本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于數(shù)字pcr定量檢測(cè)病毒的方法。

背景技術(shù)：

在核酸的體外檢測(cè)領(lǐng)域，熒光定量pcr(qpcr)方法無疑是最主要的分子檢測(cè)手段之一，其中包括了對(duì)病毒分子的定性和定量分析。

在對(duì)病毒核酸進(jìn)行定量的過程中，病毒核酸的提取和純化是非常關(guān)鍵的步驟，該步驟的主要目的之一為將病毒的核酸分子從蛋白類的衣殼內(nèi)釋放出來，滿足下游檢測(cè)的需要；目的之二為去除樣品中對(duì)下游pcr反應(yīng)有抑制作用的各種pcr抑制劑。

但在實(shí)際操作過程中，不同的純化方法及核酸提取試劑盒在上述兩方面的表現(xiàn)是不盡相同的。正由于此，qpcr對(duì)于病毒的定量結(jié)果往往與真實(shí)值存在差異且實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的一致性較差(inter-laboratoryvariability)。因此，針對(duì)某些病毒專門制備了完整病毒的標(biāo)準(zhǔn)品(whole-virusreferencematerials)。利用這類標(biāo)準(zhǔn)品可以用來歸一化核酸制備前處理過程及qpcr檢測(cè)體系的差異，從而提高病毒分子檢測(cè)結(jié)果的可比性。目前這類標(biāo)準(zhǔn)品的載量還是通過qpcr的方法進(jìn)行測(cè)定，對(duì)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室得到的qpcr結(jié)果取平均值獲得，單位一般為：dnacopies(cp)/ml或者iu/ml。但這種定標(biāo)方法依然需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品中核酸提取，所以理論上還是不能明確標(biāo)準(zhǔn)品中病毒核酸的含量。

1999年vogelstein首次提出了“數(shù)字pcr”的概念，“數(shù)字pcr”以其極高的敏感性、絕對(duì)計(jì)算能力和無需定標(biāo)等特性疾病診斷工作中得到了廣泛應(yīng)用。數(shù)字pcr是通過對(duì)樣本進(jìn)行微小單元化處理，可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對(duì)數(shù)目，且數(shù)字pcr不依靠任何校準(zhǔn)物或外標(biāo)便可直接計(jì)數(shù)目標(biāo)分子數(shù)，為絕對(duì)定量pcr技術(shù)。因此數(shù)字pcr(digitalpcr)特別適用于依靠ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究(如等位基因不平衡表達(dá))、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、mirna表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。

目前，應(yīng)用較多的是采用美國(guó)伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司的微滴式數(shù)字pcr儀進(jìn)行數(shù)字pcr分析，其微滴數(shù)字pcr儀具體的結(jié)構(gòu)如cn103429331，該發(fā)明公開了形成乳液的系統(tǒng)，此套系統(tǒng)使每個(gè)經(jīng)核酸提取的樣品形成20000個(gè)液滴，根據(jù)檢測(cè)分析原理，液滴分得越多，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度越高，因此，采用這套儀器進(jìn)行數(shù)字pcr技術(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確度有待進(jìn)一步提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了一種基于數(shù)字pcr定量檢測(cè)病毒的方法，大大節(jié)約成本，并提高了檢測(cè)的精確性和靈敏度。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種基于數(shù)字pcr定量檢測(cè)病毒的方法，該方法包括以下步驟：

步驟一：待檢樣本前處理；

步驟二：微滴制備：

配制pcr水相，pcr水相包括1.6％～2％上游引物、1.6％～2％下游引物、0.2％～0.4％pcr模板、20％～30％pcrmix儀次均勻混合，滴加70％～80％雙蒸水后將溶液體系作為反應(yīng)水相備用；

配制pcr油相，將65％-68％的甘油、5％-10.5％的tritionx-100、5％-10.5％的司盤60、10％-20％的辛癸酸甘油酯依次均勻混合，獲得的溶液作為反應(yīng)油相備用；

分別取水相pcr和油相pcr油相按流量比為1:3.5～1:1.5的比例在線混合，混合的同時(shí)在搖床上渦旋攪拌并反應(yīng)，得到油包水微滴；

步驟三：pcr擴(kuò)增反應(yīng)，將上述充分乳化的油水體系分裝，手動(dòng)轉(zhuǎn)移到96孔pcr板上，孔板用錫箱熱封后設(shè)定pcr反應(yīng)條件進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

步驟四：檢測(cè)微滴，pcr反應(yīng)后，將96孔pcr板置于qx100液滴分析儀中，依次吸取每個(gè)樣本中的微滴并逐一通過檢測(cè)器，有熒光信號(hào)的微滴為陽(yáng)性，無熒光信號(hào)的微滴為陰性。

進(jìn)一步地，所述步驟二中混合液在搖床上渦旋攪拌的時(shí)間為10～14min。

進(jìn)一步地，所述的步驟二中得到的油包水微滴的粒徑為100nm～1μm。

進(jìn)一步地，所述步驟三中pcr反應(yīng)條件為：

反轉(zhuǎn)錄：溫度50℃，10min，1個(gè)循環(huán)；

預(yù)變性：溫度95℃，10min，1個(gè)循環(huán)；

變性：溫度94℃，30s，退火；溫度58℃，60s，共40個(gè)循環(huán)；

結(jié)束反應(yīng)：溫度98℃，10min，1個(gè)循環(huán)。

進(jìn)一步地，所述步驟三中取出反應(yīng)后的pcr溶液，如果出現(xiàn)微弱的分層現(xiàn)象則渦旋數(shù)秒。

本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明公開的一種基于數(shù)字pcr定量檢測(cè)病毒的方法，無需在pcr檢測(cè)之前對(duì)核酸進(jìn)行提取，避免了病毒核酸在提取過程中的損失，更加準(zhǔn)確的測(cè)定出病毒含量；(2)本發(fā)明公開的一種基于數(shù)字pcr定量檢測(cè)病毒的方法，在微滴制備時(shí)將配制好的pcr水相和pcr油相同時(shí)放料，分別瞬時(shí)控制pcr水相和pcr油相的流量，且混合的同時(shí)在搖床上渦旋攪拌并反應(yīng)得到的油包水微滴的粒徑為100nm-1μm，平均粒徑小，微滴大小均一穩(wěn)定，每個(gè)樣品形成的液滴個(gè)數(shù)顯著增加，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度大大提高；(2)本發(fā)明公開的基于數(shù)字pcr定量檢測(cè)病毒的方法，操作簡(jiǎn)單，大大降低了檢測(cè)成本。

附圖說明

圖1為qx100直接定量與對(duì)核酸產(chǎn)物定量、biomark直接定量與對(duì)核酸產(chǎn)物定量的對(duì)比圖；

圖2為qx100對(duì)#365032直接定量與對(duì)核酸產(chǎn)物定量、biomark對(duì)#365032直接定量與對(duì)核酸產(chǎn)物定量的對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

展示一下實(shí)例來具體說明本發(fā)明的某些實(shí)施例，且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。對(duì)本發(fā)明公開的內(nèi)容可以同時(shí)從材料、方法和反應(yīng)條件進(jìn)行改進(jìn)，所有這些改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的的精神和范圍之內(nèi)。

采用兩種不同的數(shù)字pcr設(shè)備對(duì)完整的人巨細(xì)胞病毒(humancytomegalovirus,hcmv)標(biāo)準(zhǔn)品不經(jīng)過核酸提取進(jìn)行直接定量，并與經(jīng)過核酸純化的dpcr定量結(jié)果進(jìn)行了比較。

實(shí)施例1：待測(cè)的完整病毒標(biāo)準(zhǔn)品

1、who的hcmv標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為5×10⁶iu/ml。

2、將上述的who的hcmv標(biāo)準(zhǔn)品，分別以acrometrixedtaplasmadilutionmatrix(lifetechnologies,usa)、pbs和雙蒸水進(jìn)行了梯度稀釋，最終的濃度分別為1×10⁶iu/ml，1×10⁵iu/ml和1×10⁴iu/ml，前者的稀釋模仿了臨床樣品中的血液背景。

3、instand(societyforpromotingqualityassuranceinmedicallaboratories)的hcmv標(biāo)準(zhǔn)品。#365029的濃度為：77,000cp/ml；#365032的濃度為：20,000cp/ml；#365030為陰性對(duì)照。

4病毒核酸純化試劑盒：roche公司的highpureviralnucleicacidkits，核酸純化設(shè)置三平行重復(fù)。

實(shí)施例2：病毒分子的dpcr定量

一、核酸純化時(shí)病毒的dpcr定量

1、將實(shí)施例1中的濃度分別為1×10⁶iu/ml，1×10⁵iu/ml和1×10⁴iu/ml的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行核酸提?。悍謩e取三種濃度的病毒溶液30ml，加入1.0mlte緩沖液，混勻，8000rpm離心5min，收集底部沉淀；然后向收集到的底部沉淀中加入450μl裂解液和10μl蛋白酶k，在55℃的條件下，水浴1小時(shí)，沉淀溶解，得到混合液；采用0.6ml的70％乙醇溶液洗滌2次，晾干后，加入50μlte緩沖液，完成了病毒溶液中hcmvdna的提取，得到了dna模板，在-20℃的條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2、制備引物反應(yīng)溶液：

hcmv的pcr擴(kuò)增正向引物為5’-catgtacgttgctatccaggc-3’

hcmv的pcr擴(kuò)增反向引物為5’-ctccttaatgtcacgcacgat-3’

引物為室溫溶解hcmv的pcr引物，配置20μl引物反應(yīng)溶液，引物反應(yīng)溶液包括10μl2×ddpcrmastermix、10μmol/l的正向引物和10μmol/l的反向引物各0.8μl、taqman-mgb探針0.5μl、dna模板2μl、無菌水6μl，陰性對(duì)照組中，使用不含dna的te緩沖液作為模板。

3、液滴制備：

配制pcr水相，在超凈臺(tái)中往試管中加入5.22μl，102μm的上游引物和下游引物和pcrmix49.42μl，然后將試管轉(zhuǎn)移到pcr模板加入?yún)^(qū)加1.66fmol的模板，在超凈臺(tái)中滴加雙蒸水足至260μl，充分混勻；

配制pcr油相，一次性往試管中加入1.95ml甘油、0.3ml的tritionx-100、0.3ml的司盤60、0.45ml的辛癸酸甘油酯依次均勻混合，獲得的溶液作為反應(yīng)油相備用；

分別取水相pcr和油相pcr油相按流量比為1:2的比例在線混合，混合的同時(shí)在搖床上渦旋攪拌并反應(yīng)，得到油包水微滴；

4、pcr擴(kuò)增反應(yīng)

將上述充分乳化的油水體系分裝，手動(dòng)轉(zhuǎn)移到96孔pcr板上，孔板用錫箱熱封后設(shè)定pcr反應(yīng)條件進(jìn)行pcr擴(kuò)增；擴(kuò)增條件為：(1)反轉(zhuǎn)錄：溫度50℃，10min，1個(gè)循環(huán)；(2)預(yù)變性：溫度95℃，10min，1個(gè)循環(huán)；(3)變性：溫度94℃，30s，退火；溫度58℃，60s，共40個(gè)循環(huán)；(4)結(jié)束反應(yīng)：溫度98℃，10min，1個(gè)循環(huán)。

5、檢測(cè)微滴

pcr反應(yīng)后，將96孔pcr板置于qx100液滴分析儀中，依次吸取每個(gè)樣本中的微滴并逐一通過檢測(cè)器，有熒光信號(hào)的微滴為陽(yáng)性，無熒光信號(hào)的微滴為陽(yáng)性；

二、不進(jìn)行核酸純化條件下直接dpcr定量

將實(shí)施例1中的濃度分別為1×10⁶iu/ml，1×10⁵iu/ml和1×10⁴iu/ml的病毒溶液直接進(jìn)行液滴制備、pcr擴(kuò)增并進(jìn)行微滴檢測(cè)、分析。

實(shí)施例3：直接定量與經(jīng)過純化定量的比較

1、由圖1可知，從總體上看，對(duì)hcmv的dpcr直接定量結(jié)果顯著地高于對(duì)核酸純化產(chǎn)物的hcmv定量結(jié)果，說明直接定量的方式更接近病毒的真實(shí)含量。出現(xiàn)這個(gè)結(jié)果的原因是由于在核酸純化的步驟中無法避免會(huì)造成病毒核酸的損失。

2、qx100對(duì)who的hcmv三個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品的定量結(jié)果顯示：在血漿和pbs稀釋的背景下，直接定量的結(jié)果分別高出對(duì)核酸產(chǎn)物定量結(jié)果的18％和35％。類似的，biomark直接定量的結(jié)果分別高出對(duì)核酸產(chǎn)物定量結(jié)果的26％和53％。具體結(jié)果見下圖1所示。

3、對(duì)instand標(biāo)準(zhǔn)品的分析顯示：qx100對(duì)#365032直接定量的結(jié)果高出對(duì)核酸純化產(chǎn)物定量結(jié)果的39％，對(duì)#365029的分析兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異；biomark對(duì)#365029直接定量的結(jié)果高出對(duì)核酸純化產(chǎn)物定量結(jié)果的35％，具體結(jié)果見下圖2所示。

結(jié)果表明，本發(fā)明無需在pcr檢測(cè)之前對(duì)核酸進(jìn)行提取，避免了病毒核酸在提取過程中的損失，更加準(zhǔn)確的測(cè)定出病毒含量；而且在微滴制備時(shí)將配制好的pcr水相和pcr油相同時(shí)放料，分別瞬時(shí)控制pcr水相和pcr油相的流量，且混合的同時(shí)在搖床上渦旋攪拌并反應(yīng)得到的油包水微滴的粒徑為100nm-1μm，平均粒徑小，微滴大小均一穩(wěn)定，每個(gè)樣品形成的液滴個(gè)數(shù)顯著增加，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度大大提高。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。