本發(fā)明涉及免疫球蛋白領(lǐng)域，具體涉及區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株的單克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬瘟是一種嚴(yán)重危害全球生豬產(chǎn)業(yè)的疾病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（worldorganization?for?animal?health，woah）將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，在我國屬于二類動(dòng)物疫病，家豬和野豬是豬瘟的主要易感動(dòng)物，其主要臨床表現(xiàn)為全身廣泛性出血、繁殖障礙、呼吸困難和高熱稽留等，急性豬瘟潛伏期較短、致死率高，患畜僅在感染后10～20天即可出現(xiàn)死亡，亞急性和慢性豬瘟?xí)?dǎo)致患畜間歇熱、生長發(fā)育遲緩等，并最終死亡，持續(xù)性感染患畜無明顯臨床癥狀，但懷孕母豬易出現(xiàn)流產(chǎn)和死產(chǎn)，同時(shí)也是危害較大的傳染源。

2、豬瘟病毒（classical?swine?fever?virus，csfv）是引起豬瘟的病原，其為單股正鏈rna病毒，有囊膜，病毒粒子呈直徑約為40～60?nm的球形，基因組大小為11.3～13.0?kb，包含一個(gè)大的開放閱讀框，編碼產(chǎn)生一個(gè)有3898個(gè)氨基酸殘基組成的多聚蛋白，經(jīng)蛋白酶進(jìn)一步切割產(chǎn)生4種結(jié)構(gòu)蛋白（core、erns、e1和e2）和8種非結(jié)構(gòu)蛋白（npro、p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b），其中結(jié)構(gòu)蛋白erns和e2、非結(jié)構(gòu)蛋白ns3可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，e2蛋白是csfv的主要保護(hù)性抗原，其大小約為51～58?kda。e2蛋白的氨基端依次有b、c、d、a四個(gè)抗原結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步可劃分為b/c和d/a兩個(gè)抗原結(jié)構(gòu)單元，大部分抗原表位位于其中。

3、隨著豬瘟兔化弱毒疫苗（hclv;?c-strain）的廣泛應(yīng)用，我國豬瘟得到廣泛控制，目前的流行呈多點(diǎn)散發(fā)特征，csfv共有3種基因型（基因1～3型），其進(jìn)一步可以劃分為11個(gè)基因亞型（1.1～1.4；2.1～2.3；3.1～3.4），目前流行的毒株為2.1亞型，2.1亞型流行毒株進(jìn)一步可以劃分為10個(gè)亞亞型（2.1a～2.1j）?，F(xiàn)有的csfv血清學(xué)檢測技術(shù)不能區(qū)分c株免疫和流行毒株感染，這極大的制約了csfv的凈化，因此亟需開發(fā)可以區(qū)分csfv疫苗株和流行毒株的檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是如何鑒別區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株。所要解決的技術(shù)問題不限于所描述的技術(shù)主題，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術(shù)主題。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了e2蛋白單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列分別是seq?id?no.1的第26-33位、seq?id?no.1的第51-58位和seq?id?no.1的第97-111位的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)；所述輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列分別是seq?id?no.3的第27-32位、seq?id?no.3的第50-52位和seq?id?no.3的第89-97位的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)。

3、其中所述抗原結(jié)合片段包括fab、fab′、f(ab′)2、抗體可變區(qū)（fv）、二硫鍵穩(wěn)定的fv（dsfv）、單鏈抗體（scfv）、單域抗體（sdab，即納米抗體）、微型抗體（minibody）和最小識別單位（mru）等但不限于此。

4、所述互補(bǔ)決定區(qū)（cdr）的序列可根據(jù)kabat編號系統(tǒng)定義。

5、所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)均包含框架區(qū)（framework?region，fr，在可變區(qū)中cdr以外的區(qū)域）。所述框架區(qū)可來源于人或非人哺乳動(dòng)物（如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、駱駝等）。

6、進(jìn)一步地，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列可如seq?id?no.1所示；所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列可如seq?id?no.3所示。

7、進(jìn)一步地，所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段還可包括重鏈恒定區(qū)（ch）和輕鏈恒定區(qū)（cl）。所述重鏈恒定區(qū)可選自igg、iga、igm、igd和ige的重鏈恒定區(qū)。所述重鏈恒定區(qū)還可選自ch1、fc和ch3結(jié)構(gòu)域。所述輕鏈恒定區(qū)可選自kappa（κ）和lambda（λ）型輕鏈恒定區(qū)。所述重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)可來源于人或非人哺乳動(dòng)物（如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、駱駝等）。

8、進(jìn)一步地，所述重鏈恒定區(qū)可選自人igg亞類如iggl、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2的重鏈恒定區(qū)。所述重鏈恒定區(qū)也可選自小鼠igg亞類如igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3、igg4、igg5和igg6的重鏈恒定區(qū)。

9、進(jìn)一步地，所述重鏈恒定區(qū)可為小鼠igg2a的重鏈恒定區(qū)。

10、進(jìn)一步地，所述輕鏈恒定區(qū)可為小鼠的kappa（κ）型輕鏈恒定區(qū)。

11、進(jìn)一步地，所述重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列可如seq?id?no.13所示。

12、進(jìn)一步地，所述輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列可如seq?id?no.14所示。

13、本發(fā)明還提供了生物材料，所述生物材料可為下述任一種：

14、a1）編碼所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段中的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核酸分子；

15、a2）含有a1）所述核酸分子的表達(dá)盒；

16、a3）含有a1）所述核酸分子的重組載體；

17、a4）含有a1）所述核酸分子的重組微生物；

18、a5）含有a1）所述核酸分子的重組宿主細(xì)胞。

19、所述生物材料均可表達(dá)本文所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

20、上述生物材料中，所述核酸分子可為下述任一種：

21、b1）編碼序列是seq?id?no.2的dna分子；

22、b2）編碼序列是seq?id?no.4的dna分子。

23、seq?id?no.2所示的dna分子編碼氨基酸序列為seq?id?no.1的重鏈可變區(qū)。seqid?no.4所示的dna分子編碼氨基酸序列為seq?id?no.3的輕鏈可變區(qū)。

24、本文所述核酸分子還可包括在seq?id?no.2或seq?id?no.4所示核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)密碼子偏好性改造得到的核酸分子?？紤]到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。

25、本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，或所述生物材料在下述任一項(xiàng)中的應(yīng)用：

26、c1）在鑒別區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株中的應(yīng)用；

27、c2）在制備用于鑒別區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

28、c3）在制備用于診斷或輔助診斷豬瘟病毒感染或豬瘟病毒感染引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

29、c4）在制備用于篩查或輔助篩查豬瘟病毒感染或豬瘟病毒感染引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

30、c5）在制備用于檢測豬瘟病毒流行毒株或豬瘟病毒流行毒株e2蛋白的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

31、c6）在制備用于結(jié)合豬瘟病毒流行毒株或豬瘟病毒流行毒株e2蛋白的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

32、所述診斷或輔助診斷豬瘟病毒感染或豬瘟病毒感染引起的疾病可從受試者分離獲得樣品，然后利用所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段檢測所述樣品中是否存在豬瘟病毒e2蛋白或豬瘟病毒e2蛋白的含量，根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行豬瘟病毒感染或豬瘟病毒感染引起的疾病的診斷或輔助診斷。

33、所述篩查或輔助篩查豬瘟病毒感染或豬瘟病毒感染引起的疾病可從受試者分離獲得樣品，然后利用所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段檢測所述樣品中是否存在豬瘟病毒e2蛋白或豬瘟病毒e2蛋白的含量，根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行豬瘟病毒感染或豬瘟病毒感染引起的疾病的篩查。

34、所述檢測豬瘟病毒流行毒株或豬瘟病毒流行毒株e2蛋白包括基于抗原抗體特異性反應(yīng)原理的任何體內(nèi)或體外的e2蛋白的檢測。所述檢測e2蛋白可為檢測待測樣品中是否含有e2蛋白和/或檢測待測樣品中e2蛋白的含量。

35、所述結(jié)合豬瘟病毒流行毒株或豬瘟病毒流行毒株e2蛋白的產(chǎn)品可以是e2蛋白抑制劑，也可以是用于分離或純化e2蛋白的產(chǎn)品但不限于此。例如可將本發(fā)明所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段制備成免疫親和層析柱，基于抗原經(jīng)過層析柱時(shí)可被抗體捕獲、改變ph值等環(huán)境條件使抗原從中解離的原理，篩選分離出e2蛋白。

36、進(jìn)一步地，所述豬瘟病毒感染可為豬瘟病毒流行毒株引起的感染。

37、本文所述產(chǎn)品可包括試劑、試劑盒、芯片、試紙、檢測卡和免疫傳感器。

38、所述受試者可為人或非人動(dòng)物（如豬、牛、羊、兔、貓、馬、鹿、猴、雞、犬等）。

39、本發(fā)明還提供了抗體偶聯(lián)物，包括抗體部分和偶聯(lián)部分，所述抗體部分包含本文所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

40、進(jìn)一步地，所述抗體部分和偶聯(lián)部分可直接連接，或通過接頭（如腙鍵、二硫鍵、硫醚鍵、肽鍵）共價(jià)連接。

41、進(jìn)一步地，所述偶聯(lián)部分可為可檢測的標(biāo)記。

42、進(jìn)一步地，所述可檢測的標(biāo)記包括酶（如辣根過氧化物酶（hrp）、堿性磷酸酶（ap）、β-半乳糖苷酶等）、化學(xué)發(fā)光試劑（如吖啶酯類化合物、吖啶磺酰胺類化合物、魯米諾及其衍生物、釕衍生物等）、熒光染料（如amca、fitc、cfse、gfp、dapi、7-aad、hoechst?33342、pacific?blue、pe、pe-tr、pe-cy7、pe-cy5、pi、percp-cy5.5、apc、apc-cy7、apc-h7、v500、alexa?700、bv605、bv480、bv785、bv510、bv711、bv421等）、近紅外染料（如菁類染料、bodipy類、羅丹明類、方酸類、卟啉類染料等）、放射性核素（如125i、18f、11c、99mtc、123i等）、生物素、磁共振成像的納米粒子、磁共振成像的量子點(diǎn)、磁性物質(zhì)（如磁珠、含釓復(fù)合物的納米顆粒、超順磁性氧化鐵納米顆粒）和膠體金等但不限于此。

43、本發(fā)明還提供了試劑盒，所述試劑盒含有本文所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

44、所述試劑盒可具有下述至少一種用途：

45、（1）鑒別區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株；

46、（2）診斷或輔助診斷豬瘟病毒感染或豬瘟病毒感染引起的疾?。?/p>

47、（3）篩查或輔助篩查豬瘟病毒感染或豬瘟病毒感染引起的疾病；

48、（4）檢測豬瘟病毒流行毒株或豬瘟病毒流行毒株e2蛋白；

49、（5）結(jié)合豬瘟病毒流行毒株或豬瘟病毒流行毒株e2蛋白。

50、所述試劑盒的檢測樣本可為環(huán)境樣本、血液樣本（如全血、血漿、血清）、痰液樣本、組織樣本、細(xì)胞樣本、糞便樣本等但不限于此。

51、進(jìn)一步地，所述環(huán)境樣本可包括飼料廠環(huán)境樣本（如料倉、輸送帶、工作臺(tái)、地面等）、養(yǎng)殖環(huán)境樣本（如污泥、養(yǎng)殖飼料、土壤、食槽、擦拭環(huán)境的抹布、拭子、養(yǎng)殖用水、空氣等）和周邊環(huán)境樣本（如運(yùn)輸車輛、周邊農(nóng)田等）。

52、所述試劑盒可為化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、免疫沉淀檢測試劑盒、免疫印跡檢測試劑盒、免疫層析檢測試劑盒、流式細(xì)胞分析試劑盒、免疫組化檢測試劑盒、膠體金免疫試劑盒或熒光免疫試劑盒但不限于此。

53、進(jìn)一步地，所述試劑盒還可包括免疫檢測所需試劑，如標(biāo)記抗體或抗原、磁微粒、封閉液、稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液等但不限于此。

54、所述試劑盒的各種試劑組分可以存在于分開的容器中，或者可以全部或部分預(yù)組合成試劑混合物。

55、所述試劑盒的組分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液狀態(tài)存在的情況下，這些成分的濃度或含量是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)不同需求而方便地確定的。例如，用于儲(chǔ)存的目的時(shí)，組分的濃度可以較高的形式存在，當(dāng)處于工作狀態(tài)或使用時(shí)，可通過稀釋上述較高濃度的溶液來將濃度降低至工作濃度。

56、所述試劑盒還可包含例如緩沖劑、防腐劑或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。所述試劑盒還可包含用于檢測可檢測標(biāo)記所必需的組分，例如酶或底物。試劑盒還可含有一個(gè)對照樣品或一系列對照樣品，可測定這些對照樣品并將其與測試樣品進(jìn)行比較。所述試劑盒可在試劑盒容器上或試劑盒容器中包含書面產(chǎn)品。書面產(chǎn)品描述了如何使用試劑盒中包含的試劑。

57、本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的制備方法，所述制備方法包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)本文所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，并回收或分離所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

58、進(jìn)一步地，所述制備方法可包括如下步驟：構(gòu)建含有編碼所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸分子（如seq?id?no.2和seq?id?no.4所示的dna分子）的重組表達(dá)載體；將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，獲得表達(dá)所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的重組宿主細(xì)胞；培養(yǎng)所述重組細(xì)胞，從培養(yǎng)的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收或分離所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

59、進(jìn)一步地，所述回收或分離可通過沉淀法（如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、辛酸-飽和硫酸銨沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法）或?qū)游黾夹g(shù)（如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析）從培養(yǎng)物（包括培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)）中分離。

60、進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體可選自原核表達(dá)載體（包括大腸桿菌（如bl21系列表達(dá)細(xì)胞、m15表達(dá)細(xì)胞、top10表達(dá)細(xì)胞和origamai系列表達(dá)細(xì)胞）表達(dá)載體但不限于此）和真核表達(dá)載體（包括酵母（如x33細(xì)胞、gs115細(xì)胞和smd1168細(xì)胞）表達(dá)載體、昆蟲細(xì)胞（如sf21細(xì)胞、sf-9細(xì)胞和hi-5細(xì)胞）表達(dá)載體、哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如het293細(xì)胞和cho細(xì)胞）表達(dá)載體但不限于此）。

61、所述導(dǎo)入的方法可包括以下任一種：（1）通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法（如ca離子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法或金屬陽離子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法等）或物理轉(zhuǎn)化法（如電穿孔轉(zhuǎn)化法）將目的基因或含有目的基因的重組載體導(dǎo)入宿主菌。（2）通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入宿主菌。（3）通過物理或化學(xué)方法將目的基因直接轉(zhuǎn)入植物受體細(xì)胞，如化學(xué)刺激法、電擊法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、顯微注射法、基因槍法、激光微束法、花粉管通道法、超聲波法、氣槍法和渦流法等。（4）以載體為媒介將目的基因轉(zhuǎn)入植物受體細(xì)胞，如農(nóng)桿菌ti質(zhì)粒載體（包括ti質(zhì)粒衍生的載體如共整合載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)）介導(dǎo)法。（5）通過磷酸鈣共沉淀法、陽離子聚合物法（如deae-葡聚糖轉(zhuǎn)染法）、陽離子脂質(zhì)體法、電穿孔法（即電轉(zhuǎn)染法）、顯微注射、基因槍法或病毒介導(dǎo)法（如腺病毒感染法、慢病毒感染法）等將目的基因?qū)腚x體動(dòng)物細(xì)胞（轉(zhuǎn)染）。

62、本發(fā)明還提供了鑒別區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株的方法，所述方法包括使用本文所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段、所述抗體偶聯(lián)物或所述試劑盒進(jìn)行豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株的鑒別區(qū)分。

63、進(jìn)一步地，所述鑒別區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株的方法可為elisa競爭法。

64、進(jìn)一步地，所述elisa競爭法可以通過將本文所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段用可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，然后使其與待測樣品和已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原（e2蛋白）接觸，使待測樣品中的待測抗原與已知抗原之間進(jìn)行競爭，通過檢測待測樣品與已知抗原的競爭關(guān)系（如阻斷率）來鑒別區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株。

65、elisa競爭法通常是指利用抗原與抗體之間的競爭關(guān)系進(jìn)行檢測的一種elisa方法。競爭法的原理基于抗原與抗體之間的結(jié)合反應(yīng)。當(dāng)待測樣本中的抗原和已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原同時(shí)與抗體反應(yīng)時(shí)，它們之間會(huì)形成競爭關(guān)系。在本發(fā)明中，如果待測樣本中含有的是豬瘟病毒流行毒株，則由于豬瘟病毒流行毒株的e2蛋白能夠與本發(fā)明的單克隆抗體tch065特異性結(jié)合，因此它會(huì)占據(jù)更多的抗體，從而減少已知抗原與抗體tch065的結(jié)合機(jī)會(huì)，而當(dāng)待測樣本中含有的是豬瘟兔化弱毒疫苗株時(shí)，則由于豬瘟兔化弱毒疫苗株不與本發(fā)明的單克隆抗體tch065特異性結(jié)合，此時(shí)已知抗原會(huì)占據(jù)更多的抗體，因此，可以通過檢測競爭反應(yīng)的結(jié)果來鑒別區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株。

66、進(jìn)一步地，所述鑒別區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株的方法可包括如下步驟：

67、（1）用已知濃度的抗原e2蛋白包被酶標(biāo)板；

68、（2）在包被抗原的酶標(biāo)板中加入待測樣品、陽性對照（如豬瘟抗體陽性血清）和陰性對照（如豬瘟抗體陰性血清），共孵育；

69、（3）洗板后加入已經(jīng)用可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，共孵育；

70、（4）通過檢測可檢測的標(biāo)記進(jìn)行檢測。

71、進(jìn)一步地，步驟（1）中的抗原e2蛋白可直接商購獲得，也可通過重組表達(dá)的方法獲得（例如本發(fā)明實(shí)施例1中記載的csfv-jl23?e2蛋白的制備方法）。

72、所述鑒別區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株的方法可以是疾病診斷目的、疾病預(yù)后目的和/或疾病治療目的，也可以是非疾病診斷目的、非疾病預(yù)后目的和非疾病治療目的。

73、所述非疾病診斷目的、非疾病預(yù)后目的和非疾病治療目的可以是用于評估疫苗效果，準(zhǔn)確區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株與流行毒株對于評估疫苗效果至關(guān)重要，可以更加準(zhǔn)確地評估疫苗的保護(hù)效果，從而指導(dǎo)疫苗的研發(fā)和使用。所述非疾病診斷目的、非疾病預(yù)后目的和非疾病治療目的還可以是用于流行病學(xué)研究，例如通過區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株，可以更好地了解豬瘟病毒的傳播規(guī)律、流行趨勢以及不同毒株間的遺傳關(guān)系。

74、本發(fā)明還提供了檢測豬瘟病毒流行毒株或豬瘟病毒流行毒株e2蛋白的方法，所述方法包括使用本文所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段、所述抗體偶聯(lián)物或所述試劑盒檢測豬瘟病毒流行毒株或豬瘟病毒流行毒株e2蛋白。

75、所述檢測可包括檢測樣品中是否存在e2蛋白，或樣品中e2蛋白的表達(dá)水平或含量。

76、進(jìn)一步地，所述檢測豬瘟病毒流行毒株或豬瘟病毒流行毒株e2蛋白的方法包括使本文所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段、所述抗體偶聯(lián)物或所述試劑盒與待測樣品接觸，通過抗原抗體反應(yīng)來檢測待測樣品中是否存在豬瘟病毒e2蛋白。

77、進(jìn)一步地，所述檢測豬瘟病毒流行毒株或豬瘟病毒流行毒株e2蛋白的方法包括先將本文所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段用可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記；再使其與待測樣品接觸，通過對可檢測的標(biāo)記的檢測來檢測待測樣品中是否存在e2蛋白，或待測樣品中e2蛋白的含量。

78、所述檢測e2蛋白的方法可以是免疫學(xué)檢測，例如沉淀反應(yīng)、凝集試驗(yàn)、免疫印跡法（western?blot）、酶免疫測定法（例如elisa）、雙抗夾心elisa法、熒光連接免疫吸附測定法（flisa）、酶免疫測定法（eia）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、熒光免疫分析法、放射免疫測定法（ria）、膠體金免疫技術(shù)（gic）、膠體金免疫層析技術(shù)（gica）、免疫組織化學(xué)法（ihc）、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)法、多元免疫分析法和熒光免疫層析技術(shù)等。

79、所述檢測e2蛋白的方法可以是疾病診斷目的、疾病預(yù)后目的和/或疾病治療目的，也可以是非疾病診斷目的、非疾病預(yù)后目的和非疾病治療目的。

80、所述非疾病診斷目的、非疾病預(yù)后目的和非疾病治療目的可以是檢測環(huán)境樣本中是否存在豬瘟病毒污染。

81、進(jìn)一步地，所述檢測e2蛋白的方法可為elisa檢測方法。

82、進(jìn)一步地，所述方法包括將本文所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包被固相載體得到包被抗體的固相載體的步驟。所述包被是指通過物理吸附作用被結(jié)合在固相載體上。

83、進(jìn)一步地，所述固相載體可為酶標(biāo)板、膜載體、微球、生物芯片或磁珠但不限于此。

84、所述固相載體的材料可為聚苯乙烯、纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠或瓊脂糖凝膠但不限于此。

85、所述膜載體可為硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜或尼龍膜但不限于此。

86、本發(fā)明的單克隆抗體可以本領(lǐng)域已知的各種方法來制備，例如通過基因工程重組技術(shù)來獲得。例如，通過化學(xué)合成或pcr擴(kuò)增獲得編碼本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈基因的dna分子。將所得dna分子插入表達(dá)載體內(nèi)，然后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在特定條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，并表達(dá)本發(fā)明的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇本領(lǐng)域常規(guī)的宿主細(xì)胞、表達(dá)載體、將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法以及抗體的分離純化方法。

87、本發(fā)明通過雜交瘤技術(shù)篩選、鑒定出了一株可以區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體（tch065）與豬瘟病毒流行毒株發(fā)生特異性反應(yīng)，而與豬瘟兔化弱毒疫苗株不反應(yīng)?；诖?，本發(fā)明通過基因工程制備了單克隆抗體tch065，并利用抗體tch065建立了可以鑒別區(qū)分豬瘟兔化弱毒疫苗株和流行毒株的elisa競爭法。本發(fā)明的單克隆抗體tch065可以用于csfv免疫和野毒的血清學(xué)診斷、免疫效果評價(jià)以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)等領(lǐng)域，為csfv有效檢測和凈化提供了抗體資源。