本發(fā)明涉及一種檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統(tǒng)及應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)、生物技術(shù)、基因工程。

背景技術(shù)：

1、蛋白質(zhì)的相互作用是研究蛋白質(zhì)生物學(xué)功能、信號通路網(wǎng)絡(luò)的重要環(huán)節(jié)。雙分子熒光互補（bimolecular?fluorescence?complementation,?bifc）實驗是利用熒光蛋白的發(fā)光特性來檢測蛋白質(zhì)相互作用的常用和強力手段，可直接、快速地判斷蛋白質(zhì)相互作用的情況及亞細胞定位。通過融合熒光蛋白報告基因的表達來判斷目標蛋白的亞細胞定位情況也是目前應(yīng)用最廣泛的一種方法。雙分子熒光互補實驗原理是將熒光蛋白（如eyfp）分割成n端和c端并組成相應(yīng)的完整表達盒，分別與待檢測蛋白連接后，將重組載體共轉(zhuǎn)染煙草葉肉細胞等，若兩蛋白能夠相互作用，會使熒光蛋白的n端片段與c端相互靠近，從而使熒光蛋白重新發(fā)出熒光。若兩蛋白間沒有相互作用，則不能激發(fā)產(chǎn)生熒光。開展雙分子熒光互補實驗通常需要細胞核等定位的marker，一般主要利用定位在細胞核的對照空載體或利用熒光染料dapi能夠與dna強結(jié)合的特性來指示細胞核的位置，但這兩種方式均具有一定的局限性。前者需要共轉(zhuǎn)染額外的包含核定位對照載體的農(nóng)桿菌，后者因dapi是一種可以穿透生物膜的高毒致癌物質(zhì)，使雙分子熒光互補實驗操作過程具有危害性。因此，有必要提供一種低成本、安全便捷的開展雙分子熒光互補實驗的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統(tǒng)及應(yīng)用，通過在雙分子熒光互補系統(tǒng)中引入核定位的dsred2紅色熒光標記，可避免使用高毒致癌的dna熒光染料dapi和單獨再使用核定位對照載體，適合應(yīng)用于研究植物蛋白間的相互作用。

2、本發(fā)明提供一種檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統(tǒng)，包括pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體，所述pbifc-nls-dsred2-enc載體包含能特異性指示細胞核定位的紅色熒光蛋白表達盒nls-dsred2和不能單獨產(chǎn)生熒光的neyfp表達盒dna分子；

3、所述紅色熒光蛋白表達盒nls-dsred2是由superpromoter啟動子序列、cor47-5′utr序列、細胞核定位信號nls序列、紅色熒光蛋白dsred2編碼區(qū)序列和終止子hsp-t878序列依次順序連接組成的表達盒；

4、所述neyfp表達盒dna分子是由2?×?camv?35s啟動子序列、translationalenhancer序列、nc?frame序列、neyfp編碼區(qū)序列和camv?35s?terminator序列依次順序連接組成的表達盒；

5、所述pbifc-ecc載體包含不能單獨產(chǎn)生熒光的ceyfp表達盒dna分子，所述ceyfp表達盒dna分子是由2?×?camv?35s啟動子序列、translational?enhancer序列、nc?frame序列、ceyfp編碼區(qū)序列和camv?35s?terminator序列依次順序連接組成的表達盒。

6、本發(fā)明利用能特異性指示細胞核定位的nls-dsred2融合蛋白、啟動活性更強的superpromoter、翻譯起始增強子cor47-5′utr和可顯著增加基因表達量的hsp-t878終止子對檢驗植物蛋白相互作用的bifc表達載體進行改進。本發(fā)明的雙分子熒光互補系統(tǒng)pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體整合有表達增強的nls-dsred2熒光蛋白，通過分別與相互作用的一組蛋白融合后，在不同激發(fā)光下能夠分別發(fā)出清晰且穩(wěn)定的紅色dsred2熒光信號和綠色yfp熒光信號，且不存在信號交叉干擾，紅色熒光信號能夠準確、特異定位在細胞核中，而yfp熒光信號可檢測兩個蛋白相互作用的定位情況。

7、本發(fā)明提供用于檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統(tǒng)，包括pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體。研究發(fā)現(xiàn)，細胞核定位信號nls能夠穩(wěn)定且特異地將蛋白質(zhì)定位到細胞核中。因此，利用更強的superpromoter啟動子、翻譯起始增強子cor47-5′utr和可顯著增加基因表達量的hsp-t878終止子以增強熒光蛋白信號，并通過細胞核定位信號nls將熒光蛋白dsred2特異性定位于細胞核，且dsred2表達盒串聯(lián)共表達于pbifc-enc載體中。兩個載體中的neyfp和ceyfp可通過分別與相互作用的蛋白融合后被靠近而重新產(chǎn)生yfp熒光，能夠?qū)崿F(xiàn)自帶核定位標記的植物蛋白相互作用檢測表達載體的創(chuàng)新性開發(fā)和應(yīng)用。通過將相互作用的蛋白編碼基因片段分別克隆到pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體中，即可在激光共聚焦/熒光顯微鏡下利用特異性定位在細胞核中的紅色熒光信號作為核定位marker，根據(jù)yfp熒光信號檢測兩個蛋白的相互作用及亞細胞定位情況，無需接觸高毒致癌的dna熒光染料dapi，同時避免了需額外使用核定位對照載體。

8、作為本發(fā)明進一步優(yōu)化的技術(shù)方案如下：

9、上述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統(tǒng)，所述紅色熒光蛋白表達盒nls-dsred2產(chǎn)生紅色熒光并用于特異性指示細胞核定位，所述neyfp表達盒、ceyfp表達盒dna分子分別與一個待檢測蛋白融合之后通過兩個待檢測蛋白的相互作用被拉近從而產(chǎn)生yfp熒光，通過激光共聚焦/熒光顯微鏡檢測紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白的表達情況。兩種熒光成像效果清晰、穩(wěn)定，且相互獨立。因此，利用此系統(tǒng)可進行便捷、低廉和安全的植物雙分子熒光互補實驗操作。

10、上述neyfp表達盒和ceyfp表達盒可通過分別與相互作用的蛋白融合后被靠近從而重新產(chǎn)生綠色yfp熒光，紅色dsred2熒光和綠色yfp熒光可通過激光共聚焦/熒光顯微鏡分別檢測到兩個相互獨立的熒光蛋白信號。

11、上述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統(tǒng)，所述紅色熒光蛋白表達盒nls-dsred2具有如seq?no.?1中第1-2928?nt所示的核苷酸序列，所述neyfp表達盒dna分子具有如seq?no.?2中第1-2315?nt所示的核苷酸序列，所述ceyfp表達盒dna分子具有如seqno.?3中第1-1988?nt所示的核苷酸序列。

12、上述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統(tǒng)中包含的pbifc-nls-dsred2-enc載體質(zhì)粒和pbifc-ecc載體質(zhì)粒及其構(gòu)建方法。

13、上述pbifc-nls-dsred2-enc載體質(zhì)粒含有同向串聯(lián)特異性指示細胞核定位的紅色熒光蛋白nls-dsred2表達盒和不能單獨產(chǎn)生熒光的neyfp表達盒基因編碼序列，所述pbifc-ecc載體含有不能單獨產(chǎn)生熒光的ceyfp表達盒基因編碼序列。

14、含有上述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統(tǒng)中pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體的重組表達載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞或表達盒。

15、本發(fā)明通過在出發(fā)載體pbifc-enc的基礎(chǔ)上，于 hind ?iii酶切位點自5’至3’方向插入增強型表達框架superpromoter-cor47-5′utr-nls-dsred2-hsp-t878的dna分子，其由superpromoter啟動子序列、cor47-5′utr序列、細胞核定位信號nls序列、紅色熒光蛋白dsred2編碼區(qū)序列和終止子hsp-t878序列依次順序連接組成。經(jīng)pcr擴增獲得nls-dsred2融合表達盒dna分子，通過同源重組酶將其與經(jīng) hind?iii單酶切的出發(fā)載體pbifc-enc連接，在neyfp表達盒的基礎(chǔ)上同向串聯(lián)插入增強的nls-dsred2表達盒從而獲得終載體pbifc-nls-dsred2-enc。在pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體的nc?frame位點分別與兩個目的蛋白融合，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉肉細胞，利用激光共聚焦/熒光顯微鏡觀察熒光信號從而判斷蛋白相互作用情況。所述基于紅色熒光蛋白dsred2的融合表達盒具有如seq?no.?1中第1-2928?nt所示的核苷酸序列，所述neyfp表達盒具有如seq?no.?2中第1-2315?nt所示的核苷酸序列，所述ceyfp表達盒具有如seq?no.?3中第1-1988?nt所示的核苷酸序列。

16、本發(fā)明還提供包含上述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統(tǒng)中pbifc-nls-dsred2-enc和pbifc-ecc重組表達載體的dna分子，以及含有所述dna分子、重組報告基因表達載體的轉(zhuǎn)基因重組菌或細胞。

17、上述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統(tǒng)的應(yīng)用，該系統(tǒng)用于檢測植物蛋白相互作用的情況。

18、上述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統(tǒng)的應(yīng)用，當含有雙分子熒光互補系統(tǒng)中分別融合目的蛋白編碼基因重組表達載體的農(nóng)桿菌共同瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉肉細胞后，通過激光共聚焦/熒光顯微鏡可觀察到不發(fā)熒光的兩個表達盒被拉近而產(chǎn)生綠色yfp熒光，且nls-dsred2表達盒同時產(chǎn)生能特異性指示細胞核定位的紅色dsred2熒光。

19、上述的應(yīng)用，通過激光共聚焦/熒光顯微鏡觀察分別與一組目標蛋白編碼基因融合的pbifc-nls-dsred2-enc和pbifc-ecc重組表達載體的農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉肉細胞后的熒光信號，根據(jù)定位于細胞核中的紅色熒光信號作為核定位marker，并根據(jù)yfp熒光信號的產(chǎn)生及位置判斷植物蛋白質(zhì)的相互作用情況，具體包括：

20、（1）對于在nc?frame中不含有融合外源基因的pbifc-nls-dsred2-enc和pbifc-ecc空載體質(zhì)粒，當使用激光共聚焦/熒光顯微鏡觀察時，若煙草葉肉細胞中分布有特異性定位于細胞核中的dsred2紅色熒光信號，且不存在yfp綠色熒光信號，則dsred2熒光蛋白正常表達；

21、（2）對于在nc?frame中分別融合有存在相互作用的蛋白編碼基因序列的pbifc-nls-dsred2-enc和pbifc-ecc重組載體，當使用激光共聚焦/熒光顯微鏡觀察時，若煙草葉肉細胞中分布有特異性定位于細胞核中的紅色熒光信號和根據(jù)目標蛋白互作特性定位的yfp綠色熒光信號，則兩種熒光蛋白正常表達；紅色熒光信號為核定位marker信號，yfp熒光信號為蛋白產(chǎn)生相互作用的亞細胞定位信號。

22、本發(fā)明的檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統(tǒng)中pbifc-nls-dsred2-enc載體，在出發(fā)載體pbifc-enc的基礎(chǔ)上，通過pcr擴增獲得核苷酸片段superpromoter-cor47-5′utr-nls-dsred2-hsp-t878后，通過同源重組酶將其與經(jīng) hind?iii單酶切的出發(fā)載體pbifc-enc連接，在neyfp表達盒的基礎(chǔ)上同向串聯(lián)插入增強的nls-dsred2表達盒從而獲得終載體pbifc-nls-dsred2-enc。將待檢測相互作用的兩個目的蛋白的基因編碼序列通過同源重組反應(yīng)分別克隆入終載體pbifc-nls-dsred2-enc和pbifc-ecc的nc?frame位點，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后可用于煙草瞬時轉(zhuǎn)化后檢測蛋白相互作用的情況。定位在細胞核的紅色熒dsred2光信號和根據(jù)目的蛋白相互作用情況而產(chǎn)生的綠色yfp熒光信號可通過激光共聚焦/熒光顯微鏡進行觀察。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用更強的superpromoter啟動子、翻譯起始增強子cor47-5′utr和可顯著增加基因表達量的hsp-t878終止子來提高熒光蛋白信號強度，并利用細胞核定位信號nls實現(xiàn)了紅色熒光蛋白在細胞核中的穩(wěn)定和特異表達，對現(xiàn)有熒光蛋白在植物分子生物學(xué)中的應(yīng)用進行了綜合改進。本發(fā)明改進的檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補載體具備通過直接酶切、連接等簡單操作就可將目的dna分子分別連入neyfp和ceyfp表達盒的nc?frame位點，構(gòu)建插入目標基因的重組報告基因載體，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后能通過共同轉(zhuǎn)染等操作瞬時遺傳轉(zhuǎn)化煙草用于植物蛋白相互作用情況檢測。經(jīng)驗證兩個熒光報告基因dsred2和yfp均能穩(wěn)定和清晰表達，說明該載體兩個啟動子均具有轉(zhuǎn)錄活性，且特異定位在細胞核的dsred2紅色熒光信號和根據(jù)蛋白相互作用情況產(chǎn)生的yfp熒光信號可同時表達，且相互獨立、互不干擾；本發(fā)明能夠通過檢測熒光信號位置即可方便、靈敏和高效地反映蛋白的相互作用情況，且與傳統(tǒng)細胞核定位方法相比，利用特異性定位在細胞核的紅色熒光信號作為核定位marker，可避免接觸高毒致癌物質(zhì)，又無需另外使用核定位對照載體，可實現(xiàn)一個載體一個菌雙熒光指示的高效檢測植物蛋白相互作用情況，節(jié)約使用成本并提升操作安全性和便捷性。

24、總之，本發(fā)明在出發(fā)載體pbifc-enc的基礎(chǔ)上同向串聯(lián)插入增強的nls-dsred2表達盒獲得pbifc-nls-dsred2-enc載體，與pbifc-ecc載體共同組成雙分子熒光互補系統(tǒng)用于檢測植物蛋白相互作用情況。將待分析目的蛋白編碼基因序列分別克隆入pbifc-nls-dsred2-enc載體neyfp表達盒與pbifc-ecc載體ceyfp表達盒的nc?frame位點，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后通過瞬時轉(zhuǎn)染煙草葉肉細胞可用于檢測蛋白相互作用情況。在激光共聚焦/熒光顯微鏡下，紅色dsred2熒光信號定位在細胞核中，綠色yfp熒光信號根據(jù)蛋白互作情況產(chǎn)生相應(yīng)熒光，成像效果清晰、穩(wěn)定，且相互獨立。