本發(fā)明在其一些實(shí)施方案中涉及產(chǎn)生合成胚胎的方法。利用體外建立的胚胎干細(xì)胞系和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系(ipsc)同時(shí)避免使用卵母細(xì)胞和受精卵或囊胚進(jìn)行的先進(jìn)的人工胚胎形成一直是發(fā)育生物學(xué)和生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的理想目標(biāo)。建立用于在子宮外產(chǎn)生此類合成胚胎(縮寫為sembryo或sembryoids；也可稱為干細(xì)胞衍生的胚胎或胚狀體模型(sem)或干細(xì)胞衍生的全胚狀體模型(swem))的方法和系統(tǒng)可成為基礎(chǔ)研究的有力工具，例如作為研究細(xì)胞多樣性的出現(xiàn)、細(xì)胞命運(yùn)決定以及組織和器官如何從單個(gè)多能細(xì)胞中出現(xiàn)的框架；以及作為用于移植的細(xì)胞、組織、胚胎和器官的來源，測(cè)試藥物對(duì)胚胎發(fā)育的影響，并可能進(jìn)行胚胎的生物工程。囊胚(早期哺乳動(dòng)物胚胎)形成所有胚胎和胚外組織，包括胎盤。這種結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在64細(xì)胞階段，即胚胎失去“細(xì)胞球”形狀并形成腔體后不久。在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(icm)將發(fā)育成真正的胚胎，并位于囊胚腔上方，囊胚腔是囊胚階段的標(biāo)志。包裹在icm周圍的細(xì)胞是滋養(yǎng)外胚層(te)細(xì)胞，它們以后會(huì)形成滋養(yǎng)層胚外胎盤組織(胎兒胎盤)。部分icm進(jìn)一步分化為原始內(nèi)胚層(pre)，隨后產(chǎn)生胚外卵黃囊和膜，為植入做準(zhǔn)備[zhang?et?al.(2020)front.bioeng.biotechnol.8:781]。不同多能狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞系(esc)和ipsc可以在體外擴(kuò)增，并且當(dāng)被注射到宿主胚胎中時(shí)可有助于形成胚胎和/或胚胎外組織。例如，在顯微注射到小鼠囊胚中后，小鼠原始態(tài)esc或ipsc(bayerl?et?al.cell?stem?cell(2021)28(9):1549-1565.e12；weinberger?et?al.nat?rev?mol?cell?biol(2016)17(3):155-69；manor?et?al.curropin?genet?dev(2015)34:35-45；shakiba?et?al.nat?commun(2015)16?6:7329；gafni?etal.nature(2013)504(7479):282-6；geula?et?al.science(2015)347(6225):1002-6)可以像常駐多能細(xì)胞一樣發(fā)揮作用，并同樣有助于形成胚胎(nicols和smith?cell?stem?cell(2009)4(6):487-92)。相反，在n2b27?fgf2/activin條件下擴(kuò)增的小鼠始發(fā)態(tài)多能干細(xì)胞(也稱為上胚層干細(xì)胞(episc))在產(chǎn)生嵌合胚胎方面效率極低，并且在注射到宿主囊胚或e7.5胚胎中時(shí)不能對(duì)此類胚胎做出顯著貢獻(xiàn)(alejandro-castrejon?et?al.nature(2021)593(7857):119-124)。小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞(tsc)可來源于早期小鼠胚胎(e5.5-e7.5植入后小鼠胚胎)或直接來自體外小鼠esc(通過一個(gè)需要幾代生長(zhǎng)和選擇的過程才能建立穩(wěn)定的小鼠tsc系，并且通常伴隨著轉(zhuǎn)基因如cdx2的過表達(dá))。將傳統(tǒng)的穩(wěn)定小鼠tsc系顯微注射到囊胚中后，它們可以輕微促進(jìn)晚期胚胎胎盤發(fā)育，但從未證明它們能夠重建整個(gè)胎盤和滋養(yǎng)外胚層子代(posfai?et?al.nat?cell?biol(2021)23(1):49-60)。通過四倍體胚胎互補(bǔ)顯微注射法注射小鼠原始態(tài)esc或ipsc可以產(chǎn)生獨(dú)特的“全esc/ipsc”嵌合體，其中所有胚胎細(xì)胞僅來自注射的小鼠干細(xì)胞，而胚外細(xì)胞僅來自宿主胚胎的電融合細(xì)胞(choi?et?al.nature(2017)548(7666):219-223)。然而，人工合成胚胎的目標(biāo)是在沒有任何捐贈(zèng)的生殖細(xì)胞、受精卵或囊胚的情況下建立類似胚胎的結(jié)構(gòu)。幾項(xiàng)研究嘗試通過兩種或三種不同細(xì)胞類型的共聚集來制造合成胚胎[參見例如zhang?et?al.(2020)front.bioeng.biotechnol.8:781]。例如，harrisonet?al.[science(2017)doi:10.1126/science.aa1810]使用了體外擴(kuò)增的小鼠psc、非多能性常規(guī)滋養(yǎng)層干細(xì)胞(tsc)，sozen?et?al.(nature?cell?biology?volume?20,第979–989頁(2018))使用了體外擴(kuò)增的小鼠psc、非多能性常規(guī)滋養(yǎng)層干細(xì)胞(tsc)和非多能性胚外內(nèi)胚層細(xì)胞(稱為xen細(xì)胞)；而amadei等[developmental?cell(2021)56,366–382]使用了原始ipsc、非多能性常規(guī)tsc系和有助于促進(jìn)原始內(nèi)胚層命運(yùn)的瞬時(shí)過表達(dá)gata4轉(zhuǎn)錄因子的小鼠es細(xì)胞(而不是使用穩(wěn)定的小鼠xen系)。然而，獲得的胚胎嚴(yán)重畸形，無法進(jìn)行或完成原腸胚形成或啟動(dòng)器官發(fā)生，并且具有異常的形態(tài)且缺少關(guān)鍵的胚胎定義特征(doi:10.1126/sciadv.add2913)。

背景技術(shù)：

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種產(chǎn)生合成胚胎的方法，所述方法包括：

2、(a)誘導(dǎo)在原始態(tài)多能干細(xì)胞(psc)的亞群中誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的因子的表達(dá)，以獲得滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞；以及

3、(b)在允許形成聚集細(xì)胞的條件下將滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞與原始態(tài)psc混合，

4、其中，當(dāng)誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的因子是外源因子時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)包括在混合之前的14天至0小時(shí)開始并且在混合之后不晚于120小時(shí)結(jié)束的誘導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)；以及

5、其中，當(dāng)誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的因子是內(nèi)源因子時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)包括：在能夠?qū)崿F(xiàn)在所述混合之前的14天至6小時(shí)內(nèi)開始的所述因子的表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述原始態(tài)psc亞群，

6、從而產(chǎn)生合成胚胎。

7、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該方法還包括：在(a)中誘導(dǎo)原始態(tài)psc的第二亞群中誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的因子的表達(dá)，以獲得胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞；以及將胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞與(b)中的細(xì)胞混合。

8、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，其中，當(dāng)誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的因子是外源因子時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)包括在混合之前的14天至0小時(shí)開始并且在混合之后不晚于120小時(shí)結(jié)束的誘導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)；以及

9、其中，當(dāng)誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的因子是內(nèi)源因子時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)包括：在能夠?qū)崿F(xiàn)在所述混合之前14天至6小時(shí)內(nèi)開始的所述因子的表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述原始態(tài)psc亞群。

10、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種產(chǎn)生合成胚胎的方法，所述方法包括：

11、(a)誘導(dǎo)原始態(tài)多能干細(xì)胞(psc)的亞群中誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的外源因子的瞬時(shí)表達(dá)，以獲得滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞；以及

12、(b)在允許形成聚集細(xì)胞的條件下將滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞與原始態(tài)psc混合，

13、其中，誘導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)在混合之前的14天至0小時(shí)開始并且在混合之后不晚于120小時(shí)結(jié)束，

14、從而產(chǎn)生合成胚胎。

15、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該方法還包括：在(a)中誘導(dǎo)原始態(tài)psc的第二亞群中誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的外源因子的瞬時(shí)表達(dá)，以獲得胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞；以及將胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞與(b)中的細(xì)胞混合。

16、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，混合原始態(tài)psc、滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞和胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行。

17、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，混合原始態(tài)psc和胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞在與滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞混合前進(jìn)行。

18、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞和/或胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞在0小時(shí)表達(dá)多能性標(biāo)記物。

19、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞和/或胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞在混合時(shí)表達(dá)多能性標(biāo)記物。

20、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞在0小時(shí)表達(dá)滋養(yǎng)外胚層標(biāo)記物。

21、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞在混合時(shí)表達(dá)滋養(yǎng)外胚層標(biāo)記物。

22、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，胚外內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞在0小時(shí)表達(dá)胚外原始內(nèi)胚層標(biāo)記物。

23、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，胚外內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞在混合時(shí)表達(dá)胚外原始內(nèi)胚層標(biāo)記物。

24、根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種制品，其包含：

25、(i)滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞，其中，所述滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞包括原始態(tài)多能干細(xì)胞(psc)，所述原始態(tài)多能干細(xì)胞(psc)包含適合于瞬時(shí)表達(dá)誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的因子的外源多核苷酸；和

26、(ii)原始態(tài)psc。

27、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述制品還包含：

28、(iii)胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞，其中，所述胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞包括原始態(tài)多能干細(xì)胞(psc)，所述原始態(tài)多能干細(xì)胞(psc)包含適合于瞬時(shí)表達(dá)誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的因子的外源多核苷酸。

29、根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種制品，其包含：

30、(i)滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞，其中，所述滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞包括原始態(tài)多能干細(xì)胞(psc)，所述原始態(tài)多能干細(xì)胞胞(psc)包含適合于瞬時(shí)表達(dá)誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的因子的外源多核苷酸；以及

31、(ii)胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞，其中，所述胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞包括原始態(tài)多能干細(xì)胞(psc)，所述原始態(tài)多能干細(xì)胞(psc)包含適合于瞬時(shí)表達(dá)誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的因子的外源多核苷酸。

32、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，(i)、(ii)和(iii)位于單個(gè)容器中。

33、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，(i)、(ii)和(iii)位于不同的容器中。

34、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種宮外培養(yǎng)合成胚胎的方法，所述方法包括在允許形成聚集細(xì)胞的條件下混合制品的細(xì)胞，其中，所述方法包括在混合之前的14天至0小時(shí)內(nèi)開始并且在混合之后不晚于120小時(shí)結(jié)束誘導(dǎo)因子的瞬時(shí)表達(dá)，從而產(chǎn)生合成胚胎。

35、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了能夠通過該方法獲得的混合物或聚集體。

36、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種混合物或聚集體，其包含：

37、(i)原始態(tài)多能干細(xì)胞(psc)；

38、(ii)滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞，其中所述滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞包括表達(dá)內(nèi)源滋養(yǎng)外胚層標(biāo)記物和內(nèi)源多能標(biāo)記的干細(xì)胞；和

39、(iii)胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞，其中所述胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞包括表達(dá)內(nèi)源胚外原始內(nèi)胚層標(biāo)記物和內(nèi)源多能性標(biāo)記物的干細(xì)胞，

40、其中所述混合物或聚集體在結(jié)構(gòu)上不組織作為任何發(fā)育階段的自然胚胎；并且

41、其中所述混合物或聚集體能夠形成合成胚胎，所述合成胚胎在結(jié)構(gòu)上組織作為至少植入后卵圓柱階段或雙層盤發(fā)育階段的自然胚胎。

42、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種混合物或聚集體，其包括：

43、(i)滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞，其中，滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞包括表達(dá)誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的外源因子、內(nèi)源滋養(yǎng)外胚層標(biāo)記物和內(nèi)源多能性標(biāo)記物的干細(xì)胞；和

44、(ii)原始態(tài)多能干細(xì)胞(psc)。

45、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述混合物或聚集體還包含：

46、(iii)胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞，其中，所述胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞包括表達(dá)誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的外源因子、內(nèi)源胚外原始內(nèi)胚層標(biāo)記物和內(nèi)源多能性標(biāo)記物的干細(xì)胞。

47、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的因子包括gata4、gata6和/或sox17。

48、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的因子包括gata4和/或gata6。

49、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的因子的表達(dá)包括在混合之前的14天至6小時(shí)內(nèi)開始用誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的因子培養(yǎng)原始態(tài)psc的第二亞群。

50、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該方法還包括在混合之前的14天至0小時(shí)內(nèi)使原始態(tài)psc的第二亞群與誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的因子接觸。

51、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的因子選自由gsk-3抑制劑、wnt配體、肝素、fgf2、fgf4、pdgf、白血病抑制因子(lif)和胰島素組成的組。

52、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)分化為胚外原始內(nèi)胚層細(xì)胞的因子選自由gsk-3抑制劑、wnt配體、肝素、fgf2和fgf4組成的組。

53、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的因子選自由cdx2、gata3和gata2組成的組。

54、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的因子的表達(dá)包括在混合之前的14天至6小時(shí)內(nèi)開始用誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的因子培養(yǎng)原始態(tài)psc的亞群。

55、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該方法還包括在混合之前的14天至0小時(shí)內(nèi)使原始態(tài)psc的亞群與誘導(dǎo)誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的因子接觸。

56、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的因子選自由tgfr抑制劑、fgfr抑制劑、mek/erk抑制劑、bmp4、jak抑制劑、rock通路抑制劑、fgf4、fgf2、肝素、sumo化抑制劑、組蛋白去乙?；敢种苿ippo信號(hào)通路抑制劑和誘導(dǎo)yap核易位的因子組成的組。

57、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的因子選自由fgf4、fgf2、肝素、sumo化抑制劑、組蛋白去乙?；敢种苿?、hippo信號(hào)通路抑制劑和誘導(dǎo)yap核易位的因子組成的組。

58、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，瞬時(shí)表達(dá)通過引入編碼因子的多核苷酸來實(shí)現(xiàn)。

59、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，多核苷酸是dna。

60、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，多核苷酸的表達(dá)受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控。

61、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，引入通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)行。

62、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，多核苷酸是rna。

63、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)在混合前120至0小時(shí)內(nèi)開始

64、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)在混合前48至0小時(shí)內(nèi)開始。

65、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)在混合前24至0小時(shí)內(nèi)開始。

66、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)在混合前48至12小時(shí)內(nèi)開始。

67、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)在混合之后不晚于48小時(shí)內(nèi)結(jié)束。

68、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行不超過96小時(shí)。

69、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，誘導(dǎo)內(nèi)源因子的表達(dá)在混合前10至1天內(nèi)開始。

70、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，原始態(tài)psc與滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞之間的比率在1:1和1:5之間。

71、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，原始態(tài)psc與滋養(yǎng)外胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞之間的比率為1:3。

72、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，原始態(tài)psc與原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞之間的比率在1:1和2:1之間。

73、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，原始態(tài)psc與原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞之間的比率為1:1。

74、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該方法還包括在(b)之后對(duì)聚集細(xì)胞進(jìn)行宮外培養(yǎng)。

75、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種宮外培養(yǎng)合成胚胎的方法，該方法包括宮外培養(yǎng)混合物或聚集體。

76、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，培養(yǎng)在靜態(tài)培養(yǎng)然后動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中進(jìn)行。

77、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，靜態(tài)培養(yǎng)一直進(jìn)行到胚胎至少達(dá)到早期植入后卵圓柱階段或雙層盤階段。

78、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)最晚在胚胎達(dá)到早期體節(jié)階段時(shí)開始。

79、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種宮外培養(yǎng)合成胚胎的方法，該方法包括在靜態(tài)培養(yǎng)然后動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中宮外培養(yǎng)處于聚集體階段的合成胚胎，其中靜態(tài)培養(yǎng)進(jìn)行到胚胎至少達(dá)到早期植入后卵圓柱階段或雙層盤階段；并且動(dòng)態(tài)培養(yǎng)最晚在胚胎達(dá)到早期體節(jié)階段時(shí)開始。

80、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)包括搖瓶培養(yǎng)、滾筒培養(yǎng)或其順序組合。

81、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)在大于0.1且小于10.2磅每平方英寸(psi)的高壓下進(jìn)行。

82、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)在大于5且小于10.2磅每平方英寸(psi)的高壓下進(jìn)行。

83、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，培養(yǎng)在包含10％-40％氧氣的氣氛中進(jìn)行。

84、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，在培養(yǎng)過程中使用包含增加濃度的血清或血清替代物的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

85、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，從開始培養(yǎng)直至胚胎達(dá)到植入后早期卵圓柱階段或雙層盤階段，使用包含至少15％血清或血清替代物的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并且此后使用至少30％血清或血清替代物的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

86、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，對(duì)于培養(yǎng)的至少一部分，使用使用包含人血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

87、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該方法還包括將合成胚胎轉(zhuǎn)移到子宮內(nèi)。

88、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

89、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是小鼠細(xì)胞。

90、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。

91、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞。

92、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是牲畜細(xì)胞。

93、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，提供了一種可通過該方法獲得的合成胚胎。

94、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種獲取胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞的方法，所述方法包括在不含激活素a的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)原始態(tài)psc，培養(yǎng)條件允許原始態(tài)psc分化為gata4+gata6+oct4+nanog-胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞，從而獲取胚外原始內(nèi)胚層始發(fā)態(tài)細(xì)胞。

95、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，培養(yǎng)進(jìn)行至少1天。

96、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，培養(yǎng)進(jìn)行長(zhǎng)至10天。

97、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞可以在培養(yǎng)中擴(kuò)增至少五代，同時(shí)保持gata4+gata6+oct4+nanog-表型。

98、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充有g(shù)sk-3抑制劑、白血病抑制因子(lif)和胰島素中的至少一種。

99、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充有g(shù)sk-3抑制劑、肝素、fgf4、pdgf和bsa中的至少一種。

100、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞是人細(xì)胞。

101、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞是小鼠細(xì)胞。

102、除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管在實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明的實(shí)施方案中可以使用與本文所述方法和材料類似或等同的方法和材料，但下文描述了示例性方法和/或材料。如有沖突，以專利說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和示例僅用于說明目的，并非旨在限制。