本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)nmn的重組大腸桿菌及其應(yīng)用，屬于基因工程及生物工程。

背景技術(shù)：

1、nad+是近年來最受關(guān)注的抗衰老小分子之一，而外源攝取β-煙酰胺單核苷酸(β-nicotinamide?mononucleotide，β-nmn，以下簡稱nmn)是補充nad+十分直接且有效的手段。而nmn作為一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的同分異構(gòu)體，其化學(xué)合成的方法是復(fù)雜且艱巨的，所以目前nmn主要通過生物法合成。目前生物法合成nmn主要包括酶法和發(fā)酵法兩個方法。

2、nmn的化學(xué)法合成主要以煙酰胺與四乙酰核糖為起始原料，經(jīng)三氟甲磺酸三甲基硅酯(tmsotf)縮合、脫乙?；?，再經(jīng)三氯氧磷/磷酸三甲酯磷酸化制得β-nmn；或通過將縮酮化保護的煙酰胺核糖磷酸化、脫保護制備β-nmn。化學(xué)合成方法nmn技術(shù)相較而言更加完備，但是存在著諸多缺陷，一方面環(huán)境不友好，多種原料具有毒性；另一方面經(jīng)濟不友好，部分原料價格昂貴，所以nmn的化學(xué)法合成成本居高不下。

3、nmn的酶法合成主要分為兩大類型：一種是nr為核心底物，加入atp后通過煙酰胺核糖激酶的催化形成β-nmn；另一種是以磷酸核糖-1-焦磷酸為核心底物，在引入atp和nam后通過煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的催化形成β-nmn。酶法合成轉(zhuǎn)化率較高，但底物成本仍然較高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

4、nmn的發(fā)酵法生產(chǎn)主要是以nam和葡萄糖或是其他能夠生產(chǎn)prpp的糖類為底物，通過代謝工程菌株直接生產(chǎn)nmn。發(fā)酵法合成轉(zhuǎn)化率高，且成本低廉。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本技術(shù)旨在構(gòu)建更利于nmn積累的重組菌株，在已構(gòu)建的底盤菌株的基礎(chǔ)上，表達合成nmn的酶基因，表達prpp合成相關(guān)的酶基因，并敲除不利于prpp積累的酶基因，優(yōu)化發(fā)酵過程，提高nmn的產(chǎn)量。

2、本發(fā)明提供了一株具有煙酰胺單核苷酸合成能力的基因工程菌，表達了煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(nampt酶)、5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶(prpp合酶)、轉(zhuǎn)運蛋白bmpnuc、葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶(zwf)、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(gnd)、果糖-1,6-二磷酸酶ii(glpx)、玻璃體血紅蛋白酶(vhb)和nadh轉(zhuǎn)氫酶(stha)。

3、在一種實施方式中，所述煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(nampt)的氨基酸序列與序列seq?id?no.1具有至少95％的一致性；所述5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶(prpp合酶)的氨基酸序列與序列seq?id?no.2具有至少95％的一致性；所述轉(zhuǎn)運蛋白bmpnuc的氨基酸序列與序列seq?id?no.3具有至少95％的一致性；所述葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶(zwf)的氨基酸序列與序列seq?id?no.4具有至少95％的一致性；所述6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(gnd)的氨基酸序列與序列seq?id?no.5具有至少95％的一致性；所述果糖-1,6-二磷酸酶ii(glpx)的氨基酸序列與序列seq?id?no.6具有至少95％的一致性；所述玻璃體血紅蛋白酶(vhb)的氨基酸序列與序列seq?id?no.7具有至少95％的一致性；所述nadh轉(zhuǎn)氫酶(stha)的氨基酸序列與序列seq?id?no.8具有至少95％的一致性。

4、在一種實施方式中，所述煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶來源于松樹噬幾丁質(zhì)菌(chitinophaga?pinensis)含有seq?id?no.1所示的氨基酸序列；所述prpp合酶來源于解淀粉芽孢桿菌(bacillus?amyloliquefaciens)，含有如seq?id?no.2所示的氨基酸序列；所述轉(zhuǎn)運蛋白bmpnuc來源于類霉菌芽孢桿菌(bacillus?mycoides)，含有seq?id?no.3所示的氨基酸序列；所述葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶(zwf)來源于大腸桿菌(escherichia?coli)，含有seq?id?no.4所示的氨基酸序列；所述6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(gnd)來源于大腸桿菌(escherichia?coli)，含有seq?id?no.5所示的氨基酸序列；所述果糖-1,6-二磷酸酶ii(glpx)來源于大腸桿菌(escherichia?coli)，含有seq?id?no.6所示的氨基酸序列；所述玻璃體血紅蛋白酶(vhb)來源于透明顫菌(vitreoscilla)，含有seq?id?no.7所示的氨基酸序列；所述nadh轉(zhuǎn)氫酶(stha)來源于大腸桿菌(escherichia?coli)，含有seq?id?no.8所示的氨基酸序列。

5、在一種實施方式中，編碼所述煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的基因nampt具有seq?idno.9所示的核苷酸序列；編碼所述prpp合酶的基因prs具有seq?id?no.10所示的核苷酸序列；編碼所述轉(zhuǎn)運蛋白的基因pnuc具有seq?id?no.11所示的核苷酸序列；編碼所述葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的基因zwf具有seq?id?no.12所示的核苷酸序列；編碼所述6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因gnd具有seq?id?no.13所示的核苷酸序列；編碼所述果糖-1,6-二磷酸酶ii的基因glpx具有seq?id?no.14所示的核苷酸序列；編碼所述玻璃體血紅蛋白酶的基因vhb具有seq?id?no.15所示的核苷酸序列；編碼所述nadh轉(zhuǎn)氫酶的基因stha具有seq?id?no.16所示的核苷酸序列。

6、在一種實施方式中，所述基因工程菌的底盤菌株包括但不限于枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母菌等適合構(gòu)建表達系統(tǒng)的微生物菌株。

7、在一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌包括但不限于b.subtilis?168或b.subtilis?ws9。

8、在一種實施方式中，所述大腸桿菌包括但不限于e.coli?bl21(de3)、e.coli?bl21star(de3)、e.coli?bl21(de3)plyss、e.coli?rosetta(de3)或e.coli?jm109(de3)。

9、在一種實施方式中，構(gòu)建基因工程菌株時使用的過表達載體質(zhì)粒包括但不限于prsfduet-1、petduet-1、pcdfduet-1、pma5、pwb980、pht43、pht01和pet-22b(+)、pet-28a(+)、pet-30a(+)、puc57等適用于構(gòu)建過表達基因工程菌株的其他載體質(zhì)粒。

10、在一種實施方式中，所述轉(zhuǎn)運蛋白bmpnuc以質(zhì)粒pacycduet-1或pcdfduet-1為表達載體。

11、在一種實施方式中，所述煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶nampt和prpp合酶以prsfduet-1或petduet-1為表達載體。

12、在一種實施方式中，所述葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、果糖-1,6-二磷酸酶ii和玻璃體血紅蛋白酶以pet-28a(+)或prsfduet-1為表達載體。

13、在一種實施方式中，所述基因工程菌的底盤菌株為大腸桿菌，所述大腸桿菌敲除了pncc基因、usha基因、nadr基因、purr基因、pnca基因、edd基因、gntr基因、pfka基因和pntab基因；所述pncc基因在ncbi數(shù)據(jù)庫中的gene?id為947169，usha基因的gene?id為947331，nadr基因的gene?id為948911，purr基因的gene?id為945226，pnca基因的gene?id為946276，edd基因的gene?id為946362，gntr基因的gene?id為947946，pfka基因的gene?id為948412，pnta基因的gene?id為946628，pntb基因的gene?id為946144。

14、在一種實施方式中，所述基因工程菌是在大腸桿菌bl21(de3)δpnccδushaδnadrδpurrδpncaδeddδpfkaδpntab的基礎(chǔ)上，以petduet-1為載體表達基因baprs和基因nampt，以pcdfduet-1為載體表達bmpnuc，并以prsfduet-1為載體表達基因zwf、基因glpx、基因gnd和基因vhb。

15、本發(fā)明還提供了含有所述基因工程菌的發(fā)酵劑。

16、本發(fā)明還提供一種促進重組大腸桿菌合成nmn的方法，是在大腸桿菌中過表達如seq?id?no.1所示的煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶nampt，表達如seq?id?no.2所示的prpp合酶baprs，表達如seq?id?no.3所示的轉(zhuǎn)運蛋白bmpnuc，表達如seq?id?no.4所示的葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶eczwf，表達如seq?id?no.5所示的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶ecgnd，表達如seqid?no.6所示的果糖-1,6-二磷酸酶ii?ecglpx，表達如seq?id?no.7所示的玻璃體血紅蛋白酶vhb和表達如seq?id?no.8所示的nadh轉(zhuǎn)氫酶(stha)。

17、在一種實施方式中，所述重組大腸桿菌還敲除了δpncc、δusha、δnadr、δpurr、δpnca、δedd、δpfka和δpntab。

18、在一種實施方式中，所述方法還包括在培養(yǎng)所述重組大腸桿菌時，采用iptg誘導(dǎo)。

19、本發(fā)明還提供一種發(fā)酵生產(chǎn)nmn的方法，以所述重組大腸桿菌為發(fā)酵微生物，在35～40℃，培養(yǎng)至od600＝3～4，再于25～37℃，用終濃度≥0.2mm的iptg誘導(dǎo)nmn的合成。

20、在一種實施方式中，發(fā)酵時間為48～72h。

21、在一種實施方式中，所述誘導(dǎo)采用終濃度0.2mm-1mm的iptg誘導(dǎo)。

22、在一種實施方式中，所述發(fā)酵以1000mg-2000mg/l的煙酰胺為底物。

23、在一種實施方式中，所述方法將所述重組大腸桿菌接種至種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得種子液，再按照1％-5％轉(zhuǎn)接量將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，35～37℃，培養(yǎng)5～7h至od600＝3～4，再加入終濃度0.2mm-1mm?iptg，并添加500mg-3000mg/l的煙酰胺，于30～37℃誘導(dǎo)nmn合成。

24、在一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有：酵母粉、檸檬酸、硫酸銨、磷酸鹽(k2hpo4、kh2po4)、葡萄糖。

25、本發(fā)明還提供所述的重組大腸桿菌，或所述發(fā)酵劑，或所述方法在食品、藥品、化妝品、飼料、紡織品領(lǐng)域制備含nmn的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

26、有益效果：

27、(1)本發(fā)明通過過敲除編碼煙酰胺酶的pnca基因減少了底物nam的降解，提高了對nam的利用率，使構(gòu)建的菌株nmn產(chǎn)量達0.35g/l；

28、(2)本發(fā)明通過優(yōu)化誘導(dǎo)時機，改善菌株蛋白表達，使菌株培養(yǎng)至od為3～4時誘導(dǎo)后的產(chǎn)量提高至2.94g/l，進一步提高了菌株的nmn產(chǎn)量；

29、(3)本發(fā)明通過過表達葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和果糖-1,6-二磷酸酶ii，并敲除edd基因和gntr基因，改造了糖代謝，增強了prpp的供給，使菌株在搖瓶中發(fā)酵48h的nmn產(chǎn)量達到了4.26g/l；

30、(3)本發(fā)明通過過表達玻璃體血紅蛋白酶nadh轉(zhuǎn)氫酶，并敲除了pntab基因，改善了菌株中的能量與還原力的平衡，使菌株在搖瓶中發(fā)酵48h的nmn產(chǎn)量達到了4.9g/l。