本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子免疫領(lǐng)域，尤其涉及一種脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、ampk(amp-activatedprotein?kinase)是一種amp依賴性蛋白激酶，在真核細胞能量代謝調(diào)控中發(fā)揮了重要的作用。ampk能夠感受細胞內(nèi)能量水平的變化，并通過激活atp合成途徑和抑制atp消耗途徑調(diào)控機體能量平衡。真核細胞中ampk結(jié)構(gòu)較為保守，由α、β和γ三個異源亞基組成。其中α亞基作為催化亞基是ampk激活的決定因素。

2、作為機體能量代謝的“調(diào)節(jié)器”，ampk參與了水生生物應(yīng)對環(huán)境脅迫時的響應(yīng)和調(diào)節(jié)。例如在鹽度脅迫下，水生動物會消耗大量能量用以抵抗脅迫環(huán)境。因此通過分析ampkα亞基表達變化，可以深入了解機體應(yīng)對不同環(huán)境脅迫時能量代謝變化和調(diào)控機制。

3、脊尾白蝦是中國東部沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟蝦類養(yǎng)殖品種之一，屬于廣鹽性蝦類。由于脊尾白蝦鹽度適應(yīng)范圍廣，越來越多的研究人員開始嘗試將脊尾白蝦引入到內(nèi)陸低鹽水域養(yǎng)殖，增加內(nèi)陸地區(qū)低鹽水域養(yǎng)殖利用率，且取得了較好的成果。但是研究發(fā)現(xiàn)在低鹽等環(huán)境脅迫下脊尾白蝦會消耗大量能量用于滲透調(diào)節(jié)，進而影響其正常生長發(fā)育。因此開展蝦類鹽度脅迫下機體能量調(diào)控機制研究，對于脊尾白蝦良種選育和鹽堿水域健康養(yǎng)殖具有重要的理論和實踐意義。ampkα亞基蛋白抗體對于深入研究ampk功能以及脊尾白蝦應(yīng)對低鹽等環(huán)境脅迫下機體能量代謝變化具有重要意義。然而目前，市面上ampkα抗體極少，且主要針對脊椎動物，在脊尾白蝦中的特異性較低，嚴重阻礙了不同環(huán)境脅迫下蝦類能量代謝調(diào)控機制研究。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明旨在提供一種脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體的制備方法，本發(fā)明首次表達獲得了脊尾白蝦ampkα蛋白抗原，通過原核表達系統(tǒng)獲得ampkα重組蛋白，將其作為抗原免疫動物后獲得的多克隆抗體具有良好的特異性。

2、本發(fā)明還提供了一種脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體的應(yīng)用。

3、技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述一種脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

4、(1)構(gòu)建含有如seq?id?no.1所示ampkα目的基因片段的重組表達載體；

5、(2)將重組表達載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞并誘導(dǎo)表達融合蛋白，收集并純化后得到ampkα重組蛋白；

6、(3)將ampkα重組蛋白作為抗原進行動物免疫處理，收集分離抗血清，純化后獲得脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體。

7、進一步地，所述多克隆抗體的制備方法步驟(1)中seq?id?no.1所示的ampkα目的基因片段重組于pet-22b(+)載體的雙酶切位點之間。

8、進一步地，所述多克隆抗體的制備方法步驟(2)中誘導(dǎo)表達融合蛋白的方法為：將構(gòu)建的重組表達菌株挑取至lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至菌液濃度od?600為0.6-0.8后加入iptg培養(yǎng)，誘導(dǎo)融合蛋白表達4-16h。

9、進一步地，所述多克隆抗體的制備方法步驟(3)中免疫處理的動物為新西蘭大白兔。

10、進一步地，所述多克隆抗體的制備方法步驟(3)中動物免疫處理方法為：

11、(1)首次免疫：取純化好的ampkα重組蛋白與弗氏完全佐劑充分混勻，新西蘭大白兔皮下多點免疫目的抗原；

12、(2)二次免疫：首次免疫兩周后，取純化好的ampkα重組蛋白與弗氏不完全佐劑充分乳化混勻后，進行新西蘭大白兔皮下多點免疫；

13、(3)三次免疫：第二次免疫1周后進行三次免疫，取純化好的ampkα重組蛋白與弗氏不完全佐劑充分乳化混勻后，進行新西蘭大白兔皮下多點免疫；

14、(4)四次免疫：第三次免疫二周后進行四次免疫，取純化好的ampkα重組蛋白重組蛋白與弗氏不完全佐劑充分乳化混勻后，進行新西蘭大白兔皮下多點免疫。

15、進一步地，所述動物免疫處理方法步驟(3)中動物免疫處理的第四次免疫7-10天后，采集試驗動物血液，收集血清即得抗血清。

16、進一步地，所述多克隆抗體的制備方法步驟(3)中所述純化為運用sulfolinkcoupling?resin層析柱純化得到的純化抗體。

17、本發(fā)明一種脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體是通過所述脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體的制備方法制備制得。

18、本發(fā)明所述的多克隆抗體在檢測脊尾白蝦不同組織中ampkα蛋白表達中的應(yīng)用。

19、進一步地，所述組織為鰓組織。

20、本發(fā)明首次獲得脊尾白蝦ampkα基因序列和蛋白序列，并首次通過原核表達獲得ampkα重組蛋白抗原。利用重組蛋白首次獲得針對脊尾白蝦ampkα多克隆抗體。目前，市面上現(xiàn)有ampkα多克隆抗體在脊尾白蝦中的特異性較差，本發(fā)明獲得多克隆抗體特異性良好。

21、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點：

22、1、本方法制備的脊尾白蝦ampkα多克隆抗體效價高，靈敏度高，能特異識別出脊尾白蝦鰓組織ampkα，能夠較好應(yīng)用于脊尾白蝦生物學(xué)免疫檢測。

23、2、本發(fā)明填補了抗脊尾白蝦ampkα多克隆抗體的空白，為脊尾白蝦能量代謝研究奠定了基礎(chǔ)。

24、3、本發(fā)明將原核表達并純化后的ampkα多肽作為免疫原，對新西蘭兔進行4次免疫，取免疫后兔子的血制備抗血清，之后通過純化柱法將抗血清純化得到抗脊尾白蝦ampkα多克隆抗體，隨后進行elisa效價檢測，并通過western?blot檢測抗體的特異性，本方法制備抗體簡單，快速，成本低，特異性好。

技術(shù)特征：

1.一種脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述seq?id?no.1所示的ampkα目的基因片段重組于pet-22b(+)載體的雙酶切位點之間。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述誘導(dǎo)表達融合蛋白的方法為：將構(gòu)建的重組表達菌株挑取至lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至菌液濃度od?600為0.6-0.8后加入iptg培養(yǎng)，誘導(dǎo)融合蛋白表達4-16h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述免疫處理的動物為新西蘭大白兔。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述動物免疫處理方法為：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述動物免疫處理的第四次免疫7-10天后，采集試驗動物血液，收集血清即得抗血清。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述所述純化為運用sulfolink?coupling?resin層析柱純化得到的純化抗體。

8.一種脊尾白蝦ampkα蛋白多克隆抗體，其特征在于，所述多克隆抗體是通過權(quán)利要求1-7中任一一項所述制備方法制得。

9.一種權(quán)利要求8所述的多克隆抗體在檢測脊尾白蝦不同組織中ampkα蛋白表達中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述組織為鰓組織。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種脊尾白蝦AMPKα蛋白多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，所述脊尾白蝦AMPKα蛋白多克隆抗體的制備方法，包括構(gòu)建含有如SEQ?ID?NO.1所示AMPKα目的基因片段的重組表達載體pET?22b?AMPKα；將重組表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并誘導(dǎo)表達融合蛋白，收集并純化后得到AMPKα重組蛋白，重組蛋白為含有氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示的AMPKα重組蛋白；將AMPKα重組蛋白作為抗原進行免疫處理，純化后獲得脊尾白蝦AMPKα蛋白多克隆抗體。本方法制備的脊尾白蝦AMPKα多克隆抗體效價高，能特異識別出脊尾白蝦鰓組織AMPKα，能夠較好應(yīng)用于脊尾白蝦生物學(xué)免疫檢測。

技術(shù)研發(fā)人員：胡廣偉,范夢昊,程偉濤,姬南京,劉德雪,韓婉鈺,萬佳萱,王英豪,高煥
受保護的技術(shù)使用者：江蘇海洋大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23