本發(fā)明涉及一種微生物高通量分子檢測方法，特別涉及一種基于openarray芯片的介水原蟲和/或蠕蟲的高通量分子檢測方法，屬于環(huán)境監(jiān)測領域。

背景技術：

1、水中對公共健康風險最大的是微生物，水是許多病原體傳播的常見媒介。水傳播的病原體可以分為三類：細菌、病毒和寄生蟲，后者包括原生動物和蠕蟲。原生動物是指一種單細胞真核生物，包括孢子蟲(細胞內寄生蟲)、鞭毛蟲(具有尾巴狀結構用于運動)、變形蟲(使用臨時的細胞體突起為假足)和纖毛蟲(通過擊打多個毛發(fā)狀結構稱為纖毛來運動)。

2、許多介水傳播原蟲和蠕蟲是人畜共患的，即它們可以同時感染人類和動物。它們在環(huán)境中的濃度通常比較低，但仍然可能帶來相當大的公共衛(wèi)生風險，引起水中傳染性疾病的發(fā)生，尤其是老人、兒童和獲得性免疫缺陷綜合癥患者更加容易患病。

3、隱孢子蟲是造成發(fā)展中國家兒童死亡的很重要的原因之一。藍氏賈第鞭毛蟲(g.lamblia)(也稱十二指腸賈第鞭毛蟲)污染全球的供水，攝入其囊腫可導致賈第蟲病是一種急性自限性胃腸炎。雖然大多數(shù)原生動物暴發(fā)是由隱孢子蟲和賈第蟲(“兩蟲”)引起的，并已經(jīng)列入《國家生活飲用水衛(wèi)生標準》，但其他原生動物種類如剛地弓形蟲、溶組織內阿米巴、微孢子蟲、棘阿米巴和人芽囊原蟲以及一些蠕蟲，也與水傳播的疫情有關。這些原生動物和蠕蟲污染飲用水或休閑水會增加水傳播疾病的風險，然而目前鮮有相關信息，和目前的原蟲和蠕蟲等的高通量檢測方法確實存在密切的關系。

4、目前國內外對原蟲和蠕蟲等病原性寄生蟲的檢測方法主要有針對單獨類型物種的顯微鏡檢測，實時定量pcr(qpcr)，巢氏pcr(nested?pcr),流式細胞計數(shù)法，環(huán)介導等溫擴增(lamp)等方法。針對介水原蟲和蠕蟲的高通量檢測方法目前沒有相關文章和專利。

5、顯微鏡檢測的一個主要缺點是無法識別寄生蟲的種類，受到光學系統(tǒng)的限制，顯微鏡檢測的分辨率有限，顯微鏡檢測需要訓練有素的操作者來正確操作顯微鏡和識別樣本中的微生物，顯微鏡檢測通常需要耗費大量的時間來準備樣、觀察和識別原蟲，對于大規(guī)模分析或對于復雜樣品時，耗時耗力；

6、實時定量pcr(qpcr)通量較低，每個實驗定量一種或者兩種目標，樣品量和檢測目標數(shù)較多時需要耗費大量時間，增加了實驗的復雜性。

7、流式細胞計數(shù)法操作十分復雜，成本很高，流式細胞計數(shù)法通常用于檢測細胞的數(shù)量和大小，對于一些小型的原蟲可能需要額外的步驟或技術來增強其檢測的靈敏度和準確性，對于未知或不常見的原蟲，可能需要定制標記物和染料，進一步增加了實驗的復雜性和成本；

8、lamp需要設計多個引物，包括四個特異性引物以及兩個環(huán)引物，這些引物的設計相對復雜，需要考慮到目標序列的特點，以及引物之間的相互作用，增加了實驗的難度，lamp擴增產(chǎn)物通常是混合物，包括不同長度和結構的dna片段，實驗結果不易分析。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明主要針對基于顯微鏡檢測、定量qpcr、巢氏pcr，流式細胞計數(shù)法，以及環(huán)介質等溫擴增等方法檢測原蟲、蠕蟲等病原性寄生蟲存在檢測結果準確性差，檢測靈敏度低；耗時耗力；操作方法復雜，實驗難度高、實驗結果分析難度大、檢測步驟繁瑣，檢測成本高；檢測方法的穩(wěn)定性差等技術問題，提供一種基于openarray芯片的介水原蟲和/或蠕蟲的高通量分子檢測方法，本發(fā)明方法基于openarray芯片設計檢測目標物種為22種介水原蟲、蠕蟲的引物探針，進行實時熒光pcr檢測，可實現(xiàn)192個樣品的22個目標物種的同時檢測，極大的縮短了檢測時間，顯著提供檢測效率，減少人工操作、減少人工操作誤差，檢測速度快，檢測結果準確性高，實現(xiàn)了介水傳播原蟲和蠕蟲的高通量分子檢測。

2、為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種介水原蟲和/或蠕蟲的高通量分子檢測方法，包括如下進行的步驟：

3、1)設計引物、探針

4、依據(jù)待檢測目標物種的特異性基因選擇目的基因，通過primer設計引物、探針；

5、2)制備陽性對照質粒

6、首先：以步驟1)中設計引物、探針時所選擇的目標物種的目的基因為基礎，截取正向引物前面20bp作為陽性質粒制備的目的基因的開始位置；截取反向引物后面20bp作為陽性質粒制備的目的基因的結束位置，獲得各目標物種分別對應的陽性質粒制備的目的基因；接著：將各目標物種對應的陽性質粒制備的目的基因、16s?rrna基因、18s?rrna基因，克隆至大腸桿菌克隆載體上，獲得陽性質粒；

7、3)提取采集的環(huán)境樣本的dna，獲得環(huán)境待測樣本dna，備用；

8、4)制備加樣openarray芯片

9、4-1)首先：按照基因表達芯片的版式，在下載的sample?tracker軟件中的96孔板上加載待檢樣品的名稱及各樣品在96孔板上的位置信息；接著：再通過sample?tracker軟件將96孔板上樣品的名稱、位置信息分別對應到384孔板(openarray芯片專屬384孔板)上；然后：通過sample?tracker軟件，將各待檢樣品在96孔板、384孔板中加樣排列方式(即樣品排版方式)的文件導出，并準確記錄；

10、4-2)按照步驟4-1)中導出的加樣排列方式(樣品排版方式)將待檢樣品分別加入到96孔板的對應的小孔中；

11、4-3)向openarray芯片專屬384孔板中加入real-time?pcr?master?mix(即openarray反應預混液)；接著按照步驟4-1)中導出的加樣排列方式將96孔板中的待檢樣品dna分別加入到384孔板中對應的小孔內；封膜，制得加樣384孔板；

12、4-4)將步驟4-3)制備的加樣384孔板置于accufill儀器的384模塊上，將openarray芯片置于accufill儀器的plate?holder上，其中open?array芯片的barcode面朝上放在plate?holder的左面；開啟accufill儀器，將加樣384孔板上的待檢樣品轉移至openarray芯片上，制得加樣openarray芯片；

13、5)實時熒光pcr檢測

14、將步驟4)制備的加樣openarray芯片置于applied?biosystems?quantstudio?12kflex?system儀器中，進行實時熒光定量pcr檢測，測定樣品中含有的各物種的目的基因的ct值，從而獲知環(huán)境樣本中的介水原蟲、蠕蟲的種類、含量。

15、其中，步驟1)中所述的待檢測目標物種為22種介水原蟲、蠕蟲，具體為：賈第鞭毛蟲、藍氏賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、人型隱孢子蟲、火雞隱孢子蟲、溶組織內阿米巴、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴屬、卡伯特森氏棘阿米巴、卡氏棘阿米巴、多噬棘阿米巴、環(huán)孢子蟲、剛地弓形蟲、人芽囊原蟲、畢氏腸微孢子蟲、腦炎微孢子蟲屬、貝氏等孢子球蟲、結腸小袋纖毛蟲、血吸蟲屬、麥地那龍線蟲、棘球絳蟲。

16、特別是，所述檢測22種介水原蟲、蠕蟲的引物、探針分別為：

17、

18、

19、特別是，步驟1)中所述探針的5′-端熒光基團(即熒光染料)如下：

20、

21、特別是，所述探針5′-端熒光基團優(yōu)選為最大發(fā)射峰為～520nm的6-fam，3′-端的淬滅基團為mbg。

22、特別是，步驟2)中采用酶切法將各目標物種對應的陽性質粒制備目的基因、16srrna基因、18s?rrna基因，一起克隆至大腸桿菌克隆載體puc57上，獲得陽性對照質粒。

23、特別是，所述16s?rrna基因為細菌的16s?rrna基因；所述18s?rrna基因為真核生物的18s?rrna基因。

24、尤其是，所述陽性質粒，由賽默飛公司(thermofisher公司)合成。

25、本發(fā)明的陽性對照質粒包括24個檢測目標的特異性基因片段，即包括22個目標物種對應的陽性質粒制備的目的基因、16s?rrna基因和18s?rrna基因。制備的陽性質粒濃度為1×107copies/μl。

26、特別是，步驟3)中采用dna提取試劑盒對采集的環(huán)境樣本進行dna提取。

27、特別是，所述的dna提取試劑盒為本領域中現(xiàn)有、已知的dna提取試劑盒，例如dneasy?tissue試劑盒(增加液氮冷凍和沸水融化和超聲過程)、qiaamp?dna?stoolminithe試劑盒、mag?extractor-genome試劑盒、quick-dna?faecal/soil?microbe試劑盒、epicentre?masterpure?complete(mpc)dna和rna?purification試劑盒或spinfor?soil?dna試劑盒。

28、特別是，步驟3)中所述的采集的環(huán)境樣本為水樣，則先采用碳酸鈣絮凝法對環(huán)境水樣樣本進行濃縮、富集處理，獲得濃縮樣品后再提取水樣樣本的dna。

29、特別是，按照如下步驟進行所述的采用碳酸鈣絮凝法濃縮、富集處理環(huán)境水樣樣本：

30、a)在攪拌狀態(tài)下，向采集的水樣中依次加入cacl2溶液(1mol/l、100ml)、nahco3溶液(1mol/l、100ml)，同時通過向水樣中添加naoh溶液(10mol/l)或/和hcl溶液(3mol/l)，調節(jié)水樣樣本的ph；在水樣樣本的ph保持為10±0.05的條件下對樣本中的原蟲和蠕蟲進行絮凝處理；

31、b)絮凝處理至少30min后，靜置12-16小時；然后虹吸去除上清液，獲得原蟲和蠕蟲絮凝沉淀(簡稱“原-蠕”絮凝沉淀)；

32、c)向“原-蠕”絮凝沉淀中加入氨基磺酸溶液(質量百分比濃度10％，200ml)，攪拌，進行復溶處理，“原-蠕”絮凝沉淀溶解，獲得“原-蠕”復溶液；

33、d)使用離心機對“原-蠕”復溶液進行離心處理(2000g，10min)；棄去上清液，獲得離心沉淀，即“原-蠕”離心沉淀(濃縮樣品)。

34、特別是，步驟4-1)中所述的待檢樣品為環(huán)境待測樣本、陽性對照質粒、陰性對照去rna酶水。

35、特別是，所述樣品排版方式為待檢樣品的名稱，以及待檢樣品在96孔板、384孔板中的位置。

36、特別是，步驟4-2)中，在96孔板的每個小孔中加入的各自對應的待檢樣品的dna的量為5μl。

37、特別是，環(huán)境待測樣本dna的濃度為20±1ng/μl；每孔中加入的各自對應的環(huán)境待測樣本dna的量為5μl，陽性對照為5μl、陰性對照為5μl。

38、特別是，步驟4-3)中加入到384孔板中每個孔中的待檢樣品dna與openarray芯片反應預混液的體積之比為1:1。

39、特別是，加入到384孔板中每個孔中的待檢樣品dna為2.5μl；加入的openarray反應預混液的體積為2.5μl。

40、特別是，所述real-time?pcr?master?mix(即openarray反應預混液)，包含dna聚合酶，dntp等物質的混合物。

41、特別是，步驟4-4)中的每片openarray芯片上面有48個子陣，每個子陣上包括64個通孔。

42、特別是，步驟4-4)中所述的openarray芯片的每個子陣的小孔內固定待檢測目標物種所對應的引物和探針。

43、特別是，openarray芯片的一個小孔內固定一個待檢測目標物種的引物和探針。

44、特別是，在openarray芯片的每個子陣中，每個待檢測目標物種的引物、探針至少固定在2個小孔內。

45、特別是，在openarray芯片的每個子陣的進樣口、出樣孔分別留出4個小孔不使用，在其它56個小孔內分別固定步驟1)設計的待檢測目標物種對應引物和探針。

46、特別是，在openarray芯片的每個子陣的小孔內還分別固定有16s?rrna基因和18srrna基因。

47、特別是，在openarray芯片的每個子陣中，16s?rrna基因、18s?rrna基因分別各自固定于2個小孔內。

48、特別是，步驟5)中所述實時熒光定量pcr檢測反應條件為：預變性：50℃，2分鐘；95℃，10分鐘；變性：95℃，15秒；退火和延伸：60℃，60秒；40個循環(huán)。

49、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的分子檢測方法具有如下優(yōu)點和好處：

50、1、本發(fā)明的基于openarray芯片的病原性寄生蟲的檢測方法的檢測效率高，采用本發(fā)明方法可以對19種介水原蟲、3種蠕蟲同時進行高通量分子篩查，檢測效率顯著提高；

51、2、采用本發(fā)明方法檢測環(huán)境中含有的介水原蟲、蠕蟲的種類和濃度，檢測結果準確性高，可信度高，按照本發(fā)明方法建立的檢測22種介水原蟲、蠕蟲的標準曲線的相關系數(shù)r2的范圍為0.983-0.998，實時熒光pcr擴增的每個循環(huán)目標dna分子拷貝數(shù)增加比例高，擴增效率e的范圍達到80-109％，即本發(fā)明方法的高通量檢測的擴增效率在80-109％之間，表明本發(fā)明方法的檢測結果準確，可靠、可以真實反映實際情況。

52、3、采用本發(fā)明方法檢測環(huán)境中含有的介水原蟲、蠕蟲的種類和濃度，對檢測目標具有很好的重復性和穩(wěn)定性，檢測結果可信度高。

53、4、本發(fā)明的介水原蟲、蠕蟲的檢測方法，檢測速度快，檢測結果準確性高，實現(xiàn)了介水傳播原蟲和蠕蟲的高通量檢測。

54、5、本發(fā)明方法可以同時實現(xiàn)192個樣品的22個目標物種的同時檢測，極大的縮短了檢測時間，檢測效率明顯提高。

55、6、本發(fā)明方法的人工操作少，減少了人工操作的誤差。