本發(fā)明涉及生物,尤其涉及一種隨機型雙功能卡拉膠酶及應(yīng)用。
背景技術(shù):
1、卡拉膠是一種從紅藻中提取的天然陰離子硫酸線性多糖,由交替的β-d-吡喃半乳糖和α-d-吡喃半乳糖殘基或3,6-內(nèi)醚-α-d-吡喃半乳糖殘基組成。市場上常見的卡拉膠有三種:κ-卡拉膠、ι-卡拉膠和λ-卡拉膠??ɡz具有優(yōu)越的物理功能特性,如增稠、凝膠、彈性和穩(wěn)定能力,因此卡拉膠被廣泛用作乳制品、飲料、果凍等的食品添加劑。此外,卡拉膠還具有多種生物活性,如抗氧化、抗病毒、抗腫瘤和胃腸保護等。
2、多糖具有分子量大、粘度高、溶解性差且生物利用率低的缺點,所以需要降解得到低分子量多糖或寡糖來使用。由卡拉膠降解得到的低分子量卡拉膠及寡糖因其出色的溶解性、高生物利用率和多種生理活性而受到越來越多的關(guān)注,因此在食品、醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有相當(dāng)大的應(yīng)用潛力。目前最常見的卡拉膠降解方法是酸水解法和酶法降解,與酸水解法相比,酶法降解獲取低分子量卡拉膠及寡糖反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)清晰,同時符合目前綠色清潔生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。
3、ι-卡拉膠酶可特異性降解ι-卡拉膠的β-1,4-糖苷鍵,并產(chǎn)生低分子量ι-卡拉膠及其寡糖。隨機型ι-卡拉膠酶是制備不同分子量ι-卡拉膠和系列寡糖的理想工具。然而目前研究報道的ι-卡拉膠酶均為連續(xù)型ι-卡拉膠酶,只能連續(xù)不斷地切割ι-卡拉膠,產(chǎn)生固定的寡糖片段,產(chǎn)物主要集中為一種聚合度的寡糖,如ι-卡拉膠四糖。而隨機型ι-卡拉膠酶的發(fā)掘可為ι-卡拉膠的降解提供重要工具,為不同分子量ι-卡拉膠及系列寡糖的制備提供前提。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是沒有隨機型ι-卡拉膠酶被報道,低分子量卡拉膠及不同聚合度寡糖制備無酶可用的問題。
2、為解決上述問題,本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一個含n端信號肽、ι-卡拉膠酶催化域以及一個c端分泌域的蛋白序列,其中的催化域由425個氨基酸組成,該催化域氨基酸序列如seq?idno.1所示,并進一步闡明了該酶可以隨機內(nèi)切方式作用于ι-卡拉膠,同時可作用于κ-卡拉膠。在此基礎(chǔ)上利用該隨機型雙功能卡拉膠酶實現(xiàn)不同分子量ι-卡拉膠及不同聚合度ι-卡拉膠寡糖的制備。
3、為達到上述目的,本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):一種隨機型雙功能卡拉膠酶及應(yīng)用,該酶氨基酸序列為seq?id?no.1以及經(jīng)過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸且仍具有隨機型雙功能卡拉膠酶活性的,由seq?id?no.1所衍生的酶,以及與seq?id?no.1同源性大于70%的seq?id?no.2與seq?id?no.3等其他序列。
4、seq?id?no.1:
5、qpdapsmfpvdrvesdfftddsasfppaqritlvnnvgddsttlqtaidyltglgggvitisa
6、gtwefneirlrsnvhlmfdalavvkpyetadvnslpnlsvfrigytsvkssnvsiralsgqf
7、kidlthlaketritpfnvkeaenfmvadcyiddngtihaalncsaskrndiwtgpvkglik
8、nltsinahggygvvqvrtgerllfkdltslrggvtlrlesddvsasggaiplsvakmseisg
9、ynikctegnaavmlqpwdatngwvdvqkiqatgcmaavridkaylstigtfdpdsritdv
10、ttsygtdaqvkqgvhpwvpcvlrmnpailrpnpipdmetyhlgpsiapllyrasttggatg
11、ngyysvnvptstelmnkatgfnwsvslvisrddnqvntnncpplsvdsydsvnnlk
12、seq?id?no.2:
13、qpdapsmfpvdrvesdfftddsasfppaqritlvnnvgddsttlqtaintltglgggvvtis
14、agnwefneiqlksnvhlmfdalavvkpyetadvnslpnlsvfrigytsvkssnvsiralsg
15、qfkidlthlaketritpfnvketenfmvadcyiddngtihaalncsaskrndiwtgpvkgli
16、knltsinahggygvvqvrtgerllfkdltslrggvtlrlesddvsasggaiplsvakmseis
17、gynikctegnaavmlqpwdatngwvdvqkieatgcmaavridraylstigtfdpdsritd
18、vtssygtnaqvkqgvfpwvpcvlrtdpnilrpnpipdmetyhlgpsiapllyrasttggatg
19、ngyysinvptstelmnkatgfnwsvslvisrdnnqvnsnncpalsvnsfdieshvk
20、seq?id?no.3:
21、splpefrneadfftdssgkypaapssqritlvynpatgddspalqtaintltnltvmvngenl
22、kggvitipagtwefneiqlksdvhlvfdplaivkpydavsptnpqipnmsifrigytgvlsen
23、vsirassgqfkvdlthldketritpfnvkeaknfmvadcfvddngtihaalncsaskrnni
24、wagpvkglvknltiinghggygvvqvrtgekllfknltslrggvtlrlesddvsasggvip
25、qevakmseifgynikctdgnaavmlqpwsavngwidiqkieatgcmaavridkafdkvspf
26、vgvgffdsssritditsayginahvkqgifpwvpcklrtnpeilrpnpipnmetfylgpsvapl
27、lyrasttggavgdgyysinvptenelktnasgfdwsislvisrddnqvntsncppalavntf
28、eidnnlk
29、聚半乳糖醛酸酶能夠水解聚半乳糖醛酸中半乳糖醛酸之間的α-1,4糖苷鍵,屬于28糖苷水解酶家族。卡拉膠酶可作用于卡拉膠分子內(nèi)的β-1,4糖苷鏈,產(chǎn)生一系列聚合度為偶數(shù)的卡拉膠寡糖。因此,隨機型雙功能卡拉膠酶與聚半乳糖醛酸酶作用機理不同。
30、進一步的,應(yīng)用時,對ι-卡拉膠的反應(yīng)溫度為45~60℃,最適反應(yīng)溫度為55℃;對κ-卡拉膠的反應(yīng)溫度為40~55℃,最適反應(yīng)溫度為50℃。
31、進一步的,應(yīng)用時,對ι-卡拉膠和κ-卡拉膠的最適反應(yīng)ph均為7.0。
32、基于上述隨機型雙功能卡拉膠酶建立ι-卡拉膠分子量可控酶解模型;控制酶解時間、加酶量得到不同分子量的ι-卡拉膠。
33、進一步的,所述模型的擬合方程為log10(y)=3.190863-0.0082655x1-0.1347936x2+0.0054209x22;其中,降解產(chǎn)物分子量y、加酶量x1、反應(yīng)時間x2。
34、編碼上述隨機型雙功能卡拉膠酶的基因seq?id?no.1所對應(yīng)的核苷酸序列如seqid?no.4所示及可翻譯出seq?id?no.1的所有基因。
35、seq?id?no.4:
36、caacctgatgcaccttcaatgtttccagtcgatagagtagaaagtgatttttttactgat
37、gattcggctagttttcctccagcacaaagaataaccttggttaataatgtgggagacgat
38、tctactacattacaaactgctatagattacctaactggtcttggaggtggtgttattacga
39、tttctgctggaacttgggaatttaatgaaatccgattgcgctctaatgtgcatttaatgtt
40、tgatgctttagcagtagttaaaccatatgaaacggcggacgttaatagtcttcctaattta
41、tctgtttttcgtattggatatacctcggtaaaatcaagtaacgtgagcattagagcctta
42、agcggtcaatttaaaatagatttaacccatttagcgaaagaaaccaggattacacccttc
43、aacgtaaaagaagctgaaaattttatggtggccgattgttatatagatgataacggcacc
44、attcatgcggctctaaattgttctgctagtaagagaaacgacatttggacaggaccagt
45、taaaggtttaataaaaaatttaaccagtataaatgcccatggcggttatggtgttgttca
46、ggtacgaaccggagaacggttgctgtttaaagatttaacatccttacgtggtggtgtaa
47、cacttcgtcttgaaagcgatgacgttagtgcctctggaggagctattccactaagtgtt
48、gcaaaaatgtctgagatttcaggatataatattaaatgtaccgaaggaaatgcagcagtg
49、atgctgcaaccgtgggatgccacaaatggatgggttgatgtacaaaaaattcaagcgac
50、tggttgtatggcggcggtacgtattgataaggcttatttaagcaccattggaaccttcga
51、tccagattcaagaataacagatgttaccaccagttatggtacagatgcgcaggtaaaac
52、aaggagtacatccatgggtgccatgtgtattaagaatgaatccagctattttaagaccta
53、atcctattcccgatatggaaacatatcatcttggaccctcaattgccccattactttatcgt
54、gcaagtaccactggaggtgctacaggtaacggatattatagcgtaaatgtcccaacttc
55、aactgagcttatgaataaagcaacaggttttaattggtctgtttcattagttatatcaag
56、agatgataatcaggtaaacacaaataattgtccaccattatcagttgattcttatgatagt
57、gttaacaatttgaaataa
58、利用上述基因表征的蛋白可降解ι-卡拉膠和κ-卡拉膠獲得多種不同聚合度的卡拉膠寡糖。
59、本發(fā)明提供了一種上述隨機型雙功能卡拉膠酶的制備方法,將酶異源表達在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、畢赤酵母等體系中,通過誘導(dǎo)產(chǎn)酶即可大量制備隨機型雙功能卡拉膠酶。上述的隨機型雙功能卡拉膠酶成功異源表達在了大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、畢赤酵母等體系中可用于大量生產(chǎn)、制備目標(biāo)酶,且在大腸桿菌表達體系中表達活力最高,可有效地應(yīng)用于化學(xué)分析、食品工業(yè)等領(lǐng)域。
60、本發(fā)明的有益效果在于:
61、(1)本發(fā)明的隨機型雙功能卡拉膠酶基因可以通過克隆表達的方式實現(xiàn)隨機型雙功能卡拉膠酶的高效制備;
62、(2)本發(fā)明的隨機型雙功能卡拉膠酶能夠以隨機內(nèi)切方式降解ι-卡拉膠和κ-卡拉膠;
63、(3)本發(fā)明的隨機型雙功能卡拉膠酶能夠?qū)崿F(xiàn)不同聚合度卡拉膠寡糖的制備;
64、(4)本發(fā)明的隨機型雙功能卡拉膠酶能夠?qū)崿F(xiàn)不同分子量卡拉膠的精準(zhǔn)制備。