本發(fā)明涉及一種全細胞生物傳感器及其制備方法和應用，屬于分子生物學領域。

背景技術：

1、銅是一種重要的微量營養(yǎng)元素，高濃度時會產(chǎn)生毒性，缺乏銅會導致神經(jīng)和血液疾病。另一方面，銅也作為殺真菌劑、殺藻劑、殺蟲劑和木材防腐劑廣泛使用。因此，銅的監(jiān)測至關重要。目前監(jiān)測銅使用的如電感耦合等離子體質(zhì)譜(icp-ms)、光學發(fā)射光譜(icp-oes)和火焰原子吸收(faa)等方法雖然靈敏度較高，但是耗時、昂貴并且需要特殊的人員。盡管各種化學和生物傳感器解決部分問題，但是這些方法仍然不能區(qū)分總銅和生物可利用銅。而在評估污染時，優(yōu)先事項是量化生物可利用的銅，它的數(shù)量可能與總銅存在很大的差異。生物可利用的銅只能通過生物體來測量，這推動了基于轉(zhuǎn)錄因子的全細胞銅生物傳感器的發(fā)展。這種活細胞傳感器能吸收并特異性的結(jié)合環(huán)境中銅并且啟動報告元件的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生可檢測的信號。盡管這類全細胞生物傳感器有令人滿意的分析參數(shù)，但是也受到嚴重的限制。因為它們需要最佳的營養(yǎng)和生長條件(ph，溫度)，才能產(chǎn)生適當?shù)男盘柡椭噩F(xiàn)性。而且信號產(chǎn)生依賴于細菌的生長繁殖以及報告元件的成熟，檢測時間往往長達數(shù)小時。

2、藻藍蛋白和銅之間能發(fā)生相互作用，并且使得藻藍蛋白的熒光淬滅，這種淬滅效應是劑量依賴性的，由此已經(jīng)開發(fā)出從生物體中提取的藻藍蛋白α亞基用于對銅的檢測。然而，由于認識到上述的這類基于蛋白質(zhì)而非細胞的生物傳感器的局限性，開發(fā)基于細胞系統(tǒng)的生物傳感器有更大的優(yōu)勢。并且，不同藍藻的藻藍蛋白、藻藍蛋白的不同亞基之間基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)存在很大差異，這種結(jié)構(gòu)上的差異必然會導致對銅的響應性能的差異。

3、現(xiàn)有技術中，基于轉(zhuǎn)錄因子的銅全細胞生物傳感器是利用銅對一種嗜熱藻藻藍蛋白β亞基的熒光淬滅效應實現(xiàn)的，可以稱為光滅型；而先前的技術是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控熒光增強效應實現(xiàn)的，可以稱為光開型。也有技術是利用銅可以引起某些熒光蛋白的熒光淬滅效應，從而實現(xiàn)對銅的檢測。這項技術本質(zhì)上是基于蛋白質(zhì)的而非細胞系統(tǒng)，蛋白質(zhì)的提取是需要復雜的程序和成本的。而且，藻藍蛋白β亞基和藻藍蛋白α亞基、甚至不同藍藻的藻藍蛋白β亞基在編碼基因序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上有較大差異，導致它們對銅的響應存在顯著差異。

4、因此，獲得對銅具有更好傳感性能的特殊分子序列也具有重要的意義。

技術實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術問題是提供了一種全細胞生物傳感器及其制備方法和應用。

2、技術方案：為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種全細胞生物傳感器，其包括genbank登錄號：ba000039的thcpcb、genbank登錄號：ay804216的spcpcb、genbank登錄號：nc_003272的nocpcb或genbank登錄號：wp_009454964的thcpcb基因。

3、其中，包括核苷酸序列如seq?id?no.1～4任一條所示的序列。

4、本發(fā)明還提供一種制備所述全細胞生物傳感器的方法，包括以下步驟：

5、(1)將所述thcpcb、spcpcb、nocpcb或thcpcb基因分別插入表達載體petduet的第一個多克隆位點；且將融合酶編碼基因cpcs::ho1::pcya亞克隆到表達載體petduet的第二個多克隆位點，最終構(gòu)建系列質(zhì)粒petduet-cpcb-cpcs::ho1::pcya；

6、(2)將步驟(1)中所述系列質(zhì)粒petduet-cpcb-cpcs::ho1::pcya分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，并用iptg誘導表達，得到所述全細胞生物傳感器。

7、本發(fā)明還提供一種檢測水中銅離子濃度的試劑盒，其含有所述全細胞生物傳感器。

8、本發(fā)明還提供所述全細胞生物傳感器在制備檢測水中銅離子濃度的試劑盒中的應用。

9、本發(fā)明還提供所述全細胞生物傳感器在檢測水中銅離子濃度中的應用。

10、其中，檢測全細胞生物傳感器在644nm處的熒光發(fā)射光譜。

11、其中，所述全細胞生物傳感器的od600值為0.2～1。

12、進一步優(yōu)選地，所述全細胞生物傳感器的od600值為0.2～0.6。

13、進一步優(yōu)選地，所述全細胞生物傳感器的od600值為0.2～0.4。

14、其中，所述全細胞生物傳感器與銅離子的響應時間為15～150min。

15、全細胞生物傳感器可在15min內(nèi)熒光淬滅率已經(jīng)達到30％左右，可以縮短時間作為檢測的時間點。

16、其中，檢測溫度為10～55℃。

17、進一步優(yōu)選地，檢測溫度為25～55℃。

18、進一步優(yōu)選地，檢測溫度為37～55℃。

19、進一步優(yōu)選地，檢測溫度為25～42℃。

20、溫度為42攝氏度時熒光淬滅率最高，達到60％左右。

21、其中，所述全細胞生物傳感器的熒光淬滅率與銅離子的濃度的線性關系：y＝0.0217x-0.0525，r＝0.9999，其中，y為全細胞生物傳感器的熒光淬滅率，x為銅離子的濃度。

22、作用原理：含有銅離子的樣品(水樣或土壤樣品)和本技術制備的全細胞生物傳感器孵育之后，在最優(yōu)的溫度和細胞密度中，生物可利用的銅離子透過細胞膜的離子通道進入細胞內(nèi)，細胞內(nèi)的藻藍蛋白cpcb和藻膽色素pcb連接后特異性的結(jié)合cu2+，使得pcb和cpcb的相互作用發(fā)生變化，觸發(fā)cpcb熒光的淬滅。樣品中生物可利用銅濃度越高，進入細胞的銅離子濃度越高，cpcb相應位點結(jié)合的銅離子越多，細胞熒光淬滅越大，直到cpcb的銅離子結(jié)合位點被完全飽和。因此，可以建立銅離子濃度和細胞熒光淬滅率之間的線性關系。依據(jù)樣品淬滅熒光的程度和線性方程計算銅離子濃度。

23、有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點：1、相對基于轉(zhuǎn)錄因子的銅全細胞生物傳感器，本發(fā)明中的銅全細胞生物傳感器不依賴細菌的生長繁殖，銅離子進入細胞直接快速與藻藍蛋白結(jié)合使得藻藍蛋白熒光淬滅，因此，僅在15min內(nèi)完成檢測；3、相對于基于蛋白質(zhì)的生物傳感器，本發(fā)明不需要通過復雜的程序從生物體中提取蛋白質(zhì)，細胞直接和銅離子反應，傳感器細胞的制備十分簡單，成本低廉，再現(xiàn)性好；4、本發(fā)明最終所制備的生物傳感器細胞靈敏度高(檢測限低)、特異性強，具備優(yōu)異的銅離子檢測性能；5、本發(fā)明技術效果明顯，由于成本低廉，將帶來巨大的社會效應。

技術特征：

1.一種全細胞生物傳感器，其特征在于，其含有genbank登錄號：ba000039的thcpcb、genbank登錄號：ay804216的spcpcb、genbank登錄號：nc_003272的nocpcb或genbank登錄號：wp_009454964的thcpcb基因。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述全細胞生物傳感器，其特征在于，其含有cpcb-cpcs::ho1::pcya，所述cpcb-cpcs::ho1::pcya的核苷酸序列如seq?id?no.1～4任一條所示。

3.一種制備權(quán)利要求1或2所述全細胞生物傳感器的方法，其特征在于，包括以下步驟：

4.一種檢測水中銅離子濃度的試劑盒，其特征在于，其含有權(quán)利要求1或2所述全細胞生物傳感器。

5.權(quán)利要求1或2所述全細胞生物傳感器在制備檢測水中銅離子濃度的試劑盒中的應用。

6.權(quán)利要求1或2所述全細胞生物傳感器在檢測水中銅離子濃度中的應用。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述應用，其特征在于，檢測全細胞生物傳感器在644nm處的熒光發(fā)射光譜。

8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述應用，其特征在于，所述全細胞生物傳感器的od600值為0.2～1。

9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述應用，其特征在于，檢測溫度為10～55℃。

10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述應用，其特征在于，所述全細胞生物傳感器的熒光淬滅率與銅離子的濃度的線性關系：y＝0.0217x-0.0525，r＝0.9999，其中，y為全細胞生物傳感器的熒光淬滅率，x為銅離子的濃度。

技術總結(jié)
本發(fā)明公開了一種全細胞生物傳感器及其制備方法和應用，全細胞生物傳感器含有GenBanK登錄號：BA000039的ThcpcB、GenBanK登錄號：AY804216的SpcpcB、GenBanK登錄號：NC_003272的NocpcB或GenBanK登錄號：WP_009454964的ThcpcB基因。本發(fā)明不需要通過復雜的程序從生物體中提取蛋白質(zhì)，細胞直接和銅離子反應，傳感器細胞的制備十分簡單，成本低廉；時間短，僅在15min內(nèi)完成檢測；本發(fā)明最終所制備的生物傳感器細胞靈敏度高(檢測限低)、特異性強，具備優(yōu)異的銅離子檢測性能；技術效果明顯，由于成本低廉，將帶來巨大的社會效應。

技術研發(fā)人員：伍賢軍,董登偉,游卓瑛,韓陽,陸鑫龍
受保護的技術使用者：南京林業(yè)大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/23