎比angiostatin更能抑制bFGF刺激的BCE細胞生長。用大腸桿菌表達正確折疊的重組鼠K5，抑制活性與水解片段得到的人K5相似。在內皮細胞遷移方面，重組K5蛋白同樣具有抑制作用，其IC50約為500nM。K5的發(fā)現(xiàn)，可更好地了解Pgn的聯(lián)環(huán)區(qū)在抑制內皮細胞增生方面的作用。活性測定表明，hK5可顯著抑制內皮細胞增殖和新生血管形成。更加令人振奮的是，酵母表達的重組hK5在小鼠體內表現(xiàn)了良好的抗腫瘤活性。
目前國內外多采用大腸桿菌表達hK5，表達產物或是沒有活性，需要復雜的變復性工藝才能獲得純品；或是表達量低，不適合產業(yè)化。而本發(fā)明通過在體外構建攜帶多拷貝表達盒的重組質粒(該重組質粒含有一種甲醇誘導啟動子)，篩選多基因位點整合多拷貝表達盒的工程菌，并通過發(fā)酵工藝的改進，同時簡便純化工藝，獲得高表達、高得率、極具產業(yè)化價值的一種hK5生產方法。

發(fā)明內容本發(fā)明的目的就是提供一種高效和/或簡便/安全的生產hK5的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用于該方法的表達載體、宿主細胞和相關序列。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種編碼人纖溶酶原Kringle 5的核苷酸序列，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的纖溶酶原Kringle 5編碼區(qū)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上(更佳地98％以上)以上相同性。
在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列(包括DNA)選自下組(a)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列和位于上游的α因子信號肽編碼序列構成的核苷酸。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達載體，本發(fā)明上述的編碼人纖溶酶原Kringle 5的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達載體是pPIC9K/8α-K5。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達載體攜帶2-8個表達人纖溶酶原Kringle 5的表達盒，且在所述載體的BamHI/BglII位點插入了人纖溶酶原h(huán)K5的編碼序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種工程細胞，它是通過上述的表達載體或本發(fā)明上述的序列轉化宿主細胞后同源重組而得的，且染色體中整合有人纖溶酶原Kringle 5編碼序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的工程細胞是畢赤酵母(Pichia Pastoris)。
在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母細胞的染色體中整合有2-40個拷貝的人纖溶酶原h(huán)K5的編碼序列，并且在在甲醇誘導下表達人纖溶酶原h(huán)K5。
在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母的hrK5的表達水平大于或等于500mg/L發(fā)酵液，較佳地大于或等于800mg/L發(fā)酵液，更佳地大于或等于1000mg/L發(fā)酵液。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產人纖溶酶原Kringle 5的方法，它包括以下步驟(a)在適合表達條件下，培養(yǎng)上述的工程細胞，從而分泌表達人纖溶酶原Kringle 5，所述的工程細胞是畢赤酵母；(b)分離純化出表達的人纖溶酶原Kringle 5。
在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母細胞的基因組中整合有2-40拷貝的人纖溶酶原Kringle 5編碼序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母工程細胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中的培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)分為培養(yǎng)階段和誘導階段，培養(yǎng)階段培養(yǎng)菌液濃度達到OD600為40-200，誘導期時間為24-120hr，發(fā)酵及誘導溫度保持在28-30℃，微量元素PTM1量為1-20ml/L，誘導期的pH值為3-9，誘導期甲醇濃度控制在0.5-5％。
在另一優(yōu)選例中，在培養(yǎng)時還添加添加0.1-5wt％(更佳地1-3％)蛋白胨作為保護劑。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)的分離條件包括(i)對發(fā)酵樣品通過離心和/或過濾去除菌體，獲得發(fā)酵上清液；(ii)通過鹽析和/或超濾對發(fā)酵上清進行濃縮，獲得濃縮液；(iii)對濃縮液進行層析純化，所述的層析純化選自陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和層析、及其組合，從而獲得純度達到95-99.9％的純品。
在另一優(yōu)選例中，提供了一種生產重組人纖溶酶原h(huán)K5的方法，該方法包括步驟(i)在胞外構建攜帶多拷貝表達盒的重組質粒；(ii)在適合的條件下，轉染畢赤酵母，使畢赤酵母細胞的基因整合多拷貝人纖溶酶原h(huán)K5的編碼序列，且在更適合的條件下，工程菌的多個基因位點內均整合多拷貝人纖溶酶原h(huán)K5的編碼序列；(iii)在適合的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)畢赤酵母工程細胞，該工程細胞的基因整合有多拷貝的纖溶酶原h(huán)K5編碼序列，添加誘導劑甲醇后，能大量表達出人纖溶酶原h(huán)K5；(iv)分離純化出步驟(c)中表達的hK5。
圖1是本發(fā)明α-K5融合基因的獲得示意圖。圖中用PCR的方法分別獲得釀酒酵母α-因子前導肽序列與K5基因，同時引入特定的酶切位點(XhoI與EcoRI)，用XhoI消化分別消化，連接，以連接液為模板用一對引物PCR擴增，從而獲得α-K5融合基因。
圖2是單拷貝重組質粒pPIC9K/α-K5的構建示意圖。圖中采用EcoRI消化pPIC9K質粒與α-K5融合基因，連接，構建插入方向正確的重組質粒pPIC9K/α-K5。
圖3是斑點雜交檢測高抗性工程菌的hK5基因拷貝數。以K5基因作探針進行點雜交實驗，圖中1為高抗性篩選獲得的工程菌基因組DNA的雜交結果，2為低抗性工程菌基因組DNA的雜交結果，3為畢赤酵母宿主細胞GS115基因組DNA的雜交結果，4為pPIC9K/8α-K5質粒DNA的雜交結果。結果表明，高抗性篩選得到的陽性克隆具有較高的K5基因拷貝數，而畢赤酵母宿主細胞畢赤酵母宿主細胞GS115(陰性對照)則未檢測到K5基因。
圖4是hK5的生物活性檢測結果，即對Ecv304人臍靜脈內皮細胞的抑制結果(×100)。其中A用PBS處理的對照細胞；B用0.2μg/孔的hK5處理的細胞；C用5μg/孔的hK5處理的細胞；D用20μg/孔的hK5處理的細胞。
圖5是hK5對Vero、OB、KMB17細胞的作用結果，其中A.用PBS處理的Vero細胞；B.用20μg/孔的hK5處理的Vero細胞；C.用OB處理的OB細胞；D.用20μg/孔的hK5處理的OB細胞；
E.用PBS處理的KMB17細胞；F.用20μg/孔的hK5處理的KMB17細胞。
具體實施方式本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的生產技術中人纖溶酶原Kringle 5的表達量低的主要原因之一是基因序列未經優(yōu)化。本發(fā)明人通過基因編碼序列的優(yōu)化設計，將優(yōu)化后的人纖溶酶原Kringle 5編碼序列(SEQ ID NO1)轉入甲醇利用型畢赤酵母(P.pastoris)，從而實現(xiàn)了rhK5的高水平分泌表達rhK5，在此基礎上完成了本發(fā)明。
在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明人還在胞外構建了攜帶多拷貝表達盒的重組質粒，該表達載體有助于進一步提高hK5表達產物。
在另一優(yōu)選例中，還通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，不僅提高了hK5表達量，而且簡化了分離純化工藝，在此基礎上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的，特別適合在酵母細胞中表達的人rhK5編碼序列。該序列是根據畢赤酵母密碼子偏愛性等原則而設計出的。設計出的rhK5的編碼序列用常規(guī)方法進行全基因合成，或在通過PCR方法獲得的cDNA上進行點突變。
在優(yōu)化基因的5′端與3′端分別引進特異性酶切位點，用分子克隆的常規(guī)方法，將優(yōu)化基因克隆入表達載體(如pPIC9、pPIC9K等)。然后，轉化、整合入P.pastoris宿主細胞染色體，利用常規(guī)方法(如G418抗性或Southern印跡法)選出高拷貝轉化株，搖瓶表達選出高表達工程細胞。工程細胞可以是快速利用甲醇型(Mut+)或慢速利用甲醇型(Muts)。
整合入畢赤酵母染色體(或基因組)中的rhK5編碼序列的拷貝數沒有特別限制，可以為1-50個或更高，通常為2-40個，較佳地為3-30。
在獲得工程細胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細胞。凡適合于畢赤酵母生長、表達的培養(yǎng)基都可用于本發(fā)明。
hK5氨基酸序列是已知的，如SEQ ID NO2所示，編碼一個全長98個氨基酸的蛋白質(SEQ ID NO2)。
本發(fā)明的hK5的編碼序列，是根據文獻報道的hK5cDNA序列，依據酵母遺傳密碼偏愛性進行優(yōu)化，然后進行全基因合成。
適用于本發(fā)明的載體為表達質粒pPIC9K/8α-K5。
適用于本發(fā)明的宿主菌是P.pastoris。
通常，在hK5編碼序列的5’端與3’端引入特異性酶切位點，與釀酒酵母α-因子前導肽序列以正確的框架進行融合，然后克隆入質粒pPIC9K，構建多拷貝表達盒的重組質粒，轉化畢赤酵母宿主菌如P.pastoris GS115，加壓篩選，以獲得多基因位點插入多拷貝表達盒。通常篩選出的陽性菌株使之生長在加壓因子濃度遞增的培養(yǎng)平板上。挑選抗性最強的菌株，確定為工程菌。本發(fā)明的工程菌屬于甲醇誘導型表達菌株。
在發(fā)酵表達hK5后，對表達的hK5進行分離。
表達的rhK5存在于培液上清，表達水平占發(fā)酵液上清總蛋白50％以上，使純化復雜度大大下降。通常，發(fā)酵樣品先以離心、過濾等方式獲得發(fā)酵液上清，去除菌體。發(fā)酵液上清可通過鹽析、超濾等方法進行初步純化后再進行層析純化，也可直接進行層析純化。
適用于本發(fā)明的層析技術包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
(a)凝膠過濾層析樣品超濾濃縮后，可以用凝膠過濾層析去鹽及純化。
(b)離子交換層析(陽離子交換層析、陰離子交換層析)樣品的緩沖系統(tǒng)以稀釋、超濾、沉淀后復溶、透稀或凝膠過濾層析等手段進行更換，直至與對應的離子交換柱平衡液系統(tǒng)相似，且電導水平與緩沖液的電導水平接近，直接上樣，鹽濃度梯度或pH梯度梯度洗脫。
(c)親和層析選擇肝素親和凝膠介質，鹽梯度或肝素梯度洗脫。
經過2-3步純化，可得到hK5純品，純化得率30％以上，純度95％以上，純品得率約1.5g/L發(fā)酵上清液。
純化后的hGH可用常規(guī)方法制成各種劑型，如凍干粉針劑。選擇一定的穩(wěn)定劑，同時還可添加表面活性劑、抗氧化劑等保護劑，及適當緩沖液進行冷凍干燥。得到的制品具有活性損失小、水分含量低、穩(wěn)定性好、易于長期保存等特點。
rhK5還可做成水針劑、噴霧劑、微球緩釋劑，以及經PEG修飾制成長效制劑等。
在本發(fā)明的一個實例中，在體外構建了攜帶多拷貝表達盒的重組質粒，同時構建高效、穩(wěn)定表達的hK5工程菌(畢赤酵母)。經發(fā)酵培養(yǎng)，甲醇誘導，hK5以可溶形式分泌到發(fā)酵液上清；表達水平高，占總蛋白70％左右，表達量達5g/L發(fā)酵上清液。由于表達水平較高，hK5又具有天然活性，避免了復雜的復性過程，通過簡便、快速的二步純化方法，即獲得高質量的hK5純品，每升發(fā)酵液可得hK5純品1.5g，產品純度95％以上。
在本發(fā)明的另一個實例中，用上述攜帶多拷貝表達盒的重組質粒構建的高效、穩(wěn)定表達的hK5工程菌(畢赤酵母)，與含天然K5序列的重組質粒構建的構建的高效、穩(wěn)定表達的hK5工程菌(畢赤酵母)表達量進行比較，通過比較，表明在相同表達條件下，優(yōu)化序列有助于K5表達量的顯著提高。
純化后原液加入適當輔料，制成hK5的注射用粉針劑。
中試研究表明，產品制造工藝穩(wěn)定，操作簡單，周期短，成本低，每升發(fā)酵上清液可獲得hK5純品1.5g，采用300升(或者3個100升)發(fā)酵罐，每批可生產300g。適合產業(yè)化生產。
本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)表達工藝簡單，表達載體含有甲醇誘導的啟動子，被甲醇誘導后能高效分泌表達人纖溶酶原h(huán)K5，有利于規(guī)?；a。
(2)表達量高。
a.根據酵母遺傳密碼偏愛性對K5序列進行了優(yōu)化，提高了K5在酵母中的表達量。
b.通過胞外構建多拷貝表達盒的重組質粒，一次同源重組事件可以實現(xiàn)多個表達盒在多個染色體位點上定位整合，結合加壓因子抗性篩選高拷貝的轉化子，從而獲得具有多基因位點高拷貝的外源基因表達盒重組的畢赤酵母工程菌株。
c.同時控制關鍵的發(fā)酵工藝條件，連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)使表達產量大大高于目前報道的采用畢赤酵母的表達產量。
(3)純化工藝簡便，回收率高。由于是分泌可溶蛋白，不是以包涵體形式表達，因此簡化了純化工序，使純化回收率大大提高，使大規(guī)模生產hK5成為可能。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗指南(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)；Jan-Christer Janson等人，Proteinpurification(John Wiley & Sonss，Inc.，1998)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1hK5分泌表達系統(tǒng)的構建1.α-K5融合基因的獲得根據天然人纖溶酶原Kringle 5的氨基酸序列，按畢赤酵母密碼子偏愛性等原則，設計目的基因并全基因合成，其序列如SEQ ID NO1所示的DNA片段。插入pThioHisA(購自Invitrogen公司)的EcoRI位點，構建得到含有hK5編碼序列的質粒pThioHisA-hK5。以質粒pThioHisA-hK5為模板，用以下引物進行PCR擴增Primer2a5’-CCGCTCGAGAAAAGAGTTTTGTTGCCAGACGTTG-3’(SEQ ID NO4)Primer2b5’-CGGAATTCCTGCAGTTAGAAAGAAGGAGCAGCACAT-3’(SEQ ID NO5)從而得到與釀酒酵母α-因子前導肽序列以正確的框架進行融合的K5基因。
同時，以含有釀酒酵母α-因子前導肽編碼序列的質粒pPIC9K(購自Invitrogen公司)為模板，PCR擴增得到α-因子前導肽序列。所用的引物是Primer2c5’-CGGAATTCATCCAAACGATGAGATTTC(SEQ ID NO6)Primer2d5’-CCGCTCGAGAGATACCCCTTCTTC-3’(SEQ ID NO7)把純化后的上述兩種PCR產物分別用限制酶XhoI進行消化，對兩種酶切產物進行連接。以連接產物為模板進行PCR擴增，得到可用于分泌表達的融合基因α-K5。
2.多拷貝表達盒表達質粒的構建將α-K5融合基因經EcoRI單酶切，克隆入同樣酶切的質粒pPIC9K(見圖2)，酶切鑒定，測序。用BamHI+BglII雙酶切重組質粒pPIC9K-α-K5，回收小片段(1851bp，對應α-K5表達盒)，插入BamHI單酶切的pPIC9K-α-K5重組質粒，酶切鑒定，選出正向重組子，得到攜帶同向排列的2拷貝表達盒的重組質粒pPIC9K-2α-K5。以此類推，從pPIC9K-2α-K5出發(fā)構建攜帶4拷貝表達盒的重組質粒pPIC9K-4α-K5，再從pPIC9K-4α-K5出發(fā)構建攜帶8拷貝表達盒的質粒pPIC9K-8α-K5。
酶切鑒定表明，分別獲得了插入方向正確且具有單拷貝表達盒的重組質粒pPIC9K-α-K5，攜帶同向排列的2拷貝表達盒的重組質粒、pPIC9K-2α-K5，攜帶同向排列的4拷貝表達盒的重組質粒pPIC9K-4α-K5，攜帶8拷貝表達盒的質粒pPIC9K-8α-K5。
實施例2重組質粒的轉化將構建好的重組質粒pPIC9K-α-K5、pPIC9K-2α-K5、pPIC9K-4α-K5、pPIC9K-8α-K5分別用SalI酶切線性化，轉化感受態(tài)常規(guī)的畢赤酵母GS115(購自Invitrogen公司)細胞涂布MD平板后72小時，取最大的菌落接種到含0.25mg/ml的G418的YPD平板上，30℃培養(yǎng)48小時，然后將在平板上長出的菌落用2.0mg/mlG418的YPD平板篩選獲得高抗性工程菌。得到一批高抗性工程株，在試管中表達篩選獲得多個高效表達株。
試驗結果pPIC9K-α-K5、pPIC9K-2α-K5、pPIC9K-4α-K5三個轉化組分別獲得了能在0.25mg/mlG418的YPD平板上生長的數個克隆，pPIC9K-8α-K5轉化組獲得了能在2mg/mlG418的YPD平板上生長的數個克隆。
對獲得的工程菌中進行鑒定，表明這些畢赤酵母工程菌中含有2-30個拷貝的rhK5。
實施例3高表達工程菌的獲得分別抽提實施例2中不同抗性工程菌的基因組DNA，并制備hK5基因探針，斑點雜交(Dot Blot)實驗檢測hK5的整合拷貝數，篩選高拷貝數的陽性克隆。
試驗結果pPIC9K-8α-K5轉化組的高抗性工程菌具有較高外源基因拷貝數(30拷貝以上)，從而獲得了具有高拷貝hK5基因的工程菌，而pPIC9K-α-K5、pPIC9K-2α-K5、pPIC9K-4α-K5三個轉化組的克隆拷貝數相對較低。
不同抗性工程菌做小搖表達檢測接種單克隆工程菌入YPD培養(yǎng)基中，甲醇誘導48小時后取上清檢測，比較不同抗性工程菌的基因表達水平。
試驗結果pPIC9K-8α-K5轉化組獲得的具有高拷貝hK5基因的工程菌表達量最高，分泌至培養(yǎng)基中的hK5蛋白濃度超過500mg/L發(fā)酵上清液，與其它三組低拷貝的工程菌相比，表達量高出5倍以上。這說明本發(fā)明所采用的高拷貝構建策略是成功的和必要的，通過提高拷貝數可以進一步實現(xiàn)hK5的高表達。
實施例4優(yōu)化序列對K5表達的影響重復實施例1的步驟，不同點僅在于使用天然的人K5核苷酸編碼序列替換實施例1中密碼子經過優(yōu)化的K5編碼序列，從而構建了pPIC9K/8α-K5-N，該表達載體含有天然的人K5序列。
分別接種pPIC9K-8α-K5和pPIC9K-8α-K5-N的單克隆進行小搖表達實驗，分別加甲醇誘導后，兩種樣品每隔12hr取100ml發(fā)酵液離心，-20℃凍存，誘導48hr結束。樣品檢測SDS-PAGE(并掃描)、蛋白含量。
實驗結果(見下表)表明在相同培養(yǎng)時間時，pPIC9K-8α-K5菌株的表達明顯高于pPIC9K-8α-K5-N菌株。因此，通過本次實驗，決定采用pPIC9K-8α-K5菌株。
實施例5不同啟動子對K5表達的影響用類似的方法構建了pGAPA/8α-K5，該表達載體含有組成型表達啟動子(pGAP啟動子為GAP)。分別接種pPIC9K-8α-K5和pGAPA/8α-K5的單克隆進行小搖表達實驗，在pPIC9K-8α-K5的菌液中加甲醇誘導后，兩種樣品每隔12hr取100ml發(fā)酵液離心，-20℃凍存，誘導48hr結束。樣品檢測SDS-PAGE(并掃描)、蛋白含量。
實驗結果(見下表)表明在相同培養(yǎng)時間時，pPIC9K-8α-K5菌株的表達明顯高于pGAPA/8α-K5菌株。因此，通過本次實驗，決定采用pPIC9K-8α-K5菌株。
實施例6發(fā)酵階段添加不同蛋白保護劑對表達水平的影響準備3個發(fā)酵罐。取單克隆，接種到BMGY一級種子液中，培養(yǎng)17-20hr；按1∶10的比例二級接種于250ml BMGY的1L三角燒瓶中，培養(yǎng)4～8hr左右，接種上罐進行發(fā)酵，控制pH 5.0、溫度30℃、DO＞35％，待溶氧上升后流加50％甘油。待甘油耗盡，溶氧再次上升后用100％甲醇誘導。再將濃度為10％的CA、蛋白胨和Tryptone各300ml流加入罐(5L發(fā)酵罐，發(fā)酵上清3L)，維持溶氧在35％～70％之間。誘導36小時后結束，收集發(fā)酵上清。樣品檢測SDS-PAGE和蛋白含量。
實驗結果
實施例7發(fā)酵階段不同蛋白胨量對表達水平的影響取單克隆，接種到BMGY一級種子液中，培養(yǎng)17-20hr；按1∶10的比例二級接種于250ml BMGY的1L三角燒瓶中，培養(yǎng)4～8hr左右，接種上罐進行發(fā)酵，控制pH 5.0、溫度30℃、DO＞35％，待溶氧上升后流加50％甘油。待甘油耗盡，溶氧再次上升后用100％甲醇誘導。同時取不同體積10％的蛋白胨流加入5L發(fā)酵罐(發(fā)酵上清3L)，維持溶氧在35％～70％之間。誘導36小時后結束，收集發(fā)酵上清。樣品檢測SDS-PAGE和蛋白含量。
實驗結果
試驗結果表明，蛋白胨的最佳濃度為1％-3％。
實施例8
hK5的純化1.對發(fā)酵液進行超濾濃縮，將發(fā)酵液的緩沖體系替換為磷酸鹽溶液PB。
2.超濾濃縮及更換緩沖液使用Millipore超濾器，超濾膜截流分子量為1KD，超濾時留取濃縮液(作用是去除小分子雜質和鹽類)。發(fā)酵液上清超濾至體積剩下500ml左右，加入PB，繼續(xù)超濾；反復此程序，直至樣品的電導水平和PB緩沖液的電導水平接近。
3.層析1(陰離子交換層析)層析介質DEAE Sepharose FF緩沖液溶液APB溶液BPB+1M NaCl上樣將超濾濃縮的hK5溶液上樣。
清洗上樣后用6CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用10CV將溶液B從0％升至100％。
收集收集hK5樣品峰。
4.層析2(疏水層析)層析介質phenyl Sepharose FF緩沖液溶液APB+1M NaCl溶液BPB上樣將層析1的樣品峰上樣。
清洗上樣后用6CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用10CV將溶液B從0％升至100％。
收集收集hK5樣品峰。
5.層析3(分子篩層析)層析介質Sephadex 75緩沖液PB上樣層析1收集的樣品主分。
樣品經過此三步純化，即超濾、陰離子交換層析、分子篩層析以后，純度提高至95％以上。
實施例9hK5的生物活性檢測取對數生長期的常規(guī)的Ecv304人臍靜脈內皮細胞，以1.6×105細胞/ml接種100μl于96孔板中，培養(yǎng)條件為M199培養(yǎng)基加10％新生牛血清，37℃，5％CO2。約24h后，用含5％新生牛血清的M199培養(yǎng)基更換舊培養(yǎng)基，同時加入不同濃度的重組EhK5或YhK5，37℃5％CO2培養(yǎng)48小時，加20ulMTT(5mg/ml)，反應4小時，加150ulDMSO裂解，570nm比色。結果表明重組蛋白hK5能明顯抑制人臍靜脈內皮細胞Ecv304的增殖，表現(xiàn)為細胞變圓、脫落、細胞膜溶解、細胞死亡(見附圖5)，抑制效果呈典型的劑量依賴性。對非內皮細胞，如KMB17(人胚肺二倍體細胞株)、Vero(非洲綠猴腎上皮細胞)、OB(新生大鼠顱蓋骨成骨細胞)，兩種系統(tǒng)表達的重組hK5均未表現(xiàn)任何抑制活性(見附圖6)。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求
書所限定的范圍。
序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120>重組人纖溶酶原Kringle 5(hK5)生產方法<130>054416<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>297<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>hK5的編碼序列<400>1gttttgttgc cagacgttga aactccatct gaagaagatt gtatgttcgg taatggtaag 60ggttatagag gtaagagagc tactactgtt actggtactc cttgtcaaga ctgggctgct 120caagaaccac acagacactc tatcttcact cctgaaacta acccacgtgc tggtttagaa 180aagaactact gtcgtaaccc tgacggtgac gttggtggtc catggtgtta cactactaac 240cctagaaagt tgtacgacta ctgtgacgtt ccacaatgtg ctgctccttc tttctaa 297<210>2<211>98<212>PRT<213>智人<400>2Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe1 5 10 15Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly20 25 30Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile35 40 45Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys
50 55 60Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn65 70 75 80Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro85 90 95Ser Phe<210>3<211>300<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>α信號肽的編碼序列<400>3atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttac gtagaattcc ctagggcggc cgcgaattaa 300<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4ccgctcgaga aaagagtttt gttgccagac gttg 34<210>5<211>36<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5cggaattcct gcagttagaa agaaggagca gcacat 36<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6cggaattcat ccaaacgatg agatttc 27<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7ccgctcgaga gatacccctt cttc 24
權利要求
1.一種編碼人纖溶酶原Kringle 5的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的纖溶酶原Kringle 5編碼區(qū)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.如權利要求
1所述的核酸序列，其特征在于，選自下組(a)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列和位于上游的α因子信號肽編碼序列構成的核苷酸。
3.一種表達載體，其特征在于，它含有權利要求
1所述的核苷酸序列。
4.一種工程細胞，其特征在于，它是通過權利要求
3所述的表達載體或權利要求
1所述的序列轉化宿主細胞后同源重組而得的，且染色體中整合有人纖溶酶原Kringle 5編碼序列。
5.如權利要求
4所述的工程細胞，其特征在于，它是畢赤酵母(PichiaPastoris)。
6.一種生產人纖溶酶原Kringle 5的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)在適合表達條件下，培養(yǎng)如權利要求
4所述的工程細胞，從而分泌表達人纖溶酶原Kringle 5，所述的工程細胞是畢赤酵母；(b)分離純化出表達的人纖溶酶原Kringle 5。
7.如權利要求
6所述的方法，其特征在于，所述的畢赤酵母細胞的基因組中整合有2-40拷貝的人纖溶酶原Kringle 5編碼序列。
8.如權利要求
6所述的方法，其特征在于，所述的畢赤酵母工程細胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。
9.如權利要求
6所述的方法，其特征在于，步驟(a)中的培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)分為培養(yǎng)階段和誘導階段，培養(yǎng)階段培養(yǎng)菌液濃度達到OD600為40-200，誘導期時間為24-120hr，發(fā)酵及誘導溫度保持在28-30℃，微量元素PTM1量為1-20ml/L，誘導期的pH值為3-9，誘導期甲醇濃度控制在0.5-5％。
10.如權利要求
6所述的方法，其特征在于，步驟(b)的分離條件包括(i)對發(fā)酵樣品通過離心和/或過濾去除菌體，獲得發(fā)酵上清液；(ii)通過鹽析和/或超濾對發(fā)酵上清進行濃縮，獲得濃縮液；(iii)對濃縮液進行層析純化，所述的層析純化選自陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和層析、及其組合，從而獲得純度達到95-99.9％的純品。
專利摘要
本發(fā)明提供一種優(yōu)化的適合酵母表達的重組人纖溶酶原Kringle 5片段(hK5)的編碼序列，高效生產rhK5的方法，以及有關的工程細胞的構建、rhK5的表達和純化的工藝。優(yōu)化后的纖溶酶原Kringle 5基因非常適合酵母表達(尤其是多拷貝表達)，具有高表達、高穩(wěn)定、高分泌的特點。本發(fā)明可高效、簡便、低成本地獲得rhK5純品。
文檔編號C12N15/63GK1990871SQ200510112489
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月30日
發(fā)明者王軍志, 袁力勇, 饒春明, 史新昌, 黃陽濱, 孫九如, 蔣劍, 祁暉 申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司, 中國藥品生物制品檢定所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan