本發(fā)明屬于活性肽領(lǐng)域，涉及天然生物活性成分的提取或制備技術(shù)，具體涉及一種來源于鹿茸尖的抗氧化肽、生物活性肽及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、活性氧(ros)是一系列具有高化學(xué)反應(yīng)活性的含氧分子的總稱，是生物體進(jìn)行有氧呼吸的天然副產(chǎn)物，主要包括超氧陰離子(o2-)、過氧化氫(h2o2)、羥自由基(oh-)、臭氧(o3)和單線態(tài)氧(1o2)等。在正常情況下，機(jī)體中ros的含量始終處于較低水平，并在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。然而，在過量的外源性(輻射、缺氧、高溫、紫外)刺激下，ros的含量會(huì)急劇升高，過量的ros便會(huì)打破氧平衡，導(dǎo)致“氧化應(yīng)激”的產(chǎn)生。目前，已有大量證據(jù)表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥等慢性非傳染病發(fā)生和加劇的重要因素。

2、抗氧化劑具有中和自由基、抑制氧化擴(kuò)散的特點(diǎn)，可起到清除過量ros的作用，適量補(bǔ)充抗氧化劑，可減輕氧化應(yīng)激對(duì)生物體所帶來的不良反應(yīng)。以丁基化羥基甲苯(bht)、丁基化羥基苯甲醚(bha)和叔丁基對(duì)苯二酚(tbhq)為代表的合成抗氧化劑在具有抗氧化功能的同時(shí)，存在腎功能損傷、肝毒性、致畸形、致癌等毒副作用。相比之下，從生物體中提取的天然抗氧化劑，具有來源廣泛以及無毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，受到科研人員的廣泛關(guān)注。其中，抗氧化肽作為天然抗氧化劑的一種，主要來源于各類蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物，具有極高的安全性，被廣泛應(yīng)用于功能性食品、醫(yī)療、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域。

3、梅花鹿，偶蹄目鹿科鹿屬哺乳動(dòng)物，主要分布于中國東北部、日本和俄羅斯的太平洋沿岸地區(qū)。梅花鹿的幼角，即鹿茸，作為一種名貴的藥材，擁有2000多年的藥用歷史。鹿茸中含有磷脂、激素、脂肪酸、氨基酸、蛋白質(zhì)等多種化學(xué)成分，其中氨基酸成分占總成分的一半以上是天然的生物活性肽庫，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗衰老、抗氧化等功能。

4、目前，鹿茸活性多肽的制備方法有co2超臨界提取法、超聲波提取法、萃取法、高壓脈沖電場法、人工合成法、酶解法等，其中酶解法大多數(shù)采用水或醇提取鹿茸蛋白進(jìn)行酶解，水與醇對(duì)鹿茸中不同的活性成分有不同的提取效果，因此水提會(huì)損失部分醇溶性物質(zhì)，而醇提會(huì)損失部分水溶性物質(zhì)，導(dǎo)致鹿茸活性成分丟失較多，鹿茸活性多肽/蛋白提取率較低，且產(chǎn)物中小分子多肽和其他鹿茸活性小分子在產(chǎn)物中的占比很少，影響產(chǎn)物發(fā)揮其生理活性。因此，有必要對(duì)現(xiàn)有鹿茸多肽制備方法進(jìn)行改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中通過酶解法從鹿茸中提取生物活性肽存在的提取率低和產(chǎn)物發(fā)揮其生理活性小等技術(shù)問題，本發(fā)明第一方面公開了一種鹿茸尖生物活性肽的制備方法，所述方法包括：

2、對(duì)從鹿茸上分割的鹿茸尖進(jìn)行干燥、粉碎和脫脂處理得到鹿茸尖粉末，將鹿茸尖粉末配置成蛋白漿；

3、用木瓜蛋白酶在優(yōu)化后的水解條件對(duì)蛋白漿水解得到水解產(chǎn)物，離心后收集上清液得到鹿茸尖提取物；

4、使用超濾管對(duì)鹿茸尖提取物分餾，收集分子量＜3kda的餾分得到鹿茸尖生物活性肽。

5、本發(fā)明第二方面公開了一種鹿茸尖抗氧化肽的制備方法，所述方法是采用第一方面中的鹿茸尖生物活性肽作為原料，采用g-25凝膠柱對(duì)所述鹿茸尖生物活性肽進(jìn)行分離，在214nm處實(shí)時(shí)采集色譜圖，依據(jù)色譜圖收集具有紫外吸收峰值的子餾分atp-2和/或子餾分atp-1作為鹿茸尖抗氧化肽。

6、本發(fā)明第三方面提供了一種來源于鹿茸尖的生物活性肽，包括第一無抗氧化性生物活性肽和抗氧化肽，所述第一無抗氧化性生物活性肽包括氨基酸序列如seq?id?no.4～12中所示的肽序列中的至少一種，所述第一無抗氧化性生物活性肽中肽序列的peptideranker得分＞0.95的肽序列。

7、該生物活性肽中第一無抗氧化性生物活性肽和抗氧化肽可以是對(duì)第一方面中得到鹿茸尖生物活性肽或者對(duì)第二方面中得到的鹿茸尖抗氧化肽進(jìn)行紫外全波長掃描、質(zhì)譜分析、生物活性評(píng)估，依據(jù)peptideranker得分和生物活性預(yù)測結(jié)果進(jìn)行篩選獲得的。

8、本發(fā)明第四方面提供了一種來源于鹿茸尖的抗氧化肽，包括氨基酸序列如seq?idno.1～3中所示的肽序列中的至少一種，所述抗氧化肽中肽序列的分子量在1kd左右。該抗氧化肽可以是對(duì)第二方面中得到子餾分atp-2進(jìn)行紫外全波長掃描、質(zhì)譜分析、生物活性評(píng)估，依據(jù)peptideranker得分和生物活性預(yù)測結(jié)果篩選獲得的。

9、本發(fā)明第五方面提供了一種抗氧化肽的應(yīng)用，采用上述第二方面公開的方法制備的鹿茸尖抗氧化肽和第四方面的抗氧化肽制備低細(xì)胞毒性的抗氧化劑，該抗氧化劑用于清除dpph自由基和/或清除ros，可以在功能性食品、醫(yī)療和化妝品等領(lǐng)域中應(yīng)用。

10、本發(fā)明第六方面提供了一種生物活性肽的應(yīng)用，采用上述第一方面公開的方法制備的鹿茸尖生物活性肽和第三方面的生物活性肽制備功能性食品、化妝品、或制備抗菌/降血壓/抗血栓等藥物。

11、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本說明書實(shí)施例采用的上述至少一個(gè)技術(shù)方案能夠達(dá)到的有益效果至少包括：本發(fā)明建立了一種從鹿茸尖端獲得生物活性肽或抗氧化肽的方法，通過超濾、凝膠柱分離、質(zhì)譜分析、生物活性評(píng)估等方式從atp-2中確定了最佳的抗氧化活性的三種肽序列，且通過分子對(duì)接驗(yàn)證了三條抗氧化肽對(duì)mmp-1具有較好的結(jié)合能力，為抗氧化產(chǎn)品的制備和應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

技術(shù)特征：

1.一種來源于鹿茸尖的抗氧化肽，其特征在于，所述抗氧化肽包括氨基酸序列如seqid?no.1～3中所示的肽序列中的至少一種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗氧化肽，其特征在于，所述抗氧化肽中肽序列的peptideranker得分＞0.95。

3.一種來源于鹿茸尖的生物活性肽，其特征在于，所述生物活性肽包括第一無抗氧化性生物活性肽和如權(quán)利要求1或2所示的抗氧化肽，所述第一無抗氧化性生物活性肽包括氨基酸序列如seq?id?no.4～12中所示的肽序列中的至少一種，所述第一無抗氧化性生物活性肽中肽序列的peptideranker得分＞0.95。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物活性肽，其特征在于，所述生物活性肽還包括第二無抗氧化性生物活性肽，所述第二無抗氧化性生物活性肽中肽序列的peptideranker得分為0.5～0.95。

5.一種鹿茸尖生物活性肽的制備方法，其特征在于，包括：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鹿茸尖生物活性肽的制備方法，其特征在于，對(duì)從鹿茸上分割的鹿茸尖進(jìn)行干燥、粉碎和脫脂處理得到鹿茸尖粉末，包括：

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鹿茸尖生物活性肽的制備方法，其特征在于，優(yōu)化后的水解條件包括酶濃度為3500～5500u/g，水解時(shí)間為3.75～5.25h，水解溫度為37-55℃，ph值為6-9，底物濃度為10.15-20.25％。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鹿茸尖生物活性肽的制備方法，其特征在于，優(yōu)化后的水解條件包括水解溫度52.0±0.5℃，ph值7.10±0.2，底物濃度14.4±0.5％。

9.一種鹿茸尖抗氧化肽的制備方法，其特征在于，包括：

10.一種抗氧化肽的應(yīng)用，其特征在于，采用如權(quán)利要求1或2所述的抗氧化肽，或如權(quán)利要求9所述的鹿茸尖抗氧化肽的制備方法制備的鹿茸尖抗氧化肽制備低細(xì)胞毒性的抗氧化劑，所述抗氧化劑用于清除dpph自由基和/或清除ros，在功能性食品、醫(yī)療和化妝品領(lǐng)域中應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種來源于鹿茸尖的抗氧化肽、生物活性肽及制備方法和應(yīng)用，抗氧化肽包括氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1～3中所示的肽序列中的至少一種。生物活性肽包括第一無抗氧化性生物活性肽和抗氧化肽，第一無抗氧化性生物活性肽包括氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4～12中所示的肽序列中的至少一種，所述第一無抗氧化性生物活性肽中肽序列的PeptideRanker得分＞0.95。所述制備方法包括脫脂、木瓜蛋白酶水解、超濾分餾、凝膠柱分離等步驟，通過本發(fā)明方法得到的鹿茸尖抗氧化肽具有較高的DPPH自由基清除率，對(duì)UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞具有很好的保護(hù)作用。

技術(shù)研發(fā)人員：肖興玉,郝林琳,劉東躍,陳熙,劉柳,李雪,愛新覺羅啟英,吳憲
受保護(hù)的技術(shù)使用者：吉林省國大生物工程有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/4