本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)，具體為一種人擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞誘導(dǎo)人滋養(yǎng)干細(xì)胞的制備方法。

背景技術(shù)：

1、滋養(yǎng)干細(xì)胞(trophoblast?stem?cells，tscs)具有自我更新及分化能力，可以分化形成特定功能的滋養(yǎng)細(xì)胞，如絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(extra?villous?trophoblast，evt)和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞(syncytiotrophoblast，stb)。該細(xì)胞具有很好的增殖和分化能力，可以在體外模擬滋養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)育過程，也可以應(yīng)用于基因編輯和藥物研究，為胎盤發(fā)育和妊娠疾病的研究提供良好的模型。2018年，日本科學(xué)家成功地從囊胚期滋養(yǎng)外胚層和妊娠初期胎盤絨毛中分離獲得了人滋養(yǎng)干細(xì)胞。隨后，科學(xué)家們先后基于原始態(tài)人多能干細(xì)胞和激發(fā)態(tài)人多能干細(xì)胞建立了誘導(dǎo)型人滋養(yǎng)干細(xì)胞的制備方法。

2、但是，現(xiàn)有的人滋養(yǎng)干細(xì)胞體系仍然存在一些問題，原代分離的滋養(yǎng)干細(xì)胞需要通過囊胚或早孕絨毛獲取，材料不易獲得而且操作復(fù)雜，成功率低；基于原始態(tài)人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)人滋養(yǎng)干細(xì)胞需要引入飼養(yǎng)層細(xì)胞，對后續(xù)的應(yīng)用和研究帶來干擾，而基于激發(fā)態(tài)人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的人滋養(yǎng)干細(xì)胞存在一定的增殖問題，很難在體外長期穩(wěn)定的傳代。

3、為此，現(xiàn)提出一種人擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞誘導(dǎo)人滋養(yǎng)干細(xì)胞的制備方法來解決上述提出的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種人擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞誘導(dǎo)人滋養(yǎng)干細(xì)胞的制備方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種人擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞誘導(dǎo)人滋養(yǎng)干細(xì)胞的制備方法，該制備方法的具體步驟流程如下：

3、步驟一、基于無飼養(yǎng)層體系，將h9人胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)換成人擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞：

4、(1)matrigel包被培養(yǎng)皿，在35皿中加入1ml?matrigel工作液，放置于37℃培養(yǎng)箱中過夜，使基質(zhì)充分包被皿底備用；

5、(2)次日將人胚胎干細(xì)胞h9按每孔1x104個細(xì)胞的密度接種于matrigel包被的35皿中，培養(yǎng)基為mtesr1基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10μm的y-27632，于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后，更換成無飼養(yǎng)層人擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，每天更換一次培養(yǎng)基；

6、(3)觀察細(xì)胞形態(tài)和匯合度，匯合度達(dá)到80％左右即可考慮傳代，傳代前準(zhǔn)備好matrigel包被的培養(yǎng)皿，吸掉舊培養(yǎng)基，用無ca?2+和mg?2+的dpbs漂洗一次，每個35皿加入1ml胚胎干細(xì)胞消化液reselrtm，并在一分鐘內(nèi)吸掉，保留薄薄的一層解離試劑，37℃孵育5分鐘后加入培養(yǎng)基中止消化，并按1:5的比例傳代；

7、(4)培養(yǎng)傳代5次以上即可獲得形態(tài)穩(wěn)定的無飼養(yǎng)層擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞；

8、步驟二、基于人滋養(yǎng)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，將無飼養(yǎng)層人擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞分化為誘導(dǎo)型人滋養(yǎng)干細(xì)胞：

9、(1)iv型膠原蛋白包被培養(yǎng)皿，在35皿中加入1ml?collagen?type?4工作液，放置于37℃培養(yǎng)箱中過夜，使基質(zhì)充分包被皿底備用；

10、(2)將形態(tài)穩(wěn)定的人擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞培養(yǎng)到80％左右匯合度，用無ca?2+和mg2+的dpbs漂洗一次，每個35皿加入1ml胚胎干細(xì)胞消化液reselrtm(stemcell)，并在一分鐘內(nèi)吸掉，保留薄薄的一層解離試劑，37℃孵育5分鐘后加入培養(yǎng)基中止消化，并按1:10的比例接種到iv型膠原蛋白包被培養(yǎng)皿中，初始培養(yǎng)基為無飼養(yǎng)層人擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞培養(yǎng)基，12h后更換為人滋養(yǎng)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每天更換一次培養(yǎng)基；

11、(3)觀察細(xì)胞的形態(tài)和匯合度，匯合度為80％左右即可傳代，傳代前準(zhǔn)備好iv型膠原蛋白包被培養(yǎng)皿，首先吸掉舊培養(yǎng)基，用無ca2+和mg2+的dpbs漂洗一次，每個35皿加入1ml滋養(yǎng)干細(xì)胞消化液tryple(thermo?fisher)，37℃孵育10分鐘后加入培養(yǎng)基中止消化，并按1:4的比例傳代；

12、(4)大約培養(yǎng)5-6天即可觀察到滋養(yǎng)干細(xì)胞樣克隆，持續(xù)誘導(dǎo)14天左右即可獲得性能穩(wěn)定的誘導(dǎo)型人滋養(yǎng)干細(xì)胞；

13、(5)誘導(dǎo)型人滋養(yǎng)干細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存以及復(fù)蘇，誘導(dǎo)獲得的人滋養(yǎng)干細(xì)胞需要在iv型膠原蛋白包被培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)基即為人滋養(yǎng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，解凍或者傳代后，12h換液一次，之后每兩天換液一次，大概培養(yǎng)4-5天即可傳代或凍存，當(dāng)細(xì)胞或者度達(dá)到80％左右時，吸掉舊培養(yǎng)基，用不含ca2+和mg2+的dpbs漂洗一次，再用tryple37℃孵育10分鐘后加入培養(yǎng)基中止消化，離心去上清后可按1:4進(jìn)行傳代培養(yǎng)，或者吸去上清液加入1ml細(xì)胞凍存液吹打混勻后裝入細(xì)胞凍存管，放入程序凍存盒中在-80℃冰箱過夜降溫，可短期保存于-80℃冰箱也可以長期保存于液氮中，誘導(dǎo)型人滋養(yǎng)干細(xì)胞復(fù)蘇，提前準(zhǔn)備好iv型膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿，將誘導(dǎo)型人滋養(yǎng)干細(xì)胞于37℃水浴鍋中快速振蕩化凍，直到管中只剩少許冰晶，在生物安全柜中，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，緩慢滴加5倍體積的滋養(yǎng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，輕柔混勻，1000rpm離心5min吸棄上清液，重新加入滋養(yǎng)干細(xì)胞培養(yǎng)基混勻鋪板；

14、步驟三、誘導(dǎo)型人滋養(yǎng)干細(xì)胞鑒定以及誘導(dǎo)分化。

15、優(yōu)選的，所述無飼養(yǎng)層體系中，無飼養(yǎng)層擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞培養(yǎng)基配置方法的具體步驟流程如下：(1)按照mtesr1(stemcell)說明書，將mtesr1添加液(supplemental)置于4℃冰箱過夜解凍，次日在生物安全柜中將解凍的mtesr1添加液(100ml)加入mtesr1基礎(chǔ)液(basal)中充分混勻，得到mtesr1基礎(chǔ)培養(yǎng)基，50ml/每管分裝于-20℃保存；(2)使用前將50ml?mtesr1基礎(chǔ)培養(yǎng)基于4℃冰箱過夜解凍，在生物安全柜中依次加入10ng/ml白血病抑制因子hlif(peprotech)，1μm?gsk-3抑制劑chir99021(tocris)，2μm(s)-(+)-馬來酸二甲茚(s)-dimethindene?maleate(tocris)，2μm鹽酸米諾環(huán)素minocycline?hydrochloride(tocris)，1μm?wnt抑制劑iwr-1-endo(sellect)，2μm?rock抑制劑y27632(sellect)，充分混勻后避光4℃保存，有效期2周。

16、優(yōu)選的，所述人滋養(yǎng)干細(xì)胞培養(yǎng)體系中，人滋養(yǎng)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基配置方法的具體步驟流程如下：在生物安全柜中，取基礎(chǔ)培養(yǎng)液dmem/f12(gibco)，依次加入0.1mmβ-巰基乙醇2-mercaptoethanol(gibco),0.2％胎牛血清fbs(gibco),0.5％青鏈霉素混合液penicillin/streptomycin(碧云天),0.3％牛血清白蛋白bsa(sigma)，1％胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-乙醇胺its-x(gibco)，1.5μg/ml?l-抗壞血酸l-ascorbic?acid(sigma)，50ng/ml表皮細(xì)胞生長因子egf(peprotech)，2μm?gsk-3抑制劑chir99021，0.5μm?tgf-βⅰ型受體抑制劑a83-01(mce)，1μm?src家族激酶抑制劑sb431542(mce),0.8mm丙戊酸vpa(mce)，以及5μmrock抑制劑y-27632，充分混勻后避光4℃保存，有效期2周。

17、優(yōu)選的，所述matrigel工作液配置的具體步驟如下：將5ml?matrigel(corning)置于4℃過夜解凍，次日在生物安全柜中，將解凍的matrigel充分混勻分裝至0.2ml?ep管中(25μl/管)作為儲存液，使用時，每2ml?dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入25μl?matrigel儲液混勻即為工作液。

18、優(yōu)選的，所述iv型膠原蛋白工作液配置的具體步驟如下：將5mg?collagen?type?4(sigma)至于5ml?dpbs?4℃過夜溶解，次日在生物安全柜中將完全溶解的collagen?type?4分裝至0.2ml?ep管中(30μl/管)作為儲存液，使用時，每6ml?dpbs中加入30μl?collagentype?4即為工作液。

19、優(yōu)選的，所述stb分化培養(yǎng)基配置的具體步驟如下：在dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，依次加入0.1mmβ-巰基乙醇2-mercaptoethanol,4％血清替代物ksr(gibco)，0.5％青鏈霉素混合液penicillin/streptomycin，0.3％牛血清白蛋白bsa，1％胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-乙醇胺its-x，2.5μm?rock抑制劑y-27632，2μm?forskolin(mce)，充分混勻后避光4℃保存，有效期2周。

20、優(yōu)選的，所述evt分化培養(yǎng)基配置的具體步驟如下：在evt1#:dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，依次加入0.1mmβ-巰基乙醇2-mercaptoethanol,4％血清替代物ksr，0.5％青鏈霉素混合液penicillin/streptomycin，0.3％牛血清白蛋白bsa，1％胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-乙醇胺its-x，2.5μm?rock抑制劑y-27632，7.5μm?a83-01，100ng/mlnrg1(peprotech)；

21、在evt2#:dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，依次加入0.1mmβ-巰基乙醇2-mercaptoethanol，4％血清替代物ksr，0.5％青鏈霉素混合液penicillin/streptomycin，0.3％牛血清白蛋白bsa，1％胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-乙醇胺its-x，2.5μm?rock抑制劑y-27632，7.5μm?a83-01，充分混勻后避光4℃保存，有效期2周；

22、在evt3#:dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，依次加入0.1mmβ-巰基乙醇2-mercaptoethanol，0.5％青鏈霉素混合液penicillin/streptomycin，0.3％牛血清白蛋白bsa，1％胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-乙醇胺its-x，2.5μm?rock抑制劑y-27632，7.5μm?a83-01，充分混勻后避光4℃保存，有效期2周。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

24、本技術(shù)通過基于無飼養(yǎng)層體系，將h9人胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)換成人擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞；基于人滋養(yǎng)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，將無飼養(yǎng)層人擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞分化為誘導(dǎo)型人滋養(yǎng)干細(xì)胞，最后誘導(dǎo)型人滋養(yǎng)干細(xì)胞鑒定以及誘導(dǎo)分化，排除了飼養(yǎng)層細(xì)胞對誘導(dǎo)型滋養(yǎng)干細(xì)胞的干擾，保證了無飼養(yǎng)層體系下誘導(dǎo)型滋養(yǎng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。