本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體地涉及一種抗體偶聯(lián)藥物的制備方法。

背景技術(shù)：

1、抗體藥物偶聯(lián)物(antibody-drug?conjugate，adc)是由抗體、細(xì)胞毒藥物及連接子橋接而成的藥物，它們結(jié)合了小分子藥物的高細(xì)胞毒性和單克隆抗體的高選擇性，具有顯著的抗腫瘤效果。adc藥物通過(guò)抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的高親和力，將細(xì)胞毒性藥物靶向輸送至腫瘤病灶部位，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)殺傷。這種藥物的作用機(jī)制包括抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，細(xì)胞將adc內(nèi)吞，隨后化療藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)釋放，發(fā)揮殺傷腫瘤的作用。adc藥物因其精準(zhǔn)靶向作用和強(qiáng)力殺傷作用，被形象地稱為“生物導(dǎo)彈”，在腫瘤臨床治療中顯示出巨大的潛力。

2、盡管adc藥物市場(chǎng)前景廣闊，但目前adc藥物的開發(fā)和應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。技術(shù)難度高、結(jié)構(gòu)復(fù)雜是adc發(fā)展緩慢的主要原因。目前，市場(chǎng)上的adc藥物種類有限，且存在耐藥性和安全性問(wèn)題。例如，kadcyla和enhertu雖然在her2陽(yáng)性乳腺癌治療上顯示了重要的臨床價(jià)值，但其耐藥性問(wèn)題和廣譜毒性的安全隱患不容忽視。因此，開發(fā)新型的adc藥物，降低毒性和耐藥性，是當(dāng)前亟需克服的問(wèn)題。

3、香菇β-葡聚糖作為一種重要的免疫增強(qiáng)劑，在臨床上已用于多種惡性腫瘤的輔助治療。將香菇β-葡聚糖與曲妥珠單抗偶聯(lián)，形成一種新型抗體偶聯(lián)藥物(antibody-glucanconjugate，agc)，有望降低偶聯(lián)藥物的毒副作用，同時(shí)賦予香菇β-葡聚糖her2靶向功能，成為腫瘤靶向治療的新熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的偶聯(lián)技術(shù)存在偶聯(lián)位點(diǎn)非特異、偶聯(lián)比不穩(wěn)定等問(wèn)題，導(dǎo)致藥物異質(zhì)性，甚至抗體失活。新一代定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)雖然可以克服這些缺點(diǎn)，但大部分需要對(duì)抗體進(jìn)行修飾或改造，過(guò)程復(fù)雜，偶聯(lián)效率低，且可能影響抗體穩(wěn)定性和藥物安全性。因此，開發(fā)一種無(wú)需對(duì)抗體進(jìn)行修飾、能夠?qū)崿F(xiàn)高效、均一偶聯(lián)的新型偶聯(lián)技術(shù)，對(duì)于adc藥物的開發(fā)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種高壓反應(yīng)制備曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)高效、均一的偶聯(lián)，無(wú)需對(duì)抗體進(jìn)行修飾，簡(jiǎn)化生產(chǎn)過(guò)程，降低成本，提高藥物的治療效果和安全性。另外，本發(fā)明還提供所述方法制得的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物。

2、本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種高壓反應(yīng)制備曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物的方法，將曲妥珠單抗與香菇β-葡聚糖加入到磷酸鹽緩沖液中，并加入促進(jìn)劑形成反應(yīng)體系，利用高壓反應(yīng)技術(shù)，控制曲妥珠單抗fc端的-nh2與香菇β-葡聚糖的羰基偶聯(lián)，形成曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物；之后采用層析分離技術(shù)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得高純度的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物。最后，對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行表征，包括結(jié)合位點(diǎn)、dar、純度、熱穩(wěn)定性和批次穩(wěn)定性等，以評(píng)估偶聯(lián)物的質(zhì)量。

4、本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化高壓反應(yīng)的條件，如壓力、溫度、時(shí)間以及溶劑條件(ph、促進(jìn)劑)和反應(yīng)物比例等，實(shí)現(xiàn)對(duì)偶聯(lián)物的藥物-抗體比率(drug-antibody?ratio，dar)、純度等關(guān)鍵質(zhì)量屬性的精確控制。

5、在反應(yīng)體系中，曲妥珠單抗和β-葡聚糖的摩爾比為1：1～5。

6、所述磷酸鹽緩沖液的ph為5～9。

7、所述促進(jìn)劑為金屬離子，所述金屬離子為銅離子、鐵離子、亞鐵離子中的至少一種，且反應(yīng)體系中金屬離子的濃度為0.1-0.5mm。

8、進(jìn)行高壓反應(yīng)時(shí)，控制的壓力范圍為5～22mpa，溫度范圍5～40℃，反應(yīng)時(shí)間為1～24h。

9、所述層析分離技術(shù)為凝膠滲透層析、離子交換層析、疏水層析、混合模式層析中的一種。

10、所述的方法，具體包括以下步驟：稱取摩爾比為1:2的曲妥珠單抗和香菇β-葡聚糖，加入到0.2m?ph7.2的磷酸鹽緩沖液中，并添加0.5mm的鐵離子以促進(jìn)還原胺化反應(yīng)，往高壓反應(yīng)器中通入氮?dú)?，控制壓力?0mpa，溫度37℃，反應(yīng)6h后，微濾分離；接著透過(guò)液繼續(xù)上凝膠滲透層析柱sephacryl?s-200，用去離子水洗脫，以去除未反應(yīng)的香菇β-葡聚糖和曲妥珠單抗，收集偶聯(lián)物并滲透脫鹽得純化后的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物即agc藥物。

11、所述的方法，具體包括以下步驟：稱取摩爾比為1:4的曲妥珠單抗和香菇β-葡聚糖，加入到0.2m?ph6.5的磷酸鹽緩沖液中，并添加0.3mm的鐵離子以促進(jìn)還原胺化反應(yīng)，往高壓反應(yīng)器中通入氮?dú)?，控制壓力?5mpa，溫度30℃，反應(yīng)3h后，微濾分離；透過(guò)液繼續(xù)上凝膠滲透層析柱sephacryl?s-300，去離子水洗脫，以去除未反應(yīng)的香菇β-葡聚糖和曲妥珠單抗，收集偶聯(lián)物并滲透脫鹽得純化的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物即agc藥物。

12、本發(fā)明制得的agc藥物的純度大于95％，藥物-抗體比率為1～2。

13、所述的agc藥物的熱穩(wěn)定性在25～65℃范圍內(nèi)無(wú)顯著變化。

14、不同批次agc藥物的dar、分子量、純度及熱穩(wěn)定性的變異系數(shù)小于5％。

15、一種由所述方法制得的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物。

16、所述的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

17、較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明提供一種新型的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物及其制備方法，本發(fā)明制得的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物具有更好的治療效果和安全性，為her2陽(yáng)性腫瘤的治療提供新的選擇。本發(fā)明制備曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物的方法能夠?qū)崿F(xiàn)高效、均一的偶聯(lián)，無(wú)需對(duì)抗體進(jìn)行修飾，簡(jiǎn)化生產(chǎn)過(guò)程，降低成本，提高藥物的治療效果和安全性。

技術(shù)特征：

1.一種高壓反應(yīng)制備曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物的方法，其特征在于：將曲妥珠單抗與香菇β-葡聚糖加入到磷酸鹽緩沖液中，并加入促進(jìn)劑形成反應(yīng)體系，利用高壓反應(yīng)技術(shù)，控制曲妥珠單抗fc端的-nh2與香菇β-葡聚糖的羰基偶聯(lián)，形成曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物；之后采用層析分離技術(shù)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得高純度的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：反應(yīng)體系中，曲妥珠單抗和β-葡聚糖的摩爾比為1：1～5。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述磷酸鹽緩沖液的ph為5～9。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述促進(jìn)劑為金屬離子，所述金屬離子為銅離子、鐵離子、亞鐵離子中的至少一種，且反應(yīng)體系中金屬離子的濃度為0.1-0.5mm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：進(jìn)行高壓反應(yīng)時(shí)，控制的壓力范圍為5～22mpa，溫度范圍5～40℃，反應(yīng)時(shí)間為1～24h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述層析分離技術(shù)為凝膠滲透層析、離子交換層析、疏水層析、混合模式層析中的一種。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：具體包括以下步驟：稱取摩爾比為1:2的曲妥珠單抗和香菇β-葡聚糖，加入到0.2m?ph7.2的磷酸鹽緩沖液中，并添加0.5mm的鐵離子以促進(jìn)還原胺化反應(yīng)，往高壓反應(yīng)器中通入氮?dú)猓刂茐毫?0mpa，溫度37℃，反應(yīng)6h后，微濾分離；接著透過(guò)液繼續(xù)上凝膠滲透層析柱sephacryl?s-200，用去離子水洗脫，以去除未反應(yīng)的香菇β-葡聚糖和曲妥珠單抗，收集偶聯(lián)物并滲透脫鹽得純化后的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：具體包括以下步驟：稱取摩爾比為1:4的曲妥珠單抗和香菇β-葡聚糖，加入到0.2m?ph6.5的磷酸鹽緩沖液中，并添加0.3mm的鐵離子以促進(jìn)還原胺化反應(yīng)，往高壓反應(yīng)器中通入氮?dú)?，控制壓力?5mpa，溫度30℃，反應(yīng)3h后，微濾分離；透過(guò)液繼續(xù)上凝膠滲透層析柱sephacryl?s-300，去離子水洗脫，以去除未反應(yīng)的香菇β-葡聚糖和曲妥珠單抗，收集偶聯(lián)物并滲透脫鹽得純化的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物。

9.一種由權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)所述方法制得的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物。

10.如權(quán)利要求9所述的曲妥珠單抗-β-葡聚糖偶聯(lián)物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種利用高壓反應(yīng)技術(shù)制備曲妥珠單抗?β?葡聚糖偶聯(lián)物的方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。該方法利用高壓反應(yīng)技術(shù)控制曲妥珠單抗Fc端的?NH<subgt;2</subgt;與香菇β?葡聚糖的羰基的偶聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)精確優(yōu)化高壓反應(yīng)的條件，包括壓力、溫度、時(shí)間、溶劑條件(pH、離子強(qiáng)度、促進(jìn)劑)和反應(yīng)物比例，實(shí)現(xiàn)了藥物?抗體比、純度等關(guān)鍵質(zhì)量屬性的精確控制，并采用層析分離技術(shù)獲得高純度、熱穩(wěn)定性好、批次一致性強(qiáng)的曲妥珠單抗?β?葡聚糖偶聯(lián)物。本發(fā)明能夠提供一種新型的曲妥珠單抗?β?葡聚糖偶聯(lián)物，可為HER2陽(yáng)性腫瘤的治療提供新的選擇。

技術(shù)研發(fā)人員：潘裕添,吳啟賜,林志超,黃家福,薛鈺,潘韜
受保護(hù)的技術(shù)使用者：閩南師范大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23