本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)氨酶突變體及其篩選方法，屬于轉(zhuǎn)氨酶制備。

背景技術(shù)：

1、轉(zhuǎn)氨酶(transaminase)是不對(duì)稱合成光學(xué)純手性胺的關(guān)鍵酶，為輔酶磷酸吡哆醛(plp)依賴型酶，在反應(yīng)過(guò)程中plp與5’-磷酸吡哆胺(pmp)會(huì)相互進(jìn)行轉(zhuǎn)換，同時(shí)催化氨基從合適的供體到羰基受體的可逆轉(zhuǎn)移，根據(jù)氨基被轉(zhuǎn)移到不同位置的氨基受體上，可將轉(zhuǎn)氨酶分為α-轉(zhuǎn)氨酶和ω-轉(zhuǎn)氨酶，α-轉(zhuǎn)氨酶需要一個(gè)α位置的羰基受體來(lái)發(fā)揮其催化功能，ω-轉(zhuǎn)氨酶可以催化任何結(jié)構(gòu)的酮酸、酮、醛和胺，并且具有優(yōu)異的立體選擇性，因此具有更高的應(yīng)用價(jià)值，可以更廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥中間體的合成中。

2、r-3-氨基哌啶是重要的醫(yī)藥中間體，主要用來(lái)合成二肽基肽酶-iv(dpp-iv)抑制劑，如阿格列汀(alogliptin)、利拉利汀(linagliptin)等降血糖藥物。利用化學(xué)合成方法合成(r)-3-氨基哌啶涉及較多試劑，且操作復(fù)雜，工序繁瑣，成本較高，且無(wú)法得到高光學(xué)純度的目標(biāo)產(chǎn)物，利用轉(zhuǎn)氨酶合成(r)-3-氨基哌啶方法轉(zhuǎn)化率高，選擇性好，工藝流程簡(jiǎn)單易行，綠色環(huán)保，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。

3、在(r)-3-氨基哌啶的工業(yè)化生產(chǎn)中，進(jìn)一步提高ω-轉(zhuǎn)氨酶的催化活性，從而達(dá)到催化效益最大化并且降低生產(chǎn)成本的目的地，是技術(shù)人員目前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題，其中關(guān)于轉(zhuǎn)氨酶突變體的篩選又是其中的難點(diǎn)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種轉(zhuǎn)氨酶突變體及其篩選方法，解決制備一種轉(zhuǎn)化效率高、催化效益好的轉(zhuǎn)氨酶的技術(shù)難題。

2、本發(fā)可以通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)，一種野生型轉(zhuǎn)氨酶，所述野生型來(lái)自節(jié)桿菌屬轉(zhuǎn)氨酶突變體為ω-轉(zhuǎn)氨酶，所述ω-轉(zhuǎn)氨酶的genbank登錄號(hào)為3wwj_a，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示；

3、所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體為seq?id?no:1所示的所述ω-轉(zhuǎn)氨酶氨基酸序列第67、69、155或283位中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)行單位點(diǎn)或多位點(diǎn)突變獲得。

4、進(jìn)一步的，所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體由序列seq?id?no.1所示的所述ω-轉(zhuǎn)氨酶氨基酸經(jīng)下列之一或多個(gè)位點(diǎn)突變而得：所述ω-轉(zhuǎn)氨酶第67位的酪氨酸突變?yōu)榫彼?、賴氨酸或異亮氨酸；所述?轉(zhuǎn)氨酶第69位的蘇氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷⒓琢虬彼峄蛄涟彼?；所述?轉(zhuǎn)氨酶第155位的谷氨酰胺突變?yōu)榘腚装彼?、絲氨酸或精氨酸；所述ω-轉(zhuǎn)氨酶第283位的蘇氨酸突變位苯丙氨酸、賴氨酸或甲硫氨酸。

5、進(jìn)一步的，所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的重組表達(dá)載體，通過(guò)將重組轉(zhuǎn)氨酶基因的核酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成。

6、進(jìn)一步的，所述載體選用pet-30a、pet-22b、prest?a等其中一種；

7、優(yōu)選的，質(zhì)粒載體選用pet-30a。

8、進(jìn)一步的，所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞及其衍生菌株。

9、進(jìn)一步的，所述宿主細(xì)胞選用大腸桿菌bl21(de3)、rosseta(de3)、大腸桿菌w3110等其中一種；

10、優(yōu)選的，宿主細(xì)胞選用大腸桿菌bl21(de3)。

11、轉(zhuǎn)氨酶突變體是將seq?id?no:1所示的氨基酸序列第67、69、155或283位中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)行單位點(diǎn)或多位點(diǎn)突變獲得，其中第67位的酪氨酸突變?yōu)榫彼?、賴氨酸或異亮氨酸；?9位的蘇氨酸突變?yōu)橘嚢彼?、甲硫氨酸或亮氨酸；?55位的谷氨酰胺突變?yōu)榘腚装彼帷⒔z氨酸或精氨酸；第283位的蘇氨酸突變位苯丙氨酸、賴氨酸或甲硫氨酸，最終得到具有較高酶活的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體，其催化活力是野生型轉(zhuǎn)氨酶的3倍，能夠高效的催化r-3-氨基哌啶的合成。

12、一種ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的高通量篩選方法，所述突變體的高通量篩選方法中應(yīng)用反應(yīng)液以哌啶酮為底物，以磷酸吡哆醛為輔酶，以d-丙氨酸為氨基供體，以葡萄糖、葡萄糖脫氫酶、乳酸脫氫酶、nad構(gòu)建輔酶偶聯(lián)系統(tǒng)，以酚紅為ph指示劑；在磷酸鹽緩沖液中加入ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體酶液，用分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度來(lái)篩選陽(yáng)性突變體。

13、進(jìn)一步的，對(duì)篩選完成的所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體進(jìn)行催化力篩選，所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的催化力篩選過(guò)程中應(yīng)用反應(yīng)液以哌啶酮為底物，以磷酸吡哆醛為輔酶，以異丙胺為氨供體；在tris-hcl緩沖液中加入ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體酶液，反應(yīng)結(jié)束后，以二氯甲烷萃取進(jìn)行hplc檢測(cè)，測(cè)定ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的催化力。

14、綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

15、本發(fā)明中，通過(guò)同源建模和分子對(duì)接等方式獲得一些對(duì)轉(zhuǎn)氨酶其化活性有影響的位點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)定點(diǎn)突變，最終得到具有較高酶活的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體，其催化活力是野生型轉(zhuǎn)氨酶的3倍，即相同時(shí)間內(nèi)，對(duì)20g/l的底物，轉(zhuǎn)化率由32%提高至96%，能夠高效的催化r-3-氨基哌啶的合成。

技術(shù)特征：

1.一種轉(zhuǎn)氨酶突變體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)氨酶突變體為ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體，所述ω-轉(zhuǎn)氨酶的genbank登錄號(hào)為3wwj_a，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)氨酶突變體，其特征在于：所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體由序列seq?id?no.1所示的所述ω-轉(zhuǎn)氨酶氨基酸經(jīng)下列之一或多個(gè)位點(diǎn)突變而得：所述ω-轉(zhuǎn)氨酶第67位的酪氨酸突變?yōu)榫彼?、賴氨酸或異亮氨酸；所述?轉(zhuǎn)氨酶第69位的蘇氨酸突變?yōu)橘嚢彼?、甲硫氨酸或亮氨酸；所述?轉(zhuǎn)氨酶第155位的谷氨酰胺突變?yōu)榘腚装彼?、絲氨酸或精氨酸；所述ω-轉(zhuǎn)氨酶第283位的蘇氨酸突變位苯丙氨酸、賴氨酸或甲硫氨酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種轉(zhuǎn)氨酶突變體，其特征在于：所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的重組表達(dá)載體，通過(guò)將重組轉(zhuǎn)氨酶基因的核酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種轉(zhuǎn)氨酶突變體，其特征在于：所述載體選用pet-30a、pet-22b、prest?a等其中一種。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種轉(zhuǎn)氨酶突變體，其特征在于：所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞及其衍生菌株。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種轉(zhuǎn)氨酶突變體，其特征在于：所述宿主細(xì)胞選用大腸桿菌bl21(de3)、rosseta(de3)、大腸桿菌w3110等其中一種。

7.一種采用權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的篩選方法，其特征在于：所述篩選方法包括高通量篩選與催化力篩選；

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種轉(zhuǎn)氨酶突變體的篩選方法，其特征在于：對(duì)篩選完成的所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體進(jìn)行催化力篩選，所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的催化力篩選過(guò)程中應(yīng)用反應(yīng)液以哌啶酮為底物，以磷酸吡哆醛為輔酶，以異丙胺為氨供體；在tris-hcl緩沖液中加入ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體酶液，反應(yīng)結(jié)束后，以二氯甲烷萃取檢測(cè)hplc，測(cè)定ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的催化力。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)氨酶突變體及其篩選方法，屬于轉(zhuǎn)氨酶制備技術(shù)領(lǐng)域。提供一種轉(zhuǎn)氨酶突變體及其篩選方法，轉(zhuǎn)氨酶突變體為ω?轉(zhuǎn)氨酶突變體，ω?轉(zhuǎn)氨酶的Genbank登錄號(hào)為3WWJ_A，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；ω?轉(zhuǎn)氨酶突變體為SEQ?ID?NO:1所示的ω?轉(zhuǎn)氨酶氨基酸序列第67、69、155或283位中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)行單位點(diǎn)或多位點(diǎn)突變獲得；本發(fā)明整體上具有轉(zhuǎn)化效率高、催化效益好的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：楊瑩,周慧,劉尚,黃雅文,朱凱,劉建鋒
受保護(hù)的技術(shù)使用者：宿遷阿爾法科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30