本發(fā)明涉及細胞內(nèi)mirna原位成像的探針設計，特別涉及近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)及其在檢測mirna-103中的應用。

背景技術(shù)：

1、多囊卵巢綜合征是一種臨床上高度異質(zhì)性的疾病，由育齡婦女復雜的內(nèi)分泌和代謝異常引起。多囊卵巢綜合征患者通常表現(xiàn)出復雜的表型，包括月經(jīng)不調(diào)、胰島素抵抗、卵泡發(fā)育異常、雄激素水平升高，甚至不孕。多囊卵巢綜合征還與肥胖、動脈高血壓和血脂異常有關，這增加了多囊卵巢綜合征患者終身患2型糖尿病和心血管疾病的風險。mirna-103作為多囊卵巢綜合征的潛在生物標志物，通過參與各種代謝和激素過程來調(diào)節(jié)多囊卵巢綜合征的發(fā)生和發(fā)展。因此，對mirna-103在細胞中，尤其是在卵巢顆粒細胞中的空間分布和表達水平進行直觀表征，將有助于闡明mirna-103在多囊卵巢綜合征中的生物分子功能，并為多囊卵巢綜合征患者提供有效的診斷和治療方案。

2、動態(tài)自組裝dna納米結(jié)構(gòu)具有高可編程性、結(jié)構(gòu)響應性和良好的生物相容性的優(yōu)點；在開發(fā)用于活細胞成像的高時空分辨率，智能響應mirna分子納米發(fā)夾探針方面具有廣闊的應用前景。目前，已開發(fā)出多種用于活細胞mirna擴增成像的策略。其中無酶等溫核酸擴增的催化發(fā)夾組裝策略，以其簡便、穩(wěn)健和再循環(huán)的特點，特別適用于臨床樣本mirna分析。然而，常規(guī)的催化發(fā)夾組裝納米發(fā)夾探針在到達目的細胞內(nèi)的位置之前，通常會與非目標分子結(jié)合，導致成像信噪比降低，時空分辨率下降。這一問題阻礙了使用傳統(tǒng)催化發(fā)夾組裝納米發(fā)夾探針對多囊卵巢綜合征卵巢顆粒細胞中低豐度mirna進行高靈敏度檢測和特異性分析。因此，急需開發(fā)一種高靈敏和可視化的檢測方法，用于多囊卵巢綜合征患者卵巢顆粒細胞中mirna-103成像。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)及其在檢測mirna-103中的應用，該近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)對于mirna-103檢測具有具有高時空可控性、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點，可實現(xiàn)低豐度mirna-103的擴增成像。具體通過以下技術(shù)實現(xiàn)。

2、本發(fā)明的第一方面，提供了一種近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)的構(gòu)建方法，所述近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)用于檢測mirna-103，包括以下步驟：

3、設計納米發(fā)夾探針lt-h1和h2；所述lt-h1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，并且在核苷酸序列自5’端起的第43位點修飾了熒光基團cy3，第48位點和49位點之間設有光裂解連接鍵；所述h2的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，并且在核苷酸序列的5’端修飾了熒光基團cy5。

4、可選地，光裂解連接鍵包括pc-linker。

5、進一步地，還包括步驟：制備油相上轉(zhuǎn)換納米顆粒，將所述油相上轉(zhuǎn)換納米顆粒與鹽酸室溫攪拌處理，清洗后得到水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒；將所述水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒和多聚賴氨酸在水中混合，室溫攪拌，清洗后得到多聚賴氨酸包覆的上轉(zhuǎn)換納米顆粒；

6、將多聚賴氨酸包覆的上轉(zhuǎn)換納米顆粒與所述納米發(fā)夾探針lt-h1和h2在緩沖液中混合、孵育。

7、更進一步地，多聚賴氨酸包覆的上轉(zhuǎn)換納米顆粒、納米發(fā)夾探針lt-h1和h2的摩爾比為1:(40-60):(40-60)。

8、較優(yōu)地，多聚賴氨酸包覆的上轉(zhuǎn)換納米顆粒、納米發(fā)夾探針lt-h1和h2的摩爾比為1:50:50。通過調(diào)節(jié)多聚賴氨酸包覆的上轉(zhuǎn)換納米顆粒、納米發(fā)夾探針lt-h1和h2的摩爾比，能夠調(diào)控構(gòu)建的近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)的zeta電位在-20～-40?mv，使得細胞對近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)展現(xiàn)出更高的攝取效率。

9、可選地，所述緩沖液的配方為：20?mm?tris-hcl、150?mm?nacl、5?mm?mgcl2，ph7.4。

10、更進一步地，制備油相上轉(zhuǎn)換納米顆粒nagdf4:yb/tm@nagdf4，將所述油相上轉(zhuǎn)換納米顆粒nagdf4:yb/tm@nagdf4與鹽酸超聲混合，在室溫下劇烈攪拌；依次用hcl-乙醇溶液、鹽酸和mq水（雙蒸水或超純水）清洗，得到的水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒；

11、將所述水相上轉(zhuǎn)換納米顆粒分散于mq水中，加入多聚賴氨酸混合，在室溫下暗色（即避光/黑暗環(huán)境）攪拌，得到多聚賴氨酸包覆的上轉(zhuǎn)換納米顆粒ucnp@pll；離心、洗滌，將所述ucnp@pll重新分散在mq水中備用。

12、本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測mirna-103的納米發(fā)夾探針組合，包括納米發(fā)夾探針lt-h1和h2；所述lt-h1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，并且在核苷酸序列自5’端起的第43位點修飾了熒光基團cy3，第48位點和49位點之間設有光裂解連接鍵；所述h2的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，并且在核苷酸序列的5’端修飾了熒光基團cy5。

13、本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于檢測mirna-103的近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)，采用上述任一項構(gòu)建方法構(gòu)建而成。

14、本發(fā)明的第四方面，提供了一種上述納米發(fā)夾探針組合的應用，用于不以疾病診斷和治療為目的的檢測非細胞環(huán)境中的mirna-103。

15、本發(fā)明的第五方面，提供了一種近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)的應用，用于不以疾病診斷和治療為目的的檢測細胞環(huán)境中的mirna-103；所述近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)采用上述任一項所述的構(gòu)建方法構(gòu)建獲得。

16、本發(fā)明提供的近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)，是通過在設計好的納米發(fā)夾探針lt-h1插入光裂解連接鍵，并在lt-h1的序列中修飾熒光染料cy3，在h2的序列中修飾熒光染料cy5，制備了光觸發(fā)dna納米發(fā)夾探針組合（lt-dp），包括lt-h1和h2。這一納米發(fā)夾探針組合lt-dp，能夠直接用于檢測非細胞環(huán)境中的mirna-103。

17、本發(fā)明聲稱的“不以疾病診斷和治療為目的”，是指非臨床條件下（例如在實驗室科研或教學過程中），進行細胞環(huán)境或非細胞環(huán)境中的mirna-103檢測。即只要不直接用于診斷或治療人體或動物體的與囊泡病毒相關的疾病/癥狀的應用場景，都可以采用本發(fā)明提供的上述技術(shù)手段。容易想到的是，在臨床中，也可以考慮采用本發(fā)明提供的納米發(fā)夾探針組合進行mirna-103檢測。

18、上述納米發(fā)夾探針lt-h1和h2中，lt-h1被設計為具有三個不同功能，包括識別mirna-103的功能域，修飾了光裂解連接鍵（pc-linker）的光激活域，以及與h2進行催化發(fā)夾組裝的結(jié)合域；同時還在lt-h1納米發(fā)夾探針上標記熒光團cy3。納米發(fā)夾探針h2則通過與lt-h1序列堿基互補配對設計得到，并在h2的5’端標記熒光團cy5。

19、具體地，納米發(fā)夾探針lt-h1和h2的核苷酸序列以及mirna-103（dna模擬物）的核苷酸序列，如下表1所示。

20、表1?納米發(fā)夾探針lt-h1和h2的核苷酸序列

21、

22、為了檢測細胞，尤其是多囊卵巢綜合征患者卵巢顆粒細胞中的mirna-103，需要制備可以將近紅外光轉(zhuǎn)換為紫外光，并且包覆有多聚賴氨酸的上轉(zhuǎn)換納米顆粒（即ucnp@pll）。然后通過靜電吸附作用，lt-dp（即lt-h1和h2）與ucnp@pll結(jié)合，構(gòu)建成相應的近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)。采用這種方法制備的近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)細胞中mirna-103的原位可視化成像。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益之處在于：

24、1、本發(fā)明構(gòu)建的近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)通過將光裂解連接體作為催化發(fā)夾組裝，避免了傳統(tǒng)催化發(fā)夾組裝納米探針的非特異性激活，提高了檢測的信噪比，在進行mirna-103檢測時具有優(yōu)異的檢測靈敏度和特異性。

25、2、本發(fā)明構(gòu)建的近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)通過與上轉(zhuǎn)換納米顆粒結(jié)合，在進行細胞成像時具有良好的探針遞送率和高時空分辨率，可以用于臨床或非臨床條件下多囊卵巢綜合癥患者卵巢顆粒細胞mirna-103的原位可視化成像。

26、3、本發(fā)明構(gòu)建的近紅外光驅(qū)動dna納米系統(tǒng)可用于不同亞型多囊卵巢綜合癥患者卵巢顆粒細胞內(nèi)mirna的精準檢測，精準區(qū)分不同mirna-103表達的正常人、肥胖型和非肥胖型多囊卵巢綜合癥患者卵巢顆粒細胞。