本申請涉及生物組織工程，例如涉及一種神經(jīng)元/腦類器官-血腦屏障共培養(yǎng)模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、血腦屏障（bbb）是一種維持大腦穩(wěn)態(tài)的特殊神經(jīng)血管單元，嚴(yán)格控制著血液與腦之間的物質(zhì)交換，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)必不可少的功能守門人。

2、血腦屏障調(diào)節(jié)物質(zhì)從血液到大腦和腦到血液的滲透和運輸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的營養(yǎng)傳遞及其與外周組織之間的溝通所必需的。血腦屏障還可阻止血漿中的神經(jīng)毒性成分和病原體進入大腦，維持大腦內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能。然而，由于血腦屏障的存在，中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物對腦實質(zhì)的滲透效率相當(dāng)有限，導(dǎo)致腦部疾病的藥物治療效果不佳，而其他器官和組織積聚導(dǎo)致副作用加重。血腦屏障傳遞藥物至中樞神經(jīng)系統(tǒng)仍然是神經(jīng)治療學(xué)發(fā)展中的一個重大挑戰(zhàn)。為研究血腦屏障的發(fā)育、預(yù)測藥物的神經(jīng)毒性、預(yù)測中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的有效性，血腦屏障模型的開發(fā)是十分必要的。

3、傳統(tǒng)模型主要為動物模型，而動物模型在進行藥物篩選存在以下挑戰(zhàn)：種屬差異造成生理結(jié)構(gòu)或基因表達差異；篩選成本較高，通量較低；體內(nèi)成像精確性較差。因此，越來越多的體外模型應(yīng)運而生。常見體外模型主要集中于將永生化的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞系或原代人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在transwell上進行單層培養(yǎng)。與利用實驗動物開展的體內(nèi)模型相比，體外模型的優(yōu)勢在于：細(xì)胞來源為人，減少物種間生理差異；藥物篩選通量較高。然而常規(guī)的體外模型仍存在很大的局限性，如永生化的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞系構(gòu)建的模型仿生性較差，細(xì)胞無法正常分化或行使血腦屏障的功能；原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞取材困難，體外增殖較難，且批次間差異大。

4、基于以上問題，亟需能夠代替體內(nèi)實驗并且仿生性強的體外模型進行藥物篩選。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了對披露的實施例的一些方面有基本的理解，下面給出了簡單的概括。所述概括不是泛泛評述，也不是要確定關(guān)鍵／重要組成元素或描繪這些實施例的保護范圍，而是作為后面的詳細(xì)說明的序言。

2、本公開實施例提供一種神經(jīng)元/腦類器官-血腦屏障共培養(yǎng)模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，以獲得能夠替代體內(nèi)實驗且仿生性強的體外模型。

3、在一些實施例中，所述神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型，包括：培養(yǎng)芯片，包括多個培養(yǎng)孔，且每一培養(yǎng)孔包括上下連通的下層培養(yǎng)微孔和上層培養(yǎng)微孔，且下層培養(yǎng)微孔和上層培養(yǎng)微孔之間設(shè)置有半透膜；神經(jīng)，通過將干細(xì)胞分化獲得的神經(jīng)元和/或腦類器官接種于上層培養(yǎng)微孔內(nèi)共培養(yǎng)獲得；血腦屏障，通過將干細(xì)胞分化獲得的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于下層培養(yǎng)微孔內(nèi)共培養(yǎng)獲得。

4、在一些實施例中，所述神經(jīng)類器官-血腦屏障共培養(yǎng)模型的構(gòu)建方法，包括：將干細(xì)胞分化為神經(jīng)元或腦類器官，將干細(xì)胞分化為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；將腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于下層培養(yǎng)微孔內(nèi)的半透膜側(cè)，加入第一培養(yǎng)液，培養(yǎng)；培養(yǎng)2～5天后，移除第一培養(yǎng)液，將神經(jīng)元和/或腦類器官接種于上層培養(yǎng)微孔內(nèi)，上層加入第二培養(yǎng)液，下層更換新鮮第一培養(yǎng)液，進行共培養(yǎng)；其中，第二培養(yǎng)液為神經(jīng)元成熟培養(yǎng)基或腦類器官成熟培養(yǎng)基。

5、在一些實施例中，前述神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型或者構(gòu)建方法構(gòu)建的神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型在腺相關(guān)病毒藥物篩選中的應(yīng)用。

6、本公開實施例提供的一種神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，可以實現(xiàn)以下技術(shù)效果：

7、本公開實施例的神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型是利用干細(xì)胞分化為神經(jīng)（例如，神經(jīng)元和/或腦類器官）和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（ibmec），然后利用神經(jīng)元（或腦類器官）與ibmec共培養(yǎng)獲得的一種神經(jīng)和血腦屏障共培養(yǎng)體系。與常規(guī)體外模型相比，本公開實施例的神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型的仿生性更高，能更好的模擬血腦屏障（bbb）的結(jié)構(gòu)和功能，如具有更接近生理水平的屏障功能，小分子藥物選擇透過性與體內(nèi)的滲透情況相吻合，具有小分子相關(guān)轉(zhuǎn)運體功能。此外，本公開實施例的干細(xì)胞可攜帶供體的遺傳信息，用于開發(fā)患者特異性疾病模型或罕見病模型，進行機制研究和藥物篩選。

8、本公開實施例的應(yīng)用中，除了在腺相關(guān)病毒藥物篩選、藥物神經(jīng)毒性篩選的應(yīng)用外，還具有更多的研究應(yīng)用場景，可用于探索神經(jīng)如何影響血腦屏障的形成、功能以及維持，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周組織通訊中的作用機制，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞如何影響神經(jīng)發(fā)生等基礎(chǔ)研究。此外，本公開實施例的共培養(yǎng)模型是藥物開發(fā)中的重要工具，在藥物開發(fā)早期為研究人員提供藥物轉(zhuǎn)運機制，從而開發(fā)靶向傳遞藥物；在藥物篩選階段可用于評估各候選藥物的腦通透性。總之，公開實施例的共培養(yǎng)模型為血腦屏障基礎(chǔ)研究、檢測藥物的神經(jīng)毒性和腦部疾病藥物開發(fā)與篩選等提供了良好的解決方案。

9、以上的總體描述和下文中的描述僅是示例性和解釋性的，不用于限制本申請。

技術(shù)特征：

1.一種神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型，其特征在于，具有以下性能中的一項或多項：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型，其特征在于，上層培養(yǎng)微孔的水平投影位于下層培養(yǎng)微孔的水平投影內(nèi)。

4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，將干細(xì)胞分化為神經(jīng)元或腦類器官，包括：將干細(xì)胞分化為神經(jīng)祖細(xì)胞，將神經(jīng)祖細(xì)胞分化為神經(jīng)元；或者，將干細(xì)胞分化為擬胚體，再對擬胚體進行神經(jīng)誘導(dǎo)，然后再進行分化獲得腦類器官，最后進行成熟培養(yǎng)，獲得腦類器官；

6.?根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，第一培養(yǎng)液包括內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、b-27添加劑、y27632、視黃酸和fgf-2，其中，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基與b-27添加劑的體積比為48～50﹕1，y27632的濃度為5~30?μm，視黃酸的濃度為5~30?μm，fgf-2的濃度為5~30?ng/ml。

7.?根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，神經(jīng)元成熟培養(yǎng)基包括中腦神經(jīng)元成熟培養(yǎng)基；中腦神經(jīng)元成熟培養(yǎng)基包括97%neurobasal，1%?glutamax、2%?b-27添加劑、0.1~1?μm?ascorbic?acid、5~30?μm?dapt、0.1~5?mm?db-camp、50~300?ng/ml?gdnf，1~30ng/ml?tgf-β；

8.?根據(jù)權(quán)利要求5、6或7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在將干細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞的過程中，采用的分化液包括內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、b-27添加劑、視黃酸和fgf-2，其中，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基與b-27添加劑的體積比為48～50﹕1，視黃酸的濃度為5~30?μm，fgf-2的濃度為5~30?ng/ml；和/或，

9.根據(jù)權(quán)利要求5、6或7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，神經(jīng)元包括但不限于中腦神經(jīng)元、前腦神經(jīng)元、運動神經(jīng)元或感覺神經(jīng)元；和/或，

10.如權(quán)利要求1至3任一項所述的干細(xì)胞源神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型，或者，如權(quán)利要求4至9任一項所述的干細(xì)胞源神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型的構(gòu)建方法構(gòu)建獲得的干細(xì)胞源神經(jīng)-血腦屏障共培養(yǎng)模型在腺相關(guān)病毒藥物篩選和/或藥物神經(jīng)毒性篩選中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本申請涉及生物組織工程技術(shù)領(lǐng)域，公開一種神經(jīng)?血腦屏障共培養(yǎng)模型，包括培養(yǎng)芯片以及分別構(gòu)建于培養(yǎng)芯片的上層培養(yǎng)微孔內(nèi)的神經(jīng)和下層培養(yǎng)微孔內(nèi)的血腦屏障。其中，培養(yǎng)芯片的下層培養(yǎng)微孔和上層培養(yǎng)微孔之間設(shè)置有半透膜；神經(jīng)通過將干細(xì)胞分化獲得的神經(jīng)元/腦類器官接種于上培養(yǎng)微孔內(nèi)共培養(yǎng)獲得，血腦屏障通過將干細(xì)胞分化獲得的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于下培養(yǎng)微孔內(nèi)半透膜一側(cè)共培養(yǎng)獲得。共培養(yǎng)模型的仿生性更高，能更好的模擬血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能，如具有更接近生理水平的屏障功能，小分子藥物選擇透過性與體內(nèi)的滲透情況相吻合，具有小分子相關(guān)轉(zhuǎn)運體功能。本申請還公開了構(gòu)建方法和應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：肖榮榮,嚴(yán)磊,周宇
受保護的技術(shù)使用者：北京大橡科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/28