本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體涉及一種與板栗疫病菌致病性相關(guān)的基因 cpsge1及其dsrna和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、寄生隱叢赤殼（ c.?parasitica），在生物學(xué)分類上屬于真菌界（fungi）子囊菌門（ascomycota）盤菌亞門（pezizomycotina）糞殼菌綱（sordariomycetes）間座殼菌目（diaporthales）隱叢殼科（cryphonectriaceae）隱叢殼屬（ cryphonectria）。板栗作為重要的木本糧食作物，栽培面積大。然而栗樹病害的頻發(fā)不僅造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅著我國的栗類糧食安全，其中板栗疫病對(duì)板栗危害嚴(yán)重。由寄生隱叢赤殼引起的板栗疫病原產(chǎn)于東亞，是一種典型的世界性森林病害，板栗疫病能引起板栗樹枝及主干的腐爛和潰瘍，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成全株死亡，該病害曾在歐美大肆流行，導(dǎo)致當(dāng)?shù)氐陌謇鯙l臨滅絕。

2、板栗疫病菌中存在低毒力現(xiàn)象，應(yīng)用弱毒菌系防治僅在歐洲效果顯著，但在其它地區(qū)由于營養(yǎng)體不親和效果不理想。而我國板栗園大多分布在山地丘陵地帶，在多數(shù)情況下任其生長(zhǎng)，管理粗放，病害易滋生。近年來，各地板栗疫病普遍流行，危害日益嚴(yán)重，因此急需對(duì)板栗疫病進(jìn)行防治。目前，真菌病害防控手段主要包括化學(xué)防治、生物防治、抗病育種和栽培管理。化學(xué)防治是最主要的防控措施，但長(zhǎng)期大量施用化學(xué)農(nóng)藥造成的土壤板結(jié)、病菌抗藥性增強(qiáng)、環(huán)境污染等弊端日益凸顯。在推進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的時(shí)代背景下，生物防治因具有環(huán)境友好、綠色安全等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為作物真菌病害綠色防控主要措施之一，但活體微生物農(nóng)藥受環(huán)境影響較大，品種有限，無法滿足市場(chǎng)需求?？共∮N雖然是最有效的防控手段，但受病菌變異速度快，育種周期長(zhǎng)的限制，無法滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需求，而且栽培管理效果有限。因此探索防控板栗疫病的新策略勢(shì)在必行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種與板栗疫病菌致病性相關(guān)的基因 cpsge1及其dsrna和應(yīng)用，以解決現(xiàn)有板栗疫病無法得到很好解決的問題。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：提供一種與板栗疫病菌致病性相關(guān)的基因 cpsge1，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

3、上述與板栗疫病菌致病性相關(guān)的基因 cpsge1編碼的蛋白，其氨基酸序列如seq?idno.2所示。

4、本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供了一種板栗疫病菌致病關(guān)鍵基因 cpsge1，所述基因的核苷酸序列為seq?id?no.1，其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列為seq?id?no.2。 cpsge1基因具有1個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)域gti1/pac2家族結(jié)構(gòu)域，保守結(jié)構(gòu)域中包含有1個(gè)潛在的pka磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)預(yù)測(cè)的核定位信號(hào)，屬于gti1/pac2家族轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明利用split-marker法構(gòu)建基因敲除載體，通過peg介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系獲得板栗疫病菌致病關(guān)鍵基因 cpsge1的基因敲除突變體，驗(yàn)證了 cpsge1基因的功能。該基因在板栗疫病菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、脅迫和致病過程中發(fā)揮重要功能。

5、上述與板栗疫病菌致病性相關(guān)的基因 cpsge1的dsrna，其核苷酸序列包括seq?idno.3、seq?id?no.4或seq?id?no.5。

6、本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供了與板栗疫病菌致病性相關(guān)的基因 cpsge1的dsrna，dsrna以如seq?id?no.1所示的核苷酸序列為模板，采用dsrna合成試劑盒合成。在本發(fā)明中，dsrna的核苷酸序列優(yōu)選為seq?id?no.3、seq?id?no.4或seq?id?no.5。

7、上述與板栗疫病菌致病性相關(guān)的基因 cpsge1的dsrna的合成方法，包括以下步驟：

8、根據(jù)基因 cpsge1設(shè)計(jì)合成dsrna的上下游引物，以基因 cpsge1為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄合成dsrna。

9、進(jìn)一步地，合成dsrna的上下游引物序列分別如下：

10、dsrna1正向引物：5’-acctggcggggcatggtc-3’（seq?id?no.8）；反向引物：5’-agaggggaagctcttgtcga-3’（seq?id?no.9）；用于擴(kuò)增seq?id?no.3所示序列；或

11、dsrna2正向引物：5’-gtgccctccttacagctaca-3’（seq?id?no.10）；反向引物：5’-cgggccccccattggggt-3’（seq?id?no.11）；用于擴(kuò)增seq?id?no.4所示序列；或

12、dsrna3正向引物：5’-ggtgataagaagagggctatcaag-3’（seq?id?no.12）；反向引物：5’-actggggaaggggagcctat-3’（seq?id?no.13）；用于擴(kuò)增seq?id?no.5所示序列。

13、上述與板栗疫病菌致病性相關(guān)的基因 cpsge1或dsrna在防治板栗疫病和楊樹炭疽病中的應(yīng)用。

14、進(jìn)一步地，引起板栗疫病的病原菌為寄生隱叢赤殼 cryphonectria?parasitica。

15、進(jìn)一步地，引起楊樹炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌 colletotrichum? gloeosporioides。

16、本發(fā)明的有益效果為：通過向病原菌導(dǎo)入外源dsrna，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生rnai。本發(fā)明利用rnai技術(shù)沉默板栗疫病菌 cpsge1基因的表達(dá)，驗(yàn)證了通過沉默 sge1基因降低板栗疫病菌致病性的可行性；同時(shí)，由于該基因調(diào)控板栗疫病菌的產(chǎn)孢能力和脅迫耐受性，本發(fā)明在降低板栗疫病菌的繁殖和擴(kuò)散能力以及減少農(nóng)藥使用量方面有較大應(yīng)用潛力，對(duì)科學(xué)綠色的病害防治具有重要意義。

17、此外，本發(fā)明驗(yàn)證了seq?id?no.3、seq?id?no.4和seq?id?no.5所示的dsrna可應(yīng)用于包括板栗疫病菌和膠孢炭疽菌在內(nèi)的植物真菌病害，且seq?id?no.5所示dsrna效果最佳，本研究可為其他真菌病害的防治手段提供新的借鑒和參考。

18、一種真菌病害防治制劑，該制劑包括上述dsrna。

19、進(jìn)一步地，上述真菌病害為寄生隱叢赤殼 cryphonectria?parasitica引起的板栗疫病或膠孢炭疽菌 colletotrichum?gloeosporioides引起的楊樹炭疽病。

20、一種防治板栗疫病和楊樹炭疽病的方法，包括：通過敲除基因 cpsge1或?qū)srna導(dǎo)入病原菌體內(nèi)來防治板栗疫病和楊樹炭疽病。

21、進(jìn)一步地，導(dǎo)入方法為將dsrna與病原菌共培養(yǎng)，或者將dsrna噴施在板栗或楊樹上。

22、本發(fā)明具有以下有益效果：

23、本發(fā)明提供了一種與板栗疫病菌致病性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，該基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；本發(fā)明還提供了該基因的dsrna，dsrna以如seq?id?no.1所示的核苷酸序列為模板，采用dsrna合成試劑盒合成。在本發(fā)明中，dsrna的核苷酸序列優(yōu)選為seqid?no.3、seq?id?no.4或seq?id?no.5。此外，本發(fā)明還提供了所述dsrna或者基因 cpsge1在板栗疫病防治中的應(yīng)用。該dsrna可干擾板栗疫病菌致病關(guān)鍵基因 cpsge1的表達(dá)，影響板栗疫病菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、脅迫耐受和侵染板栗枝條的過程，進(jìn)而有助于板栗疫病防治，且可適用于包括楊樹炭疽病在內(nèi)的其它植物真菌病害。