本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，具體涉及一種適于少量樣本的用于染色體異常檢測的測序用文庫構(gòu)建方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
染色體是細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)，人類有23對染色體，其中22對為常染色體，1對為性染色體。染色體異常包括染色體結(jié)構(gòu)異常和數(shù)目異常，由染色體異常導(dǎo)致的疾病，臨床上表現(xiàn)為染色體病，在自發(fā)性流產(chǎn)、死胎、早夭中占50％以上，新生兒中發(fā)病率約1％，屬于常見的出生缺陷。
染色體數(shù)目異常指多1條或數(shù)條染色體、多1條或數(shù)條染色體片段，常見的染色體數(shù)目異常為13三體、18三體及21三體。在產(chǎn)前診斷中，染色體異常的主要檢測技術(shù)包括：核型分析、比較基因組雜交技術(shù)(arraycgh)、熒光原位雜交技術(shù)，但是由于羊水或臍帶血中胎兒遺傳物質(zhì)較少，需要對遺傳物質(zhì)進(jìn)行放大。如對于核型分析來說，該方法需經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)富集胎兒細(xì)胞，非常耗時(shí)耗力，病人等待報(bào)告的周期長。
近年來，隨著下一代高通量測序(nextgenerationsequencing，ngs)技術(shù)的迅速發(fā)展，由于其存在分辨率高，通量大等優(yōu)勢，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于染色體異常的分析。通過傳統(tǒng)的建庫方法能夠檢測染色體異常，還可發(fā)現(xiàn)新變異，但該方法通常要求較高的dna樣本起始量(100ng以上)，當(dāng)采集樣本數(shù)量有限并無法獲得足量dna時(shí)(如臨床采集又不經(jīng)實(shí)驗(yàn)再放大的羊水、臍血等樣本)，通過現(xiàn)有的建庫方法往往不能得到滿足后續(xù)測序需求的文庫產(chǎn)量。若可以實(shí)現(xiàn)不經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，而是直接利用羊水、臍血等少量樣本進(jìn)行建庫并檢測染色體異常，能夠大大節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間和檢測成本，將會有很廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠適用于羊水等少量樣本的用于染色體異常檢測的測序用文庫的構(gòu)建方法及試劑盒。
本發(fā)明人為解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過優(yōu)化反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)構(gòu)建適用于羊水少量樣本的、染色體異常檢測的測序用文庫，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明包括：
1.一種用于染色體異常檢測的文庫構(gòu)建方法，該方法包括：
步驟a：提取樣本gdna，獲得gdna；
步驟b：將所述gdna進(jìn)行酶切處理，純化，獲得酶切產(chǎn)物；
步驟c：將所述酶切產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)，純化，得到平末端dna片段；
步驟d：將所述平末端dna片段進(jìn)行3'端加a，得到3'端加a的dna片段；
步驟e：將所述3'端加a的dna片段進(jìn)行加接頭，純化，得到加接頭的dna片段；
步驟f：將所述加接頭的dna片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增，純化，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
其中，步驟b中所述的酶切處理使用的酶為dsdnafragmentase；
步驟c中所述末端修復(fù)使用試劑包括：1μlt4dna聚合酶，1μlt4多聚核苷酸激酶、5μl10×多聚核苷酸激酶緩沖液及1μldntp；
步驟d中所述3'端加a使用試劑包括：0.5μlklenow片段(3'-5'exo-)、2.5μldatp及2.5μl10×緩沖液；
步驟f中所述pcr擴(kuò)增的擴(kuò)增引物包括：
ann引物序列(seqidno:1)：
5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-3'
index引物序列(seqidno:2)：
5'-caagcagaagacggcatacgagatannnnnnngtgactggagttc-3'；
其中，n為隨機(jī)堿基。
2.根據(jù)項(xiàng)1所述的文庫構(gòu)建方法，其中，所述步驟a中樣本為羊水、臍血、全血、組織中任意一種。
3.根據(jù)項(xiàng)1所述的文庫構(gòu)建方法，其中，所述步驟b中g(shù)dna的量為8～15ng。
4.根據(jù)項(xiàng)1所述的文庫構(gòu)建方法，其中，所述步驟b的酶切處理的條件為37℃50分鐘。
5.根據(jù)項(xiàng)1所述的文庫構(gòu)建方法，其中，所述步驟c的末端修復(fù)的條件為20℃30分鐘。
6.根據(jù)項(xiàng)1所述的文庫構(gòu)建方法，其中，所述步驟d的3'端加a的反應(yīng)條件為37℃30分鐘。
7.根據(jù)項(xiàng)1所述的文庫構(gòu)建方法，其中，所述步驟f的pcr擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2分鐘、(94℃變性15秒、62℃退火30秒、72℃延伸30秒)17個(gè)循環(huán)、72℃延伸10分鐘、4℃保存。
8.一種用于染色體異常檢測的文庫構(gòu)建試劑盒，其用于實(shí)施項(xiàng)1～7中任一項(xiàng)所述的文庫構(gòu)建方法，其包括：
用于所述酶切處理的試劑；
用于所述末端修復(fù)的試劑；
用于所述3'端加a的試劑；
用于所述加接頭的試劑；
用于所述pcr擴(kuò)增的試劑；
用于所述純化的試劑。
發(fā)明效果
通過本發(fā)明提供的文庫構(gòu)建方法和試劑盒，成功對臨床采集的少量羊水、臍帶血樣本進(jìn)行文庫構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了對少量羊水、臍帶血樣本的直接檢測，既避免了細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，極大的節(jié)約了染色體異常檢測的時(shí)間和檢測成本，提高了染色體異常檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
發(fā)明的具體實(shí)施方式
本說明書中提及的科技術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義，如有沖突以本說明書中的定義為準(zhǔn)。
首先，本發(fā)明提供一種用于染色體異常檢測的文庫構(gòu)建方法，其包括：
步驟a：提取樣本gdna，獲得gdna；
步驟b：將所述gdna進(jìn)行酶切處理，純化，獲得酶切產(chǎn)物；
步驟c：將所述酶切產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)，純化，得到平末端dna片段；
步驟d：將所述平末端dna片段進(jìn)行3'端加a，得到3'端加a的dna片段；
步驟e：將所述3'端加a的dna片段進(jìn)行加接頭，純化，得到加接頭的dna片段；
步驟f：將所述加接頭的dna片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增，純化，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
其中，步驟b中所述的酶切處理使用的酶為dsdnafragmentase；
步驟c中所述末端修復(fù)使用試劑包括：1μlt4dna聚合酶，1μlt4多聚核苷酸激酶、5μl10×多聚核苷酸激酶緩沖液及1μldntp；
步驟d中所述3'端加a使用試劑包括：0.5μlklenow片段(3'-5'exo-)、2.5μldatp及2.5μl10×緩沖液；
步驟f中所述pcr擴(kuò)增的擴(kuò)增引物包括：
ann引物序列(seqidno:1)：
5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-3'
index引物序列(seqidno:2)：
5'-caagcagaagacggcatacgagatannnnnnngtgactggagttc-3'；
其中，n為隨機(jī)堿基，nnnnnnn為標(biāo)簽序列。在這里，標(biāo)簽序列可作為不同樣本文庫的標(biāo)記，不同樣本使用的標(biāo)簽序列不同，測序后將測序數(shù)據(jù)按照標(biāo)簽序列將樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行區(qū)分。
優(yōu)選地，所述步驟a中樣本為羊水、臍血、全血、組織中任意一種。
在本發(fā)明中，所述低起始量是指dna量在8～15ng。
優(yōu)選地，所述步驟a的羊水樣本為未經(jīng)培養(yǎng)的樣本，gdna的量為10ng。
優(yōu)選地，所述步驟b的酶切處理的條件為37℃50分鐘。
優(yōu)選地，所述步驟c的末端修復(fù)條件為20℃30分鐘。
優(yōu)選地，所述步驟d的3'端加a的反應(yīng)條件為37℃30分鐘。
優(yōu)選地，步驟f的pcr擴(kuò)增條件為94℃2分鐘、(94℃15秒、62℃30秒、72℃30秒)17個(gè)循環(huán)、72℃10分鐘、4℃保存。
優(yōu)選地，本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法中，步驟b與步驟c之間、步驟c與步驟d之間、步驟e和步驟f之間、步驟f之后還包括產(chǎn)物純化步驟。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在步驟d和步驟e之間不進(jìn)行純化，可提高最后文庫產(chǎn)量。對于本發(fā)明的純化步驟，本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域人員可以采用傳統(tǒng)建庫中用于純化的方法、試劑或裝置來進(jìn)行。
在另一方面，本發(fā)明提供一種用于染色體異常檢測的文庫構(gòu)建試劑盒(本發(fā)明的試劑盒)，其可用于實(shí)施本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法。該試劑盒包括：
用于所述酶切處理的試劑，例如dsdnafragmentase及相應(yīng)的酶切反應(yīng)緩沖液等；
用于所述末端修復(fù)的試劑，例如t4dna聚合酶、t4多聚核苷酸激酶、dntp、10×多聚核苷酸激酶緩沖液等；
用于所述3'端加a的試劑，例如缺失外切酶活性的klenow片段及相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液等；
用于所述加接頭的試劑，例如接頭、t4dna連接酶及相應(yīng)的連接反應(yīng)緩沖液；
用于所述pcr擴(kuò)增的試劑，例如kapahifihotstartreadmix、ann公共引物、index引物等；
用于所述純化的試劑，例如核酸純化試劑(annoroad公司)、ampurexp純化磁珠(agencourt公司)等。
實(shí)施例
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的實(shí)施例是用于解釋本發(fā)明，而非用于限定本發(fā)明。
實(shí)施例1
1.基因組(gdna)提取
取兩份羊水樣本，分別命名為樣本1、樣本2，各取2ml使用血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒(tiangen)進(jìn)行基因組dna提取，獲得樣本1gdna、樣本2gdna。
2.酶切處理
樣本1和樣本2分別取10ng進(jìn)行酶切處理，單個(gè)反應(yīng)體系如下表1，
表1
反應(yīng)條件為37℃，50分鐘；反應(yīng)結(jié)束后，加入5μl，0.5medta終止反應(yīng)2分鐘；加入2.5μl10％sds混勻后，取49.5μl純化磁珠懸浮液(annoroad公司)，70％乙醇洗兩次，43μlddh2o洗脫dna，獲得樣本1/樣本2酶切產(chǎn)物。
3.末端修復(fù)
對步驟2獲得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)，反應(yīng)體系如下表2，
表2
反應(yīng)條件為20℃，30分鐘，取75μl純化磁珠懸浮液，70％乙醇洗兩次，20μlddh2o洗脫dna，獲得樣本1/樣本2平末端dna片段。
4.3'端加a反應(yīng)
取步驟3中獲得的平末端dna片段按表3進(jìn)行3'端加a反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：
表3
反應(yīng)條件為37℃，30分鐘，獲得樣本1/樣本23'端加a的dna片段。5.加接頭反應(yīng)
取步驟4中獲得的3'端加a的dna片段進(jìn)行加接頭反應(yīng)，反應(yīng)體系如下表4，
表4
反應(yīng)條件為20℃，15分鐘，取78μl純化磁珠懸浮液，70％乙醇洗兩次，18μlddh2o洗脫dna，得到樣本1/樣本2加接頭dna片段。
6.pcr反應(yīng)
取步驟5中獲得的加接頭dna片段，使用表5中的反應(yīng)體系進(jìn)行pcr，反應(yīng)體系如下表，樣本1使用index1引物，樣本2使用index2引物，
index1引物序列(seqidno:3)：
5'-caagcagaagacggcatacgagataagcaatggtgactggagttc-3'
index2引物序列(seqidno:4)：
5'-caagcagaagacggcatacgagataatccgaagtgactggagttc-3'
表5
反應(yīng)條件為：
取45μl純化磁珠懸浮液，70％乙醇洗兩次，81μlddh2o洗脫dna，獲得樣本1/樣本2pcr擴(kuò)增產(chǎn)物(文庫)，完成文庫構(gòu)建。
7.文庫濃度測定
使用caliper和qpcr方法檢測文庫的峰圖和濃度。
分析結(jié)果如下表6，樣本1文庫產(chǎn)量為470nmol/l，樣本2文庫產(chǎn)量為695nmol/l，說明該方法成功建庫，符合測序要求。
表6
實(shí)施例2
使用550ar測序儀對步驟7中獲得的文庫進(jìn)行測序，測序策略為se50。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，得到測序數(shù)據(jù)如下表7，分析測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)(如下表8)樣本1中存在21三體，樣本2羊水中存在18三體。
為了進(jìn)一步證明本發(fā)明的結(jié)果，使用核型分析的方法對樣本1和樣本2進(jìn)行分析，分析發(fā)現(xiàn)樣本1存在21三體，樣本2存在18三體，結(jié)果與本發(fā)明方法獲得文庫的測序結(jié)果一致。
表7
表8
還需要說明的是，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，在本說明書中作為某一技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的任一技術(shù)特征或技術(shù)特征的組合同樣也可以適用于其它技術(shù)方案；并且，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，作為不同技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的技術(shù)特征之間也可以以任意方式進(jìn)行組合，來構(gòu)成其它技術(shù)方案。本發(fā)明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術(shù)方案，并且這些技術(shù)方案相當(dāng)于記載在本說明書中。
上述說明示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn)行改動。而本領(lǐng)域技術(shù)人員所進(jìn)行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
工業(yè)實(shí)用性
根據(jù)本發(fā)明，能夠適用于羊水樣本等少量樣本的、染色體異常檢測的文庫構(gòu)建方法及試劑盒。
序列表
<110>安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司
<120>一種用于染色體異常檢測的文庫構(gòu)建方法及試劑盒
<130>1701rgcn
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<400>ann引物
aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac45
<210>2
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<400>index引物
caagcagaagacggcatacgagatannnnnnngtgactggagttc45
<210>3
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<400>index1引物
caagcagaagacggcatacgagataagcaatggtgactggagttc45
<210>4
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<400>index2引物
caagcagaagacggcatacgagataatccgaagtgactggagttc45