專利名稱:堿性蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及堿性蛋白酶及其編碼基因。
背景技術(shù)：
蛋白酶早已在工業(yè)領(lǐng)域有所應(yīng)用，由起初作為衣料洗滌劑到后來涉及纖維改性劑、皮革處理劑、化妝品、浴液、食品改性劑或醫(yī)藥用品方面的多種不同用途。其中，最大量工業(yè)化生產(chǎn)的是洗滌劑用蛋白酶，已知的例如Alcalase、Savinase(注冊商標(biāo)；Novozymes)、Maxacal(注冊商標(biāo)；Genencor)、Blap(注冊商標(biāo)；Henkel)以及KAP(花王公司)等。
向洗滌劑中混入蛋白酶的目的在于分解附著于衣料上的蛋白質(zhì)污漬，實際的污漬不僅是蛋白質(zhì)，還有來自皮脂的脂質(zhì)和固體顆粒等以及混入了有機物和無機物的含有多種成分的復(fù)合污漬，因此需要獲得對這種復(fù)合污漬具有強洗凈效果的洗滌劑。
基于這樣的觀點，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了數(shù)種即使在高濃度脂肪酸存在下也可保持對酪蛋白具有充分分解活性的堿性蛋白酶，所述的堿性蛋白酶不僅對蛋白質(zhì)，對混有皮脂等的復(fù)合污漬也具有良好的洗凈性，分子量約為43,000，并已在先申請了專利(國際公開號99/18218)。這一組堿性蛋白酶在分子量、一級結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)，特別是對氧化劑具有很強耐性的方面與現(xiàn)有技術(shù)中已知來自芽孢桿菌屬細(xì)菌的屬于絲氨酸蛋白酶的枯草桿菌蛋白酶不同，經(jīng)提議分為新的枯草桿菌蛋白酶亞科(Saeki等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，279，313-319，2000)。
為將這種蛋白酶與洗滌劑混合，將培養(yǎng)液濃縮后要有干燥、顆?；ば蚨倚枰⒁夥乐蛊湓谙礈靹┑谋４孢^程中失活。此外還發(fā)現(xiàn)改變編碼這種蛋白酶的基因后所得的比活性和產(chǎn)量增加的突變體，與突變前相比耐熱性下降了。即要解決上述問題需要提高酶的耐熱性。
因此，本發(fā)明提供既對復(fù)合污漬具有良好洗凈性、又提高了耐熱性的堿性蛋白酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人對既保持上述堿性蛋白酶的特性，又提高了耐熱性的新的酶進行探索的過程中，發(fā)現(xiàn)對于某種堿性蛋白酶而言，其氨基酸序列中特定位點的特定氨基酸殘基是必要的。
即，本發(fā)明提供選自序列號1所示氨基酸序列中(a)63位、(b)89位、(c)120位、(d)63位及187位、(e)226位、(f)296位、(g)304位，或相當(dāng)于所述位點的氨基酸殘基是下述氨基酸殘基的堿性蛋白酶及其編碼基因(a)位點絲氨酸、(b)位點組氨酸、(c)位點精氨酸、(d)位點絲氨酸、(e)位點酪氨酸、(f)位點纈氨酸、(g)位點絲氨酸。
此外，本發(fā)明還提供含有該基因的載體、含有所述載體的轉(zhuǎn)化子。
再有，本發(fā)明還提供含有該堿性蛋白酶的洗滌劑組合物。
附圖的簡要說明
圖1是與序列號1所示氨基酸序列具有80％或更高同源性的蛋白酶氨基酸序列的排列圖。
圖2是顯示本發(fā)明的堿性蛋白酶在硼酸緩沖液(pH10，50mM)中、70℃處理10分鐘時耐熱性提高示意圖。
圖3是顯示本發(fā)明的堿性蛋白酶在2mM氯化鈣中、80℃處理10分鐘時耐熱性提高示意圖。
本發(fā)明的最佳實施方式如上所述，本發(fā)明的堿性蛋白酶是在選自序列號1所示氨基酸序列中(a)63位、(b)89位、(c)120位、(d)63位及187位、(e)226位、(f)296位、(g)304位，或相當(dāng)于所述位點的氨基酸殘基是下述氨基酸殘基的堿性蛋白酶(a)位點絲氨酸、(b)位點組氨酸、(c)位點精氨酸、(d)位點絲氨酸、(e)位點酪氨酸、(f)位點纈氨酸、(g)位點絲氨酸。
也就是說，本發(fā)明的堿性蛋白酶是指由序列號1所示的氨基酸序列組成的堿性蛋白酶中上述選自(a)～(g)位點的氨基酸殘基、或其他堿性蛋白酶氨基酸序列中相應(yīng)于上述位點的氨基酸殘基是特定氨基酸殘基的蛋白酶，野生型、野生型的突變體或人工突變體均可。
此處所述的“其他堿性蛋白酶”可以是野生型或野生型的突變體、耐氧化劑、優(yōu)選通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)法測得的分子量為43,000±2,000，例如由與序列號1所示氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列組成的堿性蛋白酶。特別優(yōu)選與序列號1所示氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列組成的、能在pH8或更高的堿性環(huán)境下起作用、耐氧化劑、50℃pH10條件下處理10分鐘時活性可殘留80％或更高的、受二異丙基氟磷酸(DFP)和苯基甲磺酰氟化物(PMSF)的抑制、SDS-PAGE測定的分子量為43,000±2,000的酶。此處所述的耐氧化劑是指所述的堿性蛋白酶在含有50mM過氧化氫、5mM氯化鈉的Britton-Robinson緩沖液(pH 10)中，30℃下放置20分鐘后殘留活性至少保持在50％以上。
此處所述的“由序列號1所示的氨基酸序列組成的堿性蛋白酶”例如KP43[來自芽孢桿菌-KSM-KP43(FERM BP-6532)、國際公開號99/18218]、“由與序列號1所示氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列組成的堿性蛋白酶”例如，蛋白酶KP9860(GenBank登錄號AB046403)[來自芽孢桿菌種-KSM-9860(FERM BP-6534)、國際公開號99/18218]、蛋白酶9865(GenBank登錄號AB084155)[來自芽孢桿菌種-KSM-9865(FERMP-1592)、特愿2002-002653]、蛋白酶E-1(GenBank登錄號AB046402)[來自芽孢桿菌No.D-6(FERMP-1592)、特開昭49-71191號公報]、蛋白酶Ya(GenBank登錄號AB046404)[來自芽孢桿菌種-Y(FERM BP-1029)、特開昭61-280268號公報]、蛋白酶SD521(GenBank登錄號AB046405)[來自芽孢桿菌SD521(FERM P-11162)、特開平3-191781號公報]、蛋白酶A-1(GenBank登錄號AB046406)[來自NCIB12289、國際公開號88/01293號]、蛋白酶A-2[來自NCIB12513、國際公開號98/56927號]、特開2002-218989號公報、特開2002-306176號公報記載的突變蛋白酶、序列號1所示的氨基酸序列中第251位分別被天冬酰胺、蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或谷氨酰胺替代的突變體、第256位分別被絲氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸或丙氨酸替代的突變體(特愿2001-329472號)、序列號1所示的氨基酸序列中第65位由脯氨酸替代的突變體、101位由天冬酰胺替代的突變體、273位分別由異亮氨酸、甘氨酸、蘇氨酸替代的突變體、320位分別由苯丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或甘氨酸替代的突變體、359位分別由絲氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺替代的突變體、387分別由丙氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸或組氨酸替代的突變體(特愿2002-304230號)、序列號1所示氨基酸序列的第163位由組氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸或纈氨酸替代的突變體、第170位由纈氨酸或亮氨酸替代的突變體、第171位由丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、或蘇氨酸替代的突變體(特愿2002-304231號)或與以上氨基酸序列具有80％或更高、優(yōu)選87％或更高、較優(yōu)選90％或更高、更優(yōu)選95％或更高同源性的堿性蛋白酶。
此外，氨基酸序列的同源性根據(jù)Lipman-Pearson法(Science，227，1435，1985)計算。
此外，確定“相應(yīng)于該位點的氨基酸殘基”的方法可以是，例如通過Lipman-Pearson法等公知的算法對氨基酸序列進行比較、得出與存在于各堿性蛋白酶氨基酸序列中的保守性氨基酸殘基間的最大同源性。按上述方法排列蛋白酶氨基酸序列，不涉及氨基酸序列中的插入、缺失，可以確定相同的氨基酸殘基在不同蛋白酶序列中的位點。一般認(rèn)為所述相同的位點也存在于三級結(jié)構(gòu)中相同的位點，可以推定其具有與被研究的蛋白酶的相關(guān)特異功能類似的效果。
即，根據(jù)用上述方法排列的氨基酸序列組成的圖1，(a)序列號1所示的氨基酸序列中第63位的氨基酸殘基是精氨酸殘基，相應(yīng)于該位點的氨基酸殘基用上述方法可以推定為，例如蛋白酶KP9860中第63位的精氨酸殘基。優(yōu)選該氨基酸殘基是絲氨酸殘基。
(b)序列號1所示的氨基酸序列中第89位的氨基酸殘基是谷氨酰胺，此處，相應(yīng)于該位點的氨基酸殘基用上述方法可以推定為，例如蛋白酶E-1中第88位的谷氨酰胺殘基。優(yōu)選該氨基酸殘基是組氨酸殘基。
(c)序列號1所示的氨基酸序列中第120位的氨基酸殘基是絲氨酸殘基，此處，相應(yīng)于該位點的氨基酸殘基用上述方法可以推定為，例如蛋白酶A-2中第119位的絲氨酸殘基。優(yōu)選該氨基酸殘基是精氨酸殘基。
(d)序列號1所示的氨基酸序列中第63位和第187位的氨基酸殘基天冬酰胺殘基，此處，相應(yīng)于該位點的氨基酸殘基用上述方法可以推定為，例如蛋白酶SD-521中第63位的天冬酰胺殘基和第186位的天冬酰胺殘基殘基。優(yōu)選所述氨基酸殘基都是絲氨酸殘基。
(e)序列號1所示的氨基酸序列中第226位的氨基酸殘基是苯丙氨酸殘基，此處，相應(yīng)于該位點的氨基酸殘基用上述方法可以推定為，例如蛋白酶Ya中第225位的苯丙氨酸殘基。優(yōu)選該氨基酸殘基是酪氨酸殘基。
(f)序列號1所示的氨基酸序列中第296位的氨基酸殘基是異亮氨酸殘基，此處，相應(yīng)于該位點的氨基酸殘基用上述方法可以推定為，例如蛋白酶9865中第296位的異亮氨酸殘基。優(yōu)選該氨基酸殘基是纈氨酸殘基。
(g)序列號1所示的氨基酸序列中第304位的氨基酸殘基是天冬酰胺殘基，此處，相應(yīng)于該位點的氨基酸殘基用上述方法可以推定為，例如蛋白酶E-1中第303位的天冬氨酸殘基。優(yōu)選該氨基酸殘基是絲氨酸殘基。
(表1)顯示出適用于上述“其他堿性蛋白酶”中的、相應(yīng)于蛋白酶KP43的氨基酸序列(序列號1)的(a)63位、(b)89位、(c)120位、(d)63位和187位、(e)226位、(f)296位、(g)304位的位點以及氨基酸殘基的具體例子。
表1


此外，在不使酶活性及酶學(xué)特性發(fā)生變化的范圍內(nèi)，優(yōu)選本發(fā)明的堿性蛋白酶氨基酸序列中的(a)～(g)的選擇在兩個以上位點同時進行。兩個位點以上同時進行的情況中的優(yōu)選實例如下所示。
作為雙重替代物的例子如Asn63Ser+Asn187Ser、Asn63Ser+Ile296Val、Asn187Ser+Ile296Val、Ser120Arg+Phe226Tyr等，特別優(yōu)選Asn63Ser+Asn187Ser。三種或三種以上的組合也可以。
本發(fā)明的堿性蛋白酶是突變體時，作為突變前的堿性蛋白酶(往往稱作親代堿性蛋白酶)的是“由序列號1所示的氨基酸序列組成的蛋白酶”或上述的“其他堿性蛋白酶”所表示的蛋白酶，對這些蛋白酶的目的部位進行突變可得到本發(fā)明的堿性蛋白酶。例如蛋白酶KP43序列號1所示的氨基酸序列中前述(a)～(g)位點的氨基酸殘基、或是堿性蛋白酶氨基酸序列中相應(yīng)于上述位點的氨基酸殘基被其他的氨基酸殘基替代所得。
本發(fā)明的堿性蛋白酶也可由下述方法獲得。即對所克隆的親代堿性蛋白酶編碼基因(序列號2成熟酶區(qū)域，即序列號1的編碼基因第619號密碼子之后的部分所示的)進行突變，用所得的突變基因轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骶囵B(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌，再從培養(yǎng)物中收集所得。克隆親代堿性蛋白酶的編碼基因可以使用常規(guī)的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)，例如可以使用在國際公開號99/18218號、國際公開號第98/56927號中記載的方法。
有關(guān)對親代堿性蛋白酶的編碼基因的突變手段，通常應(yīng)用的隨機突變和定點誘變方法均可使用。更具體說來，可以使用例如“定點誘變系統(tǒng)超突變表達Km試劑盒(Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km kit)”(Takara)。此外，也可以用重組體PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))法(PCR方法，科學(xué)出版社，紐約，1990(PCR protocols，Academic press，New York，1990))、可將基因的任意序列用其他基因中與該任意序列相應(yīng)的序列替代。
用所得的突變基因生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白酶的方法，例如可采用將所述的突變基因與可使其穩(wěn)定擴增的DNA載體相連，轉(zhuǎn)化宿主菌，或?qū)⑺龅耐蛔凅w基因?qū)肟墒蛊浞€(wěn)定存在的宿主菌染色體DNA上等方法。滿足上述條件的宿主菌例如芽孢桿菌屬的細(xì)菌、大腸桿菌、霉菌、酵母、放線菌等，將這些菌株接種到含同化碳源、氮源及其他必需營養(yǎng)元素的培養(yǎng)基中，通過常規(guī)方法培養(yǎng)。
按照常規(guī)的酶提取純化方法從上述培養(yǎng)液中收集、純化堿性蛋白酶。例如，將所述培養(yǎng)液離心分離、或過濾去除菌體，利用常規(guī)的純化方法從上清液中收集目的酶。由上述方法所得的酶液可以直接使用，也可以通過公知的方法純化、結(jié)晶化、粉末化或顆粒化。
所得的本發(fā)明的堿性蛋白酶具有耐氧化劑、對酪蛋白的分解活性不受高濃度的脂肪酸的抑制、SDS-PAGE測得的分子量43,000±2,000，在堿性環(huán)境下具有活性的同時，與親代堿性蛋白酶相比獲得了耐熱性有提高的新性質(zhì)。
因此，本發(fā)明的堿性蛋白酶可作為與各種洗滌劑組合物混合使用的酶。
向洗滌劑組合物中加入的本發(fā)明的堿性蛋白酶的混合量，只要可以顯示出堿性蛋白酶活性，對所述的量沒有特別地限制，每1kg洗滌劑組合物混合0.1～5000PU，從經(jīng)濟性等角度考慮優(yōu)選500PU以下。
可將本發(fā)明的蛋白酶與其他的各種蛋白酶一起應(yīng)用于本發(fā)明的洗滌劑組合物。例如水解酶、氧化酶、還原酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶、合成酶等。其中，優(yōu)選本發(fā)明以外的蛋白酶、纖維素酶、角蛋白酶、酯酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、脂酶、支鏈淀粉酶、果膠酶、甘露聚糖酶、葡萄糖苷酶、葡聚糖酶、膽固醇氧化酶、過氧化物酶、漆酶等，特別優(yōu)選蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂酶。作為蛋白酶，例如市售的Alcalase、Esperase、Savinase、Everlase、Kannase(注冊商標(biāo)；Novozymes公司)、Properase、Purafect(注冊商標(biāo)；Genencor公司)以及KAP(花王公司)等。作為纖維素酶，例如Celluzyme、Carezyme(注冊商標(biāo)；Novozymes公司)、以及KAC、特開平10-313859號公報記載的芽孢桿菌種-KSM-S237菌株生產(chǎn)的堿性蛋白酶、特愿2002-116553號公報記載的突變堿性蛋白酶(以上為花王公司產(chǎn)品)。作為淀粉酶，例如Termamyl、Duramyl(注冊商標(biāo)；Novozymes公司)、Purastar(注冊商標(biāo)；Genencor公司)、以及KAM(花王公司)等。作為脂酶，例如Lipolase、Lipolase Ultra(注冊商標(biāo)；Novozymes公司)。
洗滌劑組合物中，與本發(fā)明的蛋白酶一起使用的本發(fā)明的蛋白酶之外的蛋白酶的混合量優(yōu)選是每1kg洗滌劑組合物0.1～500PU。與纖維素酶共用時，根據(jù)特開平10-313859號公報第
段中記載的酶活性測定方法確定的單位(KU)，優(yōu)選每1kg洗滌劑組合物300～3000000KU。
與淀粉酶共用時，根據(jù)特開平11-43690號公報第
段中記載的淀粉酶活性測定方法確定的單位(IU)、優(yōu)選每1kg洗滌劑組合物50～500000IU。
與脂酶共用時，根據(jù)特表平8-500013號公報實施例1中記載的脂酶活性測定方法確定的單位(LU)，優(yōu)選每1kg洗滌劑組合物10000～1000000LU。
可向本發(fā)明的洗滌劑組合物中混合公知的洗滌劑組分，所述的公知洗滌劑組分例如下述的物質(zhì)。
(1)表面活性劑向洗滌劑組合物中混入0.5～60質(zhì)量％的表面活性劑、特別對粉末狀洗滌劑組合物優(yōu)選混入10～45質(zhì)量％、對液體洗滌劑組合物優(yōu)選混入20～50質(zhì)量％。本發(fā)明的洗滌劑組合物作為漂白劑或自動餐具洗凈機用洗滌劑時，其中的表面活性劑通常占1～10質(zhì)量％，優(yōu)選占1～5質(zhì)量％。
作為用于本發(fā)明的洗滌劑組合物的表面活性劑可以是陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑、兩性表面活性劑、陽離子表面活性劑中的一種或其組合，優(yōu)選是陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑。
作為陰離子表面活性劑優(yōu)選碳原子數(shù)10～18的醇的硫酸酯鹽、碳原子數(shù)8～20的醇的烷氧基化物的硫酸酯鹽、烷基苯磺酸鹽、鏈烷烴磺酸鹽、α-鏈烯烴磺酸鹽、α-磺基脂肪酸鹽、α-磺基脂肪酸烷基酯鹽或脂肪酸鹽。在本發(fā)明中特別是，烷基鏈的碳原子數(shù)為10～14、優(yōu)選12～14的直鏈烷基苯磺酸鹽，作為抗衡離子優(yōu)選堿金屬鹽或胺類、特別優(yōu)選鈉和/或鉀、一乙醇胺、二乙醇胺。
作為非離子表面活性劑優(yōu)選聚氧化烯烷基(碳原子數(shù)8～20)醚、烷基聚糖苷、聚氧化烯烷基(碳原子數(shù)8～20)苯基醚、聚氧化烯山梨糖醇酐脂肪酸(碳原子數(shù)8～22)酯、聚氧化烯二醇脂肪酸(碳原子數(shù)8～22)酯、聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物。特別優(yōu)選的非離子表面活性劑是碳原子數(shù)10～18的醇和4～20摩爾環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷等環(huán)氧化物加成[HLB值(Griffin法計算所得)10.5～15.0，優(yōu)選11.0～14.5]所得的聚氧化烯基烷基醚。
(2)二價金屬離子捕獲劑二價金屬離子捕獲劑的混合量為0.01～50質(zhì)量％，優(yōu)選5～40質(zhì)量％。用于本發(fā)明洗滌劑組合物的二價金屬離子捕獲劑例如，三聚磷酸鹽、焦磷酸鹽、正磷酸鹽等縮合磷酸鹽、沸石等鋁硅酸鹽、合成層狀結(jié)晶性硅酸鹽、次氮基三乙酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、檸檬酸鹽、異檸檬酸鹽、聚醛縮羧酸鹽等。其中特別優(yōu)選結(jié)晶性鋁硅酸鹽(合成沸石)，A型、X型、P型沸石中特別優(yōu)選A型。適于使用的合成沸石平均原始粒徑0.1～10μm、特別適用的是0.1～5μm。
(3)堿性試劑混合0.01～80％質(zhì)量％、優(yōu)選1～40質(zhì)量％的堿性試劑。在粉末洗滌劑的情況下，可舉出的例子如，統(tǒng)稱為濃灰(dense ash)、輕灰的碳酸鈉等堿金屬碳酸鹽，以及JIS 1號、2號、3號等非晶體堿金屬硅酸鹽。這些無機堿性試劑在洗滌劑干燥時對顆粒成形起作用，可以得到相對硬的流動性良好的洗滌劑。除此之外的堿例如，倍半碳酸鈉、碳酸氫鈉等。此外，三聚磷酸鹽等也具有作為堿性試劑的作用。此外，作為用于液體洗滌劑的堿性試劑除上述之外也可以用氫氧化鈉、以及單、二和三乙醇胺，也可以用作活性劑的抗衡離子。
(4)再污染抑制劑混合0.001～10質(zhì)量％、優(yōu)選1～5質(zhì)量％的再污染抑制劑。用于本發(fā)明的洗滌劑組合物的再污染抑制劑可舉出的例如，聚乙二醇、羧酸類聚合物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。其中羧酸類聚合物除能防止再污染之外，還具有金屬離子捕獲功能，以及使固體顆粒污漬從衣料分散到洗滌液中的作用。適用的羧酸類聚合物是丙烯酸、異丁烯酸、衣康酸等的均聚物或共聚物，適用的共聚物是上述的單體和順丁烯二酸的共聚物，分子量優(yōu)選幾千～10萬。除上述的羧酸類聚合物之外，由于聚縮水甘油酸鹽等聚合物、羥甲基纖維素等纖維素衍生物、以及聚天冬氨酸等氨基羧酸類聚合物也具有金屬離子捕獲劑、分散劑和防止再污染的功能，因此也是優(yōu)選的。
(5)漂白劑優(yōu)選混入例如1～10質(zhì)量％的過氧化氫、過碳酸鹽等漂白劑。使用漂白劑時可混入0.01～10質(zhì)量％的四乙酰乙二胺(TAED)、特開平6-316700中記載的漂白活化劑(活化因子)。
(6)熒光劑可用于本發(fā)明洗滌劑組合物的熒光劑例如聯(lián)苯型熒光劑(例如，TinopalCBS-X等)或二苯乙烯型熒光劑(例如DM型熒光染料等)。優(yōu)選混入0.001～2質(zhì)量％的熒光劑。
(7)其他組分在本發(fā)明的洗滌劑組合物中可包含衣料用洗滌劑領(lǐng)域所公知的賦形劑、柔軟劑、還原劑(亞硫酸鹽等)、止泡劑(硅酮等)、香料以及其他的添加劑。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可通過將經(jīng)上述方法獲得的本發(fā)明的蛋白酶與上述公知的洗凈組分混合以常規(guī)的方法制造來獲得。洗滌劑的形態(tài)可根據(jù)其用途來選擇，例如液體、粉末、顆粒、糊漿、固體等。
所得的本發(fā)明的洗滌劑組合物可用作衣料洗滌劑、漂白劑、硬質(zhì)表面用洗滌劑、排水管洗滌劑、假牙洗滌劑、醫(yī)療器具殺菌用洗滌劑。
實施例實施例1可以判斷出來自芽孢桿菌種-KSM-KP43的堿性蛋白酶突變體Phe46Leu、Tyr195Gly以及Phe46Leu+Tyr195Gly對顯著提高比活性是有效性的(特開2002-218989)。但是，將所述的突變體在70℃下處理15分鐘時，親本的堿性蛋白酶與處理前相比活性可殘留70％-80％，而比活性提高的突變體活性僅殘留5-25％。因此，對上述突變體的基因進行隨機突變，獲得耐熱性提高的突變體。即，以導(dǎo)入了約2kb突變體結(jié)構(gòu)基因的pKF18k(Takara)作為模板DNA(30ng)、Taq聚合酶(2.5U)BcaBEST測序引物RV-M和BcaBEST測序引物M13-47(Takara；各20pmoL)、各種dNTP(各20pmoL)、Takara Taq擴增反應(yīng)緩沖液、適量的硫酸鎂和二甲亞砜進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為94℃下使模板DNA變性1分鐘后、94℃1分鐘、55℃2分鐘、72℃3分鐘的一個循環(huán)后，再進行30個循環(huán)的反應(yīng)，72℃下放置10分鐘。
用高純度PCR產(chǎn)物純化試劑盒(羅氏公司)純化導(dǎo)入了突變的PCR產(chǎn)物，然后用100μL無菌水溶解。用BamHI、XbaI(羅氏公司)對所得的2kbDNA片段進行酶切后，將其與用相同的酶處理的pKF18k混合，用DNA連接試劑盒(ver.2Takara)在16℃下進行12小時的連接反應(yīng)。將反應(yīng)液用乙醇沉淀回收DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101。轉(zhuǎn)化子在含有脫脂牛奶和卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上繁殖。
選擇具有卡那霉素抗性且能形成脫脂牛奶溶解斑的轉(zhuǎn)化子，接種到含有脫脂牛奶和卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、72小時振蕩培養(yǎng)。用合成基質(zhì)法(后述)測定培養(yǎng)液上清的活性。即，對培養(yǎng)液上清經(jīng)70℃處理15分鐘所得的樣品與未經(jīng)處理的樣品進行測定，研究經(jīng)熱處理后的殘留活性。對與突變前相比耐熱程度提高了10-50％的突變體進行PCR克隆，經(jīng)基因擴增純化后用Big DyeDNA測序試劑盒(Applied Biosystems)DNA測序儀377型(Applied Biosystems)確定堿基序列。結(jié)果獲得了耐熱性提高的突變體，在該突變體中63位的天冬酰胺被絲氨酸替代、89位的谷氨酰胺被組氨酸替代、120位的絲氨酸被精氨酸替代、187位的天冬酰胺被絲氨酸替代、226位的苯丙氨酸被酪氨酸替代、296位的異亮氨酸被纈氨酸替代、304位的天冬酰胺被絲氨酸替代、63位和187位的天冬酰胺被絲氨酸替代。
實施例2將由實施例1所得的具有提高耐熱性效果的突變位點分別導(dǎo)入序列號1所示的蛋白酶Kp43，為進行耐熱性評價實施位點特異性突變。
用作導(dǎo)入突變的模板的質(zhì)粒是通過切割pKF18k多克隆位點中的BamHI、XbaI位點，導(dǎo)入蛋白酶KP43的編碼基因(序列號2)構(gòu)建所得的。
用于導(dǎo)入位點特異性突變的PCR反應(yīng)利用Takara LA Taq(Takara)進行。用于導(dǎo)入突變的5’末端磷酸化的選擇引物(突變超表達Km試劑盒)以及引物1～7(序列號3～9)各20pmoL，模板質(zhì)粒30ng進行導(dǎo)入突變的PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件是94℃下使模板DNA變性1分鐘后，94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃4分鐘的一個循環(huán)后，再進行30個循環(huán)的反應(yīng)。純化所得的PCR片段用作引物，與30ng模板質(zhì)粒以及LA Tag再次進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為94℃1分鐘、55℃2分鐘、72℃4分鐘的一個循環(huán)后，再進行30個循環(huán)的反應(yīng)。純化所得的PCR產(chǎn)物，經(jīng)連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌MV1184，獲得導(dǎo)入突變的質(zhì)粒。確定所得質(zhì)粒中與堿性蛋白酶基因相關(guān)的堿基序列，確認(rèn)突變部位。
此外，對各突變體的組合，可用上述突變體與引物1～7進行PCR制備二重突變體。
選擇可在芽孢桿菌屬細(xì)菌內(nèi)復(fù)制的pHA64(特開2000-287687號公報啟動子64下游具有BamHI、XbaI切割位點)和芽孢桿菌種KSM-9865(FERM P-18566)作為適于生產(chǎn)及評價導(dǎo)入突變的堿性蛋白酶的體系。所得的導(dǎo)入了各種突變的質(zhì)粒用BamHI、XbaI處理，與經(jīng)同樣的酶處理的pHA64混合后，用DNA連接試劑盒(ver.2 Takara)進行結(jié)合反應(yīng)。乙醇沉淀后從連接反應(yīng)液中回收DNA，即以后的轉(zhuǎn)化用DNA。
KSM-9865菌株的轉(zhuǎn)化子在含有脫脂牛奶的堿性瓊脂培養(yǎng)基[脫脂牛奶(Difco)1％(w/v)、細(xì)菌用胰蛋白胨(Difco)1％、酵母抽提物(Difco)0.5％、氯化鈉1％、瓊脂1.5％、碳酸鈉0.05％、四環(huán)素15ppm]中繁殖，根據(jù)暈圈形成的情況判斷是否導(dǎo)入了突變堿性蛋白酶基因。將轉(zhuǎn)化子接種到5mL種子培養(yǎng)基中[6.0％(w/v)聚胨S、0.05％酵母抽提物、1.0％麥芽糖、0.02％的7水硫酸鎂、0.1％的磷酸二氫鉀、0.25％碳酸鈉、30ppm四環(huán)素]，在30℃下振蕩培養(yǎng)16小時。然后將1％的種子培養(yǎng)液(v/v)接種到30mL的主培養(yǎng)基[8％聚胨S、0.3％酵母抽提物、10％麥芽糖、0.04％的7水硫酸鎂、0.2％的磷酸二氫鉀、1.5％無水碳酸鈉、30ppm四環(huán)素]在30℃下振蕩培養(yǎng)3天。
實施例3將培養(yǎng)物上清液分別在硼酸緩沖液(pH10.52mM氯化鈣添加或不添加)、50mM tris-HCl緩沖液(pH72mM氯化鈣添加或不添加)、或2mM氯化鈣水溶液中60～80℃下處理10分鐘，用酪蛋白法測定殘留活性。求得相對于熱處理前的活性殘留率，任何一種突變體在上述各種條件下均比親代堿性蛋白酶的殘留活性提高，確定了其耐熱性得以提高。結(jié)果如圖2和3所表示的蛋白酶在一定溫度下活性半衰期(殘留活性達到50％的時間)，由此可以判斷出在各種情況下其半衰時間均比親代堿性蛋白酶提高了1.2～7倍。
上述所得的突變體、即堿性蛋白酶突變體除耐熱性提高之外，保持了親代堿性蛋白酶的特性，即具有耐氧化性、對酪蛋白的分解活性不受高濃度脂肪酸存在的影響、根據(jù)SDS-PAGE確定的分子量為43,000±2,000，在堿性條件下具有活性。
參考例<堿性蛋白酶活性的測定方法(合成基質(zhì)法)>
將0.05mL酶液添加到含有0.05mL 6mM合成基質(zhì)(Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA肽研究所)的100mM硼酸緩沖液(pH10.5)中開始反應(yīng)。反應(yīng)在微量培養(yǎng)板計數(shù)器(iEMS reader MFLABSYSTEMS)內(nèi)進行，30℃、15分鐘恒溫。以414nm下吸光度增加作為活性指標(biāo)，以上述條件下吸光度每分鐘增加0.001所需酶量作為1蛋白酶單位。
<蛋白酶活性測定法(酪蛋白法)>
1mL含酪蛋白(Hammerstein法Merck公司)1％(w/v)的50mM硼酸緩沖液(pH10.5)在30℃下恒溫5分鐘后，添加0.1mL的酶液開始反應(yīng)。反應(yīng)15分鐘后加入2mL的反應(yīng)終止液(0.11M三氯乙酸/0.22醋酸鈉/0.33M醋酸)。在室溫下放置30分鐘后用Waterman No1號濾紙過濾沉淀物。用Lowry等的方法對分解產(chǎn)物進行定量。即，向0.5mL的濾液中加入2.5mL的堿性銅溶液(1％Rochelle鹽∶1％5水硫酸銅∶2％碳酸鈉/0.1氫氧化鈉＝1∶1∶100)30℃恒溫10分鐘后，加0.25mL苯酚試劑(關(guān)東化學(xué))[市售的苯酚試劑在去離子水中稀釋兩倍所得的溶液]，充分?jǐn)嚢瑁?0℃下放置30分鐘。然后測定660nm下的吸光值。在上述反應(yīng)條件下，1分鐘內(nèi)生成相當(dāng)于1mmoL酪氨酸的酸可溶性蛋白質(zhì)酸所需的酶量作為蛋白酶1單位(1PU)。
實施例4(1)洗滌劑的配制向帶有攪拌翼的1m3混合槽中加入465kg水，當(dāng)水溫達到55℃后加入135g40％(w/v)的聚丙烯酸鈉水溶液。攪拌15分鐘后添加120kg碳酸鈉、60kg硫酸鈉、9kg亞硫酸鈉、3kg熒光染料。再攪拌15分鐘后，加入300kg沸石，再攪拌30分鐘后可得到勻質(zhì)的漿料(漿料中的水分為50質(zhì)量％)。所述的漿料經(jīng)設(shè)置于噴霧干燥塔塔頂附近的壓力噴霧管嘴噴霧得到基質(zhì)顆粒(向噴霧干燥塔提供的高溫氣體從塔下部225℃輸入、從塔頂105℃排出)。
然后向Lodige mixer(松阪技研公司制造、容量20L、附套管)中投入100質(zhì)量份的上述基質(zhì)顆粒，在主軸攪拌下(150rpm)3分鐘內(nèi)投入20質(zhì)量份非離子表面活性劑、22質(zhì)量份的直鏈烷基(碳原子數(shù)10～13)苯磺酸鈉、4質(zhì)量份的脂肪酸鈉(碳原子數(shù)14～18)、2質(zhì)量份的聚乙二醇、4質(zhì)量份的水的混合液，再攪拌5分鐘。然后向攪拌器中投入20質(zhì)量份的結(jié)晶性硅酸鈉和10質(zhì)量份的沸石，獲得進行表面被覆的洗滌劑基質(zhì)。
向99質(zhì)量％的洗滌劑基質(zhì)中混入0.5質(zhì)量％的本發(fā)明的蛋白酶顆粒和0.5質(zhì)量％的香料獲得最終的顆粒狀洗滌劑A。
(2)使用的原料非離子表面活性劑環(huán)氧乙烷平均加成摩爾數(shù)8.5的Emulgen 108KM(花王公司制造)聚丙烯酸鈉水溶液平均分子量10000(按照特公平2-24283號公報中記載的實施例中所述方法制造)。
碳酸鈉濃灰(セントラル硝子公司制造)沸石平均粒徑3.5μm的4A型沸石(東ソ一公司制造)聚乙二醇K-PEG6000(平均分子量8500，花王公司制造)結(jié)晶性硅酸鈉粉末SKS-6(Hoechst Tokuyama公司制造)本發(fā)明的蛋白酶顆粒由圖2和3中記載的本發(fā)明的堿性蛋白酶的各種純化樣品按照特開昭62-257990號公報中實施例1所述的方法制備成的顆?；?6PU/g)。
熒光染料Tinopal CBS-X(Ciba-Geigy公司制造)。
實施例5(1)洗滌劑的配制將固形物占50質(zhì)量％的料漿用250℃的熱風(fēng)噴霧干燥，獲得聚丙烯酸鈉(質(zhì)量平均分子量10000)7質(zhì)量％、碳酸鈉26質(zhì)量％、硫酸鈉20質(zhì)量％、氯化鈉6質(zhì)量％、熒光染料0.5質(zhì)量％、沸石40質(zhì)量％、水0.5質(zhì)量％的基質(zhì)顆粒。
然后向Lodige mixer(松阪技研公司制造、容量20L、附套管)中投入100質(zhì)量份的上述基質(zhì)顆粒，在主軸攪拌下(150rpm)3分鐘內(nèi)投入20質(zhì)量份的非離子表面活性劑、22質(zhì)量份的直鏈烷基(碳原子數(shù)10～13)苯磺酸鈉、4質(zhì)量份的脂肪酸鈉(碳原子數(shù)14～18)、2質(zhì)量份的聚乙二醇、4質(zhì)量份的水的混合液，再攪拌5分鐘。然后向攪拌器中投入20質(zhì)量份的結(jié)晶性硅酸鈉和10質(zhì)量份的沸石，獲得進行表面被覆的洗滌劑基質(zhì)。
向95質(zhì)量％的洗滌劑基質(zhì)中混入2.8質(zhì)量％的漂白劑顆粒、1.2質(zhì)量％的漂白活性劑顆粒、0.5質(zhì)量％的本發(fā)明的蛋白酶顆粒和0.5質(zhì)量％的香料獲得最終的顆粒狀洗滌劑B。
(2)使用的原料非離子表面活性劑環(huán)氧乙烷平均加成摩爾數(shù)8.5的Emulgen 108KM(花王公司制造)聚丙烯酸鈉水溶液平均分子量10000(按照特公平2-24283號公報中記載的實施例中所述方法制造)。
碳酸鈉濃灰(セントラル硝子公司制造)沸石平均粒徑3.5μm的4A型沸石(東ソ一公司制造)聚乙二醇K-PEG6000(平均分子量8500，花王公司制造)結(jié)晶性硅酸鈉粉末SKS-6(Hoechst Tokuyama公司制造)本發(fā)明的蛋白酶顆粒由圖2和3中記載的本發(fā)明的堿性蛋白酶的各種純化樣品按照特開昭62-257990號公報中實施例所述的方法制備成的顆粒化物(6PU/g)。
熒光染料Tinopal CBS-X(Ciba-Geigy公司制造)。
漂白劑顆粒碳酸鈉.過氧化氫加成物(與特開2000-256699號公報中第
段中所記載的漂白劑顆粒同樣地制備)。
漂白活性劑顆粒月桂酰氧基苯磺酸鈉顆粒化物(與特開2000-256699號公報中第
段中所記載的漂白劑顆粒同樣地制備)。
實施例6配制如表2所示的洗滌劑組合物(洗滌劑C和洗滌劑D)。
表2




1)來自碳原子數(shù)12～14的仲醇的帶有烷基的聚氧乙烯(平均7摩爾加成)烷基醚(Softanol 70，日本催化劑化學(xué)工業(yè)公司制造)2)來自碳原子數(shù)12～14的仲醇的帶有烷基的聚氧乙烯(平均12摩爾加成)烷基醚(Softanol 120，日本催化劑化學(xué)工業(yè)公司制造)3)碳原子數(shù)10～14的直鏈伯醇與平均5摩爾EO、平均2摩爾PO、平均3摩爾EO順次嵌段加成的產(chǎn)物。
4)環(huán)氧乙烯月桂基醚與平均8摩爾的EO加成的產(chǎn)物5)環(huán)氧乙烯月桂基醚與平均11.5摩爾的EO加成的產(chǎn)物6)Narrow range聚氧乙烯烷基(sec-C12/C13)醚7)碳原子數(shù)10～14的直鏈烷基苯磺酸鈉8)酰胺/醚變性硅酮聚合物(東レ.ダゥコ一ニングシリコ一ン公司制造，BY16-906)9)按照特開平10-60476號公報的第11頁第6行～13行記載的方法合成的苯氧基聚乙二醇、丙烯酸、順丁烯二酸共聚物(質(zhì)量平均分子量10000、固形物占51.2％)10)戊烯/順丁烯二酸(50/50摩爾比)共聚物的鈉鹽(質(zhì)量平均分子量7000)11)圖2和3所記載的本發(fā)明的堿性蛋白酶的各種純化樣品(15PU/mL)實施例7下述表3所示的組成中，一邊攪拌混合過碳酸鈉和碳酸鈉(濃灰)，一邊添加聚丙烯酸鈉40％水溶液，和直鏈烷基苯磺酸鈉、或非離子表面活性劑、或月桂酰氧基苯磺酸鈉。然后添加按照特開昭62-257990號公報的實施例1中記載的方法制備的本發(fā)明的堿性蛋白酶顆粒，攪拌至全部均一的程度，配制漂白劑。
表3




1)粒徑500～700μm2)碳原子數(shù)12～14的直鏈烷基苯磺酸鈉3)聚氧乙烯烷基醚(烷基的碳原子數(shù)12～14、EO的平均加成摩爾數(shù)12)4)平均分子量8,0005)圖2和3中記載的本發(fā)明的堿性蛋白酶的各種純化樣品按照特開昭62-257990號公報中實施例1所述的方法制備成的顆?；?6PU/g)。
實施例8配制如下述表4所示的全自動餐具清洗機用洗滌劑組合物(洗滌劑G、和H)。
表4


1)聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(平均分子量2,000)2)碳原子數(shù)12～14的仲醇的7摩爾環(huán)氧乙烯、和8.5摩爾的環(huán)氧丙烯加成物。
3)JIS 2號硅酸鈉4)丙烯酸-順丁烯二酸共聚物
5)Duramyl 60T(注冊商標(biāo)；Novozymes公司制造)6)圖2和3中記載的本發(fā)明的堿性蛋白酶的各種純化樣品按照特開昭62-257990號公報中實施例所述的方法制備成的顆?；?6PU/g)。
實施例9用下述表5中所示的各組分配制硬質(zhì)表面用洗滌劑組合物(洗滌劑J)。
表5


1)聚氧乙烯(EOP＝4)烷基(C12)醚硫酸酯鈉2)聚氧乙烯(EOP＝8)烷基(C12)醚3)烷基(C12)聚葡糖苷(縮合度1.3)4)單長鏈?zhǔn)逋榛?C12)二甲基氧化胺5)烷基(C12)羥基二甲基磺基甜菜堿6)分子量100007)圖2和3中記載的本發(fā)明的堿性蛋白酶的各種純化樣品(15PU/mL)。
實施例10由上述的洗滌劑A(參照實施例2)所得的下述表6中記載的顆粒狀洗滌劑。
表6


1)由表2中記載的本發(fā)明的堿性蛋白酶的各種純化樣品按照特開昭62-257990號公報中實施例1所述的方法制備成的顆?；?6PU/g)。
2)基于特開昭62-257990號公報的實施例1中記載的方法，將特開平5-25492號公報中記載的蛋白酶K-16定為5PU/g。
3)KAC-500(注冊商標(biāo)，花王公司制造)4)Lipolase 100T(注冊商標(biāo)，Novozymes公司制造)本發(fā)明可以提供即使在高濃度脂肪酸存在下也具有充分分解活性、且耐熱性提高了的堿性蛋白酶，所述的堿性蛋白酶不僅對蛋白質(zhì)、對混有皮脂等的復(fù)合污漬也具有良好的洗凈性。
序列表<110>花王公司<120>堿性蛋白酶<130>P<150>JP 2003-106708<151>2003-04-10<160>8<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>434<212>PRT<213>芽孢桿菌KSM-KP43<400>1Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser1 5 10 15Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly20 25 30Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly35 40 45Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp50 55 60Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly65 70 75 80Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser85 90 95Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln100 105 110Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn115 120 125Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn130 135 140Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala145 150 155 160Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala165 170 175Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe
180 185 190Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg195 200 205Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly210 215 220Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe225 230 235 240Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met245 250 255Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe260 265 270Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala275 280 285Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn290 295 300Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr305 310 315 320Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser325 330 335Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser340 345 350Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu355 360 365Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp370 375 380Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu385 390 395 400Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val405 410 415Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile420 425 430Val Asn<210>2<211>1923<212>DNA<213>芽孢桿菌KSM-KP43<220>
<221>CDS<222>(1)..(1920)<223>
<220>
<221>sig_肽<222>(1)..(618)<223>
<220>
<221>mat_肽<222>(619)..()<223>
<400>2atg aga aag aag aaa aag gtg ttt tta tct gtt tta tca gct gca 45Met Arg Lys Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala-205 -200 -195gcg att ttg tcg act gtt gcg tta agt aat cca tct gca ggt ggt 90Ala Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Ser Asn Pro Ser Ala Gly Gly-190 -185 -180gca agg aat ttt gat ctg gat ttc aaa gga att cag aca aca act 135Ala Arg Asn Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr-175 -170 -165gat gct aaa ggt ttc tcc aag cag ggg cag act ggt gct gct gct 180Asp Ala Lys Gly Phe Ser Lys Gln Gly Gln Thr Gly Ala Ala Ala-160 -155 -150ttt ctg gtg gaa tct gaa aat gtg aaa ctc cca aaa ggt ttg cag 225Phe Leu Val Glu Ser Glu Asn Val Lys Leu Pro Lys Gly Leu Gln-145 -140 -135aag aag ctt gaa aca gtc ccg gca aat aat aaa ctc cat att atc 270Lys Lys Leu Glu Thr Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Ile-130 -125 -120caa ttc aat gga cca att tta gaa gaa aca aaa cag cag ctg gaa 315Gln Phe Asn Gly Pro Ile Leu Glu Glu Thr Lys Gln Gln Leu Glu-115 -110 -105aaa aca ggg gca aag att ctc gac tac ata cct gat tat gct tac att 363Lys Thr Gly Ala Lys Ile Leu Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile-100 -95 -90gtc gag tat gag ggc gat gtt aag tca gca aca agc acc att gag cac 411
Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val Lys Ser Ala Thr Ser Thr Ile Glu His-85 -80 -75 -70gtg gaa tcc gtg gag cct tat ttg ccg ata tac aga ata gat ccc cag 459Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr Leu Pro Ile Tyr Arg Ile Asp Pro Gln-65 -60 -55ctt ttc aca aaa ggg gca tca gag ctt gta aaa gca gtg gcg ctt gat 507Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser Glu Leu Val Lys Ala Val Ala Leu Asp-50 -45 -40aca aag cag aaa aat aaa gag gtg caa tta aga ggc atc gaa caa atc 555Thr Lys Gln Lys Asn Lys Glu Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Gln Ile-35 -30 -25gca caa ttc gca ata agc aat gat gtg cta tat att acg gca aag cct 603Ala Gln Phe Ala Ile Ser Asn Asp Val Leu Tyr Ile Thr Ala Lys Pro-20 -15 -10gag tat aag gtg atg aat gat gtt gcg cgt gga att gtc aaa gcg gat 651Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp-5 -1 1 5 10gtg gct cag agc agc tac ggg ttg tat gga caa gga cag atc gta gcg 699Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala15 20 25gtt gcc gat aca ggg ctt gat aca ggt cgc aat gac agt tcg atg cat 747Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His30 35 40gaa gcc ttc cgc ggg aaa att act gca tta tat gca ttg gga cgg acg 795Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr45 50 55aat aat gcc aat gat acg aat ggt cat ggt acg cat gtg gct ggc tcc 843Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser60 65 70 75gta tta gga aac ggc tcc act aat aaa gga atg gcg cct cag gcg aat 891Val Leu Gly Asn Gly Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn80 85 90cta gtc ttc caa tct atc atg gat agc ggt ggg gga ctt gga gga cta 939
Leu Val Phe Gln Ser Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu95 100 105cct tcg aat ctg caa acc tta ttc agc caa gca tac agt gct ggt gcc 987Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala110 115 120aga att cat aca aac tcc tgg gga gca gca gtg aat ggg gct tac aca 1035Arg Ile His Thr Asn Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr125 130 135aca gat tcc aga aat gtg gat gac tat gtg cgc aaa aat gat atg acg 1083Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr140 145 150 155atc ctt ttc gct gcc ggg aat gaa gga ccg aac ggc gga acc atc agt 1131Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser160 165 170gca cca ggc aca gct aaa aat gca ata aca gtc gga gct acg gaa aac 1179Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn175 180 185ctc cgc cca agc ttt ggg tct tat gcg gac aat atc aac cat gtg gca 1227Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala190 195 200cag ttc tct tca cgt gga ccg aca aag gat gga cgg atc aaa ccg gat 1275Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp205 210 215gtc atg gca ccg gga acg ttc ata cta tca gca aga tct tct ctt gca 1323Val Met Ala Pro Gly Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala220 225 230 235ccg gat tcc tcc ttc tgg gcg aac cat gac agt aaa tat gca tac atg 1371Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met240 245 250ggt gga acg tcc atg gct aca ccg atc gtt gct gga aac gtg gca cag 1419Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln255 260 265ctt cgt gag cat ttt gtg aaa aac aga ggc atc aca cca aag cct tct 1467
Leu Arg Glu His Phe Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser270 275 280cta tta aaa gcg gca ctg att gcc ggt gca gct gac atc ggc ctt ggc 1515Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly285 290 295tac ccg aac ggt aac caa gga tgg gga cga gtg aca ttg gat aaa tcc 1563Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser300 305 310 315ctg aac gtt gcc tat gtg aac gag tcc agt tct cta tcc acc agc caa 1611Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln320 325 330aaa gcg acg tac tcg ttt act gct act gcc ggc aag cct ttg aaa atc 1659Lys Ala Thr Tyr Ser Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile335 340 345tcc ctg gta tgg tct gat gcc cct gcg agc aca act gct tcc gta acg 1707Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr350 355 360ctt gtc aat gat ctg gac ctt gtc att acc gct cca aat ggc aca cag 1755Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln365 370 375tat gta gga aat gac ttt act tcg cca tac aat gat aac tgg gat ggc 1803Tyr Val Gly Asn Asp Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly380 385 390 395cgc aat aac gta gaa aat gta ttt att aat gca cca caa agc ggg acg 1851Arg Asn Asn Val Glu Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr400 405 410tat aca att gag gta cag gct tat aac gta ccg gtt gga cca cag acc 1899Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr415 420 425ttc tcg ttg gca att gtg aat taa 1923Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn430
<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>3cggacgaata atgccagtga tccgaatggt cat 33<210>4<211>
<212>DNA<213>人工序列<400>4aaaggaatgg cgcctcatgc gaatctagtc ttc 33<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>5ttcagccaag catacagtgc tggtgccaga att 33<210>6<211>
<212>DNA<213>人工序列<400>6gtcggagcta cggaaagcct ccgcccaagc ttt 33<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>7atggcaccgg gaacgtacat actatcagca aga 33
<210>8<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>8gccggtgcag ctgacgtcgg ccttggctac ccg 33<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>9ggctacccga acggtagcca aggatgggga cga 33KS0758(P2003-0163)118
權(quán)利要求
1.選自序列號1所示氨基酸序列中(a)63位、(b)89位、(c)120位、(d)63位及187位、(e)226位、(f)296位、(g)304位或相當(dāng)于所述位點的氨基酸殘基是下述氨基酸殘基的堿性蛋白酶(a)位點絲氨酸、(b)位點組氨酸、(c)位點精氨酸、(d)位點絲氨酸、(e)位點酪氨酸、(f)位點纈氨酸、(g)位點絲氨酸。
2.由序列號1所示氨基酸序列或與之具有80％或更高同源性的氨基酸序列組成的堿性蛋白酶，其中選自(a)63位、(b)89位、(c)120位、(d)63位及187位、(e)226位、(f)296位、(g)304位或相當(dāng)于所述位點的氨基酸殘基是下述氨基酸殘基(a)位點絲氨酸、(b)位點組氨酸、(c)位點精氨酸、(d)位點絲氨酸、(e)位點酪氨酸、(f)位點纈氨酸、(g)位點絲氨酸。
3.如權(quán)利要求
1或2所述的堿性蛋白酶的編碼基因。
4.含有如權(quán)利要求
3所述的基因的重組載體。
5.含有如權(quán)利要求
4所述載體的轉(zhuǎn)化子。
6.如權(quán)利要求
5所述的轉(zhuǎn)化子，其宿主是微生物。
7.含有如權(quán)利要求
1或2所述的堿性蛋白酶的洗滌劑組合物。
專利摘要
本發(fā)明提供選自序列號1所示氨基酸序列中(a)63位、(b)89位、(c)120位、(d)63位及187位、(e)226位、(f)296位、(g)304位或相當(dāng)于所述位點的氨基酸殘基是下述氨基酸殘基的堿性蛋白酶及其編碼基因(a)位點絲氨酸、(b)位點組氨酸、(c)位點精氨酸、(d)位點絲氨酸、(e)位點酪氨酸、(f)位點纈氨酸、(g)位點絲氨酸。所提供的蛋白酶不僅對復(fù)合污漬具有良好的洗凈效果還提高了耐熱性。
文檔編號C12N1/21GKCN1570092SQ200410045104
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月9日
發(fā)明者佐藤剛, 奧田光美, 小山伸吾, 伊澤啟文, 小林徹 申請人:花王株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan