本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域。具體地說，本發(fā)明涉及一類自組裝三聚體蛋白及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、靶向抗體/蛋白具有特異性高、副作用小、半衰期長等優(yōu)勢，是一種非常具有發(fā)展前途的生物治療的方法。靶向蛋白藥物已逐漸成為臨床治療的重要手段。然而，由于疾病發(fā)生、發(fā)展的復雜性和多因素性，僅僅依靠單一靶標的單靶向抗體很難取得更好的療效。目前，靶向抗體/蛋白主要是基于抗體fc的ch3結(jié)構(gòu)域形成二聚體的雙價結(jié)構(gòu)。絕大多數(shù)的多價抗體/融合蛋白都是基于抗體ch3形成二聚體結(jié)構(gòu)的基礎上進行的改造。限制了具有更加復雜結(jié)構(gòu)的多價抗體/融合蛋白的設計與轉(zhuǎn)化應用。

2、因此，本領域需要開發(fā)一種自組裝的多聚體蛋白。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的就是提供一種自組裝的多聚體蛋白。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種自組裝小蛋白，所述小蛋白包含選自下組的氨基酸序列：

3、(1)如seq?id?no:1、3、5、7、9或11所示的氨基酸序列；

4、(2)與seq?id?no:1、3、5、7、9或11所示的氨基酸序列同源性≥90％(較佳地≥95％，更佳地≥98％)，并且能夠自發(fā)形成三聚體蛋白的氨基酸序列。

5、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包含如本發(fā)明第一方面所述的自組裝小蛋白和一個或多個功能性多肽。

6、在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白從n端到c端具有如式i-式iii中任一項所示的結(jié)構(gòu)，

7、m-l1-fx???????(式i)

8、fx-l1-m????????(式ii)

9、fx-l1-m-l2-fx???????(式iii)

10、其中，

11、m為如本發(fā)明第一方面所述的自組裝小蛋白；

12、l1和l2各自獨立地為無或接頭；

13、fx為x個功能性多肽；

14、“-”表示連接上述元件的肽鍵、連接肽或接頭；

15、其中x為選自1、2、3或4的整數(shù)。

16、在另一優(yōu)選例中，所述的功能性多肽為靶向多肽。

17、在另一優(yōu)選例中，所述的功能性多肽選自下組：抗體、配體、受體、或其活性片段、或其組合。

18、在另一優(yōu)選例中，所述的功能性多肽選自下組：抗原結(jié)合片段(fab)、單鏈抗體(scfv)、單域抗體(sdab)、受體蛋白膜外區(qū)、配體、或其組合。

19、在另一優(yōu)選例中，所述的功能性多肽為pd-l1結(jié)合小蛋白。

20、在另一優(yōu)選例中，所述的功能性多肽氨基酸序列如seq?id?no:17所示。

21、在另一優(yōu)選例中，所述接頭為柔性接頭。

22、在另一優(yōu)選例中，所述接頭的氨基酸序列如(g4s)n所示，其中n為選自1-6的整數(shù)。

23、在另一優(yōu)選例中，所述接頭的氨基酸序列如seq?id?no:18所示。

24、在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白氨基酸序列如seq?id?no:13或15所示。

25、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種多聚體蛋白，所述多聚體蛋白包含多個蛋白單體，所述的蛋白單體選自：如本發(fā)明第一方面所述的自組裝小蛋白、如本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、或其組合。

26、在另一優(yōu)選例中，所述的多聚體蛋白為三聚體蛋白，其包含3個所述的蛋白單體，或由其組成。

27、在另一優(yōu)選例中，所述的多聚體蛋白為同源多聚體或異源多聚體(如同源三聚體或異源三聚體)。

28、在另一優(yōu)選例中，所述的多聚體蛋白通過所述自組裝小蛋白的結(jié)合形成。

29、在另一優(yōu)選例中，所述的多個蛋白單體含有氨基酸序列相同或不同的自組裝小蛋白。

30、在另一優(yōu)選例中，所述的多個蛋白單體含有氨基酸序列相同的自組裝小蛋白。

31、在另一優(yōu)選例中，所述的多個蛋白單體含有相同或不同的功能性多肽。

32、在另一優(yōu)選例中，所述的功能性多肽為靶向多肽，并且所述多個蛋白單體含有的靶向多肽分別特異性結(jié)合不同靶點。

33、在本發(fā)明的第四方面，提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼如本發(fā)明第一方面所述的自組裝小蛋白、或如本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白。

34、在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸的序列如seq?id?no:2、4、6、8、10、12、14或16所示。

35、在本發(fā)明的第五方面，提供了一種載體，所述載體中含有如本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸。

36、在本發(fā)明的第六方面，提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞中含有如本發(fā)明第五方面所述的載體，或基因組中整合有如本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸。

37、在本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物偶聯(lián)物，所述藥物偶聯(lián)物含有：

38、(a)如本發(fā)明第一方面所述的自組裝小蛋白、如本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白或如本發(fā)明第三方面所述的多聚體蛋白；和

39、(b)選自下組的偶聯(lián)部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞因子、放射性核素、或酶。

40、在另一優(yōu)選例中，所述偶聯(lián)部分為藥物或毒素。

41、在另一優(yōu)選例中，所述偶聯(lián)部分為可檢測標記物。

42、在另一優(yōu)選例中，所述偶聯(lián)物選自下組：熒光或發(fā)光標記物、放射性標記物、mri(磁共振成像)或ct(電子計算機x射線斷層掃描技術(shù))造影劑。

43、在本發(fā)明的第八方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括：

44、(a)如本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、如本發(fā)明第三方面所述的多聚體蛋白、如本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸、如本發(fā)明第五方面所述的載體、如本發(fā)明第六方面所述的宿主細胞、或如本發(fā)明第七方面所述的藥物偶聯(lián)物；和

45、(b)藥學上可接受的載體。

46、在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物用于免疫治療。

47、在另一優(yōu)選例中，所述組分(a)的含量為0.1-99.9wt％,較佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。

48、在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物的劑型為口服劑型、注射劑、或外用藥物劑型。

49、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物的劑型包括片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、或注射劑。

50、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物或制劑選自下組：混懸制劑、液體制劑或凍干制劑。

51、在另一優(yōu)選例中，所述液體制劑為水針制劑。

52、在另一優(yōu)選例中，所述藥學上可接受的載體包括：表面活性劑、溶液穩(wěn)定劑、等滲調(diào)節(jié)劑、緩沖液，或其組合。

53、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物或制劑的施用對象為包括人或非人動物。

54、在另一優(yōu)選例中，所述非人動物包括：嚙齒動物(如大鼠、小鼠)、靈長動物(如猴)。

55、在另一優(yōu)選例中，在所述藥物組合物或制劑的施用中，施用的量為0.01-10g/天，較佳地0.05-5000mg/天，更佳地0.1-3000mg/天。

56、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物或制劑用于抑制和/或治療腫瘤。

57、在另一優(yōu)選例中，對于腫瘤的治療，所述藥物組合物或制劑可以和其他的抗腫瘤藥聯(lián)合給藥。

58、在本發(fā)明的第九方面，提供了一種制備如本發(fā)明第三方面所述的多聚體蛋白的方法，包括步驟：

59、將多個如本發(fā)明第一方面所述的自組裝小蛋白和/或如本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白互相接觸，從而獲得所述三聚體蛋白。

60、在本發(fā)明的第十方面，提供了一種制備如本發(fā)明第一方面所述的自組裝小蛋白、或如本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、或如本發(fā)明第三方面所述的多聚體蛋白的方法，包括步驟：

61、(a)在合適的條件下，培養(yǎng)如本發(fā)明第六方面所述的宿主細胞，從而獲得含所述自組裝小蛋白或融合蛋白或三聚體蛋白的培養(yǎng)物；和

62、(b)對步驟(a)中得到的培養(yǎng)物進行純化和/或分離，獲得所述的自組裝小蛋白或融合蛋白或三聚體蛋白。

63、在本發(fā)明的第十一方面，提供了如本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、如本發(fā)明第三方面所述的多聚體蛋白、如本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸、如本發(fā)明第五方面所述的載體、如本發(fā)明第六方面所述的宿主細胞、或如本發(fā)明第七方面所述的藥物偶聯(lián)物在制備用于治療疾病的藥物中的用途。

64、在另一優(yōu)選例中，所述的疾病為pd-l1高表達的疾病。

65、在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤為表達pd-l1蛋白(即pd-l1陽性)的腫瘤。

66、在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括但不限于：急性髓細胞白血病、慢性粒細胞性白血病、多發(fā)性骨髓病、非霍奇金淋巴瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、大腸癌、胃癌、肝癌、白血病、腎臟腫瘤、肺癌、小腸癌、骨癌、前列腺癌、前列腺癌、宮頸癌、淋巴癌、腎上腺腫瘤、膀胱腫瘤，或其組合。

67、在本發(fā)明的第十二方面，提供了一種治療疾病的方法，包括步驟：向有需要的對象施用如本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、如本發(fā)明第三方面所述的多聚體蛋白、或如本發(fā)明第七方面所述的藥物偶聯(lián)物。

68、應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。