本發(fā)明涉及一種hpv檢測試劑盒，特別涉及一種運(yùn)用反向點(diǎn)雜交法快速檢測hpv基因型的試劑盒。
背景技術(shù)：
：宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國每年宮頸癌新發(fā)病例約13萬，是僅次于乳腺癌而引起婦女癌癥相關(guān)死亡的重要原因。近幾年來，隨著生活方式的改變，宮頸癌患者的發(fā)病年齡更趨年輕化，并且病例數(shù)有不斷上升的趨勢。全球每年有將近50萬女性被診斷為宮頸癌，宮頸癌也是目前唯一一種發(fā)病原因比較清楚的癌癥，主要病因是由高危型人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus，hpv）的持續(xù)感染或反復(fù)感染所致，hpv是一種專門感染人表皮和黏膜鱗狀上皮的病毒，傳播途徑以性行為為主。hpv感染在女性中較為普遍，有數(shù)據(jù)顯示，在一生中的某個階段，每5個女性中就有4個會感染。同一型別的高危hpv病毒持續(xù)感染導(dǎo)致發(fā)生宮頸癌或者宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)更高，而不同型別的hpv與宮頸癌的相關(guān)性也不一樣，例如hpv16，18型感染與宮頸癌高度相關(guān)，60％以上的宮頸癌的發(fā)生是由hpv16，18型的持續(xù)感染所致；低危型如6，11等的持續(xù)感染則幾乎不導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。hpv感染與cin和宮頸癌變有著密切的關(guān)系，從宮頸癌前病變發(fā)展到宮頸癌是一個漫長的過程，hpv可在體內(nèi)潛伏10年甚至更長時間，且沒有任何癥狀。因此，把hpv檢測作為常規(guī)篩查的一部分很重要，通過早期檢測提高早期檢出率，宮頸癌前病變的治愈率高達(dá)98%，最終可預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。hpv的檢測意義在于可能對宮頸癌的預(yù)后有預(yù)測作用，且檢測結(jié)果對科學(xué)研究也有一定價(jià)值體現(xiàn)。由于hpv不能在體外細(xì)胞培養(yǎng)，故不能用簡便的血清檢測進(jìn)行hpv的診斷和分型。臨床上用于檢測hpv的方法包括細(xì)胞學(xué)方法、免疫組化、原位雜交、斑點(diǎn)雜交、核酸印跡和pcr等，其中以pcr方法的敏感性最高，且因其簡便、高效和價(jià)廉，是目前應(yīng)用最多的方法。目前主要是通過應(yīng)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行hpvdna的檢測，目前國內(nèi)臨床上進(jìn)行hpvdna檢測的主要方法有實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)法、基因芯片法、雜交捕獲法(hybridcaptureii,hc-ⅱ)。實(shí)時熒光pcr技術(shù)在常規(guī)pcr基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針,從pcr擴(kuò)增到得出結(jié)果是在完全封閉的系統(tǒng)中運(yùn)行,無需pcr后處理,從而避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染和交叉污染的可能性。同時在擴(kuò)增時結(jié)合了特異探針的雜交,進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)的敏感性和特異性,而且可以實(shí)時熒光監(jiān)測擴(kuò)增過程。但該技術(shù)仍存在無法規(guī)避的缺陷，其缺點(diǎn)在于：1.針對可能存在的多個hpv型別的檢測，僅能檢測該樣本是否感染了相應(yīng)基因型的hpv，但不具有具體分型功能；2.前期一般都需要經(jīng)過步驟繁瑣的核酸提取過程；3.普通taq酶介導(dǎo)的熒光pcr反應(yīng)耗時較長（一次熒光pcr反應(yīng)耗時約2小時）。hc-ⅱ本質(zhì)上是基因雜交信號放大技術(shù),采用分子雜交和化學(xué)發(fā)光信號放大的原理,無需基因擴(kuò)增,屬于線性級數(shù)放大。該技術(shù)采用全長8000個堿基的rna探針,靶dna變性為單鏈后與rna探針雜交,形成dna-rna雜交體,再被包被了抗dna-rna雜交體抗體的微孔板捕獲,dna-rna雜交體與標(biāo)有多個堿性磷酸酶的第2抗體結(jié)合,通過酶化學(xué)發(fā)光測定信號強(qiáng)度,與標(biāo)準(zhǔn)品比較有軟件計(jì)算出樣本中靶核酸的濃度。hc-ⅱ技術(shù)實(shí)際上是核酸雜交、免疫反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的綜合運(yùn)用,具有hpv分群(高危群和低危群)功能，其缺陷在于：1.特異度為85%,略低于液基細(xì)胞學(xué)；2.不具有精確分型功能；3.易產(chǎn)生交叉污染,成本費(fèi)用較高,高危型與低危型存在一定的交叉反應(yīng)；4.國外已有文獻(xiàn)報(bào)道存在個別的高危型漏檢率。目前國內(nèi)的基因芯片法hpv檢測試劑都是采用pcr體外擴(kuò)增和dna反向點(diǎn)雜交相結(jié)合的dna芯片技術(shù)。目前國內(nèi)的hpv基因分型檢測試劑盒,均利用hpv的基因特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物,最多可以同時擴(kuò)增出23種hpv基因型的目標(biāo)片段,其缺陷在于：1.前期一般都需要經(jīng)過步驟繁瑣的核酸提取過程；2.普通taq酶介導(dǎo)的普通定性pcr反應(yīng)耗時較長（一次定性pcr反應(yīng)耗時約2.5小時）。因此，開發(fā)出快速、高效的hpv基因分型檢測試劑盒，具有非常實(shí)際的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種運(yùn)用反向點(diǎn)雜交法快速檢測hpv基因型的試劑盒，解決現(xiàn)有技術(shù)中的檢測耗時長、不能具體分型、所分基因型少使得不能盡可能多地涵蓋國人常見的hpv感染型別等問題。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種運(yùn)用反向點(diǎn)雜交法快速檢測hpv基因型的試劑盒，包括hpv分型pcr試劑和反向點(diǎn)雜交試劑，檢測涵蓋18種hpv高危型和10種hpv低危型共計(jì)28種hpv基因型。一、hpv分型pcr試劑包含以下組分：1）hpv分型pcr反應(yīng)液2）細(xì)胞裂解液3）陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品4）特異性引物所述hpv分型pcr反應(yīng)液溶劑為水，其組成如下：tris-hcl10--150mmkcl10--120mm(nh4)2so43--50mm乙酸鎂·tar1--10mm快速taq酶0.1--0.3u/μldntps150--250μm丙三醇1-10%優(yōu)選的，其組成如下：tris-hcl96mmkcl80mm(nh4)2so416mm乙酸鎂·tar5mm快速taq酶0.12u/μldntps200.4μm丙三醇4%作為上述反應(yīng)液的進(jìn)一步改進(jìn)，所使用的tris-hcl的ph值為8.5--9.2。作為上述反應(yīng)液的進(jìn)一步改進(jìn)，在其中添加了udg酶以防污染，并提高了試劑盒靈敏度。作為上述反應(yīng)液的進(jìn)一步改進(jìn)，采用的taq酶為快速taq酶，在本酶的介導(dǎo)下，將定性pcr反應(yīng)時長由常規(guī)普通taq酶反應(yīng)所需的2.5小時縮短至1.5小時，極大地提高了pcr擴(kuò)增效率。所述細(xì)胞裂解液為te緩沖液。所述hpv陽性質(zhì)控品為hpv-18型樣本；陰性質(zhì)控品為滅菌純化水。所述特異性引物是針對人乳頭瘤病毒基因組晚期區(qū)l1區(qū)而設(shè)計(jì)的，序列如下：優(yōu)選的，序列1、序列2、序列3、序列15的5’端有生物素標(biāo)記。優(yōu)選的，序列1~序列14是針對人乳頭瘤病毒基因組晚期區(qū)l1區(qū)設(shè)計(jì)的，序列15~序列16是針對內(nèi)參基因設(shè)計(jì)的。二、反向點(diǎn)雜交試劑包含以下組分：雜交液i濃縮液雜交液ii濃縮液溶液i溶液ii濃縮液溶液iii溶液iv濃縮液hpv分型雜交膜條所述雜交液i濃縮液（1000ml）的組成如下：5×ssc溶液500ml4.5%sds溶液80ml滅菌純化水420ml；所述雜交液ii濃縮液（500ml）的組成如下：5×ssc溶液200ml4.5%sds溶液100ml滅菌純化水200ml；所述溶液i（20ml）的組成如下：pod溶液5ml滅菌純化水15ml；所述溶液ii濃縮液（1000ml）組成如下：檸檬酸三鈉137.5g（用滅菌純化水定容至1000ml）；所述溶液iii（1000ml）組成如下：tmb5gdmso溶劑40ml（用滅菌純化水定容至1000ml）；所述的hpv分型雜交膜條，膜上固定的探針序列如下：探針序列（nh2-5’～3’）探針1tggaagatgtagttacggatg探針2tgtagcagatttagacacaga探針3ttaggtgctggaggtgtatg探針4ccaggtacaggagactgtg探針5agatgctgcagataatgtact探針6aatgtagtatcactgtttgc探針7tgtcactagttacttgtgtgcat探針8gacacagcagaacacacaga探針9tatgtagaaggtatggaagactc探針10gggggactgtgtggca探針11tcaccagatgttgcagtggc探針12gcacagtagggtcagta探針13tgtagacggaggggact探針14cttttctggaggtgtagtat探針15ggaaaccgcagcagtggca探針16aaagatgcagacggtggtgg探針17gacatagactgtgtggttg探針18tatcctgcgtggatgctgta探針19agtaggttagcattcatattatgt探針20ccagtcctccagtaggttagca探針21tccttttctttagggggtgct探針22gggtcctgtttaactggc探針23tggtagagggtggtggta探針24tttcacgggcatcatatttagtt探針25actacagtaacaaayaattg探針26tgacatgtaattgctgctgattg探針27tgacatgtaattgctgctgattg探針28acaaacaactgattatgccaac探針29ctactagcctgtgtacctac探針30aggctgtgtattcattagcc探針31ccaatcatccaacagtgcct探針32catggtgtgcaggtaagccat探針33tgtttgtgcaacagattgagt探針34ctgacacaactgtgttcactagcaa探針35tcttccaatatccggtcctgttgat優(yōu)選地，探針21--探針35的序列的任意一端標(biāo)記了氨基基團(tuán)。所述溶液iv濃縮液為10%--30%h2o2溶液。作為上述溶液ii濃縮液的進(jìn)一步改進(jìn)，將溶液ph調(diào)節(jié)為4。作為上述溶液iii的進(jìn)一步改進(jìn)，用無水乙醇替代滅菌純化水，定容至1000ml。作為上述hpv分型雜交膜條的進(jìn)一步改進(jìn)，使用孔徑為0.6μm的核酸吸附膜作為載體。本發(fā)明的有益效果是：1）本發(fā)明所述的試劑盒使用pcr和反向點(diǎn)雜交相結(jié)合的基因芯片技術(shù)，定性分型檢測宮頸脫落細(xì)胞和生殖泌尿道分泌物樣本中28種人乳頭瘤病毒（hpv）基因型別的核酸，型別包括6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、73、81、82、83型，本發(fā)明試劑盒實(shí)現(xiàn)一管檢測28種hpv基因型，檢測通量高，大大降低了篩查成本。2）通過加入udg酶防污染，使得本發(fā)明的試劑盒的靈敏度更高，最低檢出量為1.0e+04拷貝/反應(yīng)。3）通過采用一種快速taq酶，將定性pcr反應(yīng)時長由常規(guī)普通taq酶反應(yīng)所需的2.5小時縮短至1.5小時，極大地提高了pcr擴(kuò)增效率。附圖說明圖1~7是本試劑盒檢測范圍內(nèi)的檢測結(jié)果示意圖，具體如下：圖1：hpv16型臨床樣本檢測結(jié)果；圖2：hpv18型臨床樣本檢測結(jié)果；圖3：hpv16、53型混合感染臨床樣本檢測結(jié)果；圖4：hpv16、58型混合感染臨床樣本檢測結(jié)果；圖5：陰性樣本檢測結(jié)果；圖6：陽性質(zhì)控品檢測結(jié)果；圖7：陰性質(zhì)控品檢測結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并非限制本發(fā)明。一種運(yùn)用反向點(diǎn)雜交法快速檢測hpv基因型的試劑盒，包括hpv分型pcr試劑和反向點(diǎn)雜交試劑。hpv分型pcr反應(yīng)液溶劑的組成如下：tris-hcl96mmkcl80mm(nh4)2so416mm乙酸鎂·tar5mmtaq酶0.12u/μldntps200.4μm丙三醇4%特異性引物序列如下：序號序列（5’—3’）序列1tgcmcagggwcataayaatg序列2gctcagggtttaaacaatgg序列3gcccagggccacaataatgg序列4cgtccmarrggawactg序列5gcgacccaatgcaaattg序列6cgtcctagtggaaattgatc序列7ctaccgaatggaaattgatc序列8cgccctaagggaaactgggt序列9gcncagggncataacaatgg序列10cctattcttcaccatgcctta序列11gcccagggccacaataatgg序列12gcncagggncacaataatgg序列13cgtccmarrggawactgatc序列14gcncagggncataataatgg序列15gcncagggncataacaatgg序列16cctattcttcaccatgcctta探針序列如下：探針序列（5’～3’）探針1tggaagatgtagttacggatg探針2tgtagcagatttagacacaga探針3ttaggtgctggaggtgtatg探針4ccaggtacaggagactgtg探針5agatgctgcagataatgtact探針6aatgtagtatcactgtttgc探針7tgtcactagttacttgtgtgcat探針8gacacagcagaacacacaga探針9tatgtagaaggtatggaagactc探針10gggggactgtgtggca探針11tcaccagatgttgcagtggc探針12gcacagtagggtcagta探針13tgtagacggaggggact探針14cttttctggaggtgtagtat探針15ggaaaccgcagcagtggca探針16aaagatgcagacggtggtgg探針17gacatagactgtgtggttg探針18tatcctgcgtggatgctgta探針19agtaggttagcattcatattatgt探針20ccagtcctccagtaggttagca探針21tccttttctttagggggtgct探針22gggtcctgtttaactggc探針23tggtagagggtggtggta探針24tttcacgggcatcatatttagtt探針25actacagtaacaaayaattg探針26tgacatgtaattgctgctgattg探針27tgacatgtaattgctgctgattg探針28acaaacaactgattatgccaac探針29ctactagcctgtgtacctac探針30aggctgtgtattcattagcc探針31ccaatcatccaacagtgcct探針32catggtgtgcaggtaagccat探針33tgtttgtgcaacagattgagt探針34ctgacacaactgtgttcactagcaa探針35tcttccaatatccggtcctgttgat具體的，每人份所使用pcr反應(yīng)液的量為30μl。雜交液i濃縮液（1000ml）的組成如下：5×ssc溶液500ml4.5%sds溶液80ml滅菌純化水420ml；雜交液ii濃縮液（500ml）的組成如下：5×ssc溶液200ml4.5%sds溶液100ml滅菌純化水200ml；溶液i（20ml）的組成如下：pod溶液5ml滅菌純化水15ml；溶液ii濃縮液（1000ml）組成如下：檸檬酸三鈉137.5g（用滅菌純化水定容至1000ml）；溶液iii（1000ml）組成如下：tmb5gdmso溶劑40ml（用滅菌純化水定容至1000ml）；檢測操作如下：1.樣本處理和核酸提取1.1振蕩宮頸刷保存管或棉拭子保存管10-30秒，使細(xì)胞充分落入液體，取振蕩后液體0.5ml-1.0ml（如果細(xì)胞數(shù)量少可以加大體積到1.5ml）轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中；1.210,000rpm離心3分鐘，棄上清；1.3樣品沉淀中加入1ml無菌生理鹽水，洗滌沉淀，10,000rpm離心3分鐘，棄上清；1.4樣品沉淀中加入50μl細(xì)胞裂解液，振蕩60秒，充分懸浮細(xì)胞沉淀，備用；1.5質(zhì)控品處理：取裝有hpv陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品的離心管，10,000rpm離心30秒，然后按1.3～1.4的處理步驟操作。2.核酸擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備2.1從試劑盒中取出hpv分型pcr反應(yīng)管，5,000rpm離心5秒后備用；2.2往上述反應(yīng)管中分別加入提取后的待測樣本核酸20μl及提取后的陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品各20μl。蓋緊管蓋，5,000rpm離心30秒后開始pcr擴(kuò)增。2.3擴(kuò)增程序設(shè)置如下：3.雜交操作3.1試劑配制3.1.1雜交試劑、結(jié)合液、顯色液的配置試劑名稱配置方式雜交液i50ml雜交液i濃縮液+20ml滅菌純化水雜交液ii50ml雜交液ii濃縮液+20ml滅菌純化水溶液ii50ml溶液ii濃縮液+20ml滅菌純化水溶液iv100μl溶液iv濃縮液+900μl滅菌純化水結(jié)合液30ml雜交液ii+30μl溶液i顯色液20ml溶液ii+2ml溶液iii+10μl溶液iv3.2雜交3.2.1產(chǎn)物處理3.2.1.1打開電熱恒溫振蕩水槽，待溫度穩(wěn)定后用溫度計(jì)校正搖床溫度至42℃；3.2.1.2將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物置于98℃8分鐘，使產(chǎn)物變性，后立即置于冰水混合物中2分鐘以上；3.2.1.3取n個15ml塑料管，置于離心管架中；鑷子夾取hpv分型雜交膜條，并在膜條邊緣的編號區(qū)編上待檢樣本號；3.2.1.4然后將每張膜條分別放入一支15ml塑料管中，加入約8ml預(yù)熱雜交液ⅰ，備用；3.2.1.5將擴(kuò)增后的pcr產(chǎn)物加入對應(yīng)編號的15ml塑料管中，蓋緊管蓋；并將離心管平放入42℃水浴搖床中，低速轉(zhuǎn)動（100～150轉(zhuǎn)/分）雜交1小時；3.2.1.6將雜交液ⅱ放入水浴搖床中預(yù)熱至42℃，備用。3.3結(jié)合3.3.1棄雜交液i，將膜條轉(zhuǎn)入50ml離心管中。3.3.2加入現(xiàn)配的結(jié)合液，放入42℃水浴搖床中，低速轉(zhuǎn)動（100～150rpm）結(jié)合10分鐘。3.4洗膜3.4.1棄結(jié)合液，取出hpv分型雜交膜條，轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加入預(yù)熱至42℃的雜交液ⅱ，置42℃水浴搖床中，低速轉(zhuǎn)動（100～150rpm）洗膜10分鐘。3.5顯色3.5.1棄雜交液ⅱ，取出hpv分型雜交膜條，轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加入現(xiàn)配的顯色液3.5.2在20～25℃中輕搖、避光顯色10分鐘；3.5.3取出膜條放入20ml溶液ⅱ中，終止顯色2分鐘；3.5.4棄溶液ⅱ，加入20ml純水，輕搖2分鐘取出，用吸水紙吸去膜條表面水分，進(jìn)行分析判斷。4.結(jié)果判斷4.1在cc點(diǎn)和pc點(diǎn)均有圓點(diǎn)信號的前提下，膜條中每一個數(shù)字所在區(qū)域表示相應(yīng)的hpv基因型，顯色反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)數(shù)字所在區(qū)域圓點(diǎn)的有無判斷hpv基因型，即圓點(diǎn)顯現(xiàn)的位置判定為相應(yīng)的hpv基因型。使用本發(fā)明檢測試劑盒的檢測結(jié)果示意圖如圖1~7所示。從圖中可以清楚地看出，本發(fā)明的檢測試劑盒可以有效地檢測出hpv，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。sequencelisting<110>廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司<120>一種運(yùn)用反向點(diǎn)雜交法快速檢測hpv基因型的試劑盒<130>2016<160>51<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gcmcagggwcataayaatgg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gctcagggtttaaacaatgg20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gcccagggccacaataatgg20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4cgtccmarrggawactgatc20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gcgacccaatgcaaattggt20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6cgtcctagtggaaattgatc20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ctaccgaatggaaattgatc20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8cgccctaagggaaactgggt20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9gcccagggccacaataatgg20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>nisa,c,g,ort<400>10gcncagggncacaataatgg20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11cgtccmarrggawactgatc20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>nisa,c,g,ort<400>12gcncagggncataataatgg20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>nisa,c,g,ort<400>13gcncagggncataacaatgg20<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列<400>14cctattcttcaccatgcctta21<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15caacttcatccacgttcacc20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16gaagagccaaggacaggtac20<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列<400>17tggaagatgtagttacggatg21<210>18<211>21<212>dna<213>人工序列<400>18tgtagcagatttagacacaga21<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列<400>19ttaggtgctggaggtgtatg20<210>20<211>19<212>dna<213>人工序列<400>20ccaggtacaggagactgtg19<210>21<211>21<212>dna<213>人工序列<400>21agatgctgcagataatgtact21<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列<400>22aatgtagtatcactgtttgc20<210>23<211>23<212>dna<213>人工序列<400>23tgtcactagttacttgtgtgcat23<210>24<211>20<212>dna<213>人工序列<400>24gacacagcagaacacacaga20<210>25<211>23<212>dna<213>人工序列<400>25tatgtagaaggtatggaagactc23<210>26<211>16<212>dna<213>人工序列<400>26gggggactgtgtggca16<210>27<211>20<212>dna<213>人工序列<400>27tcaccagatgttgcagtggc20<210>28<211>17<212>dna<213>人工序列<400>28gcacagtagggtcagta17<210>29<211>17<212>dna<213>人工序列<400>29tgtagacggaggggact17<210>30<211>20<212>dna<213>人工序列<400>30cttttctggaggtgtagtat20<210>31<211>19<212>dna<213>人工序列<400>31ggaaaccgcagcagtggca19<210>32<211>20<212>dna<213>人工序列<400>32aaagatgcagacggtggtgg20<210>33<211>19<212>dna<213>人工序列<400>33gacatagactgtgtggttg19<210>34<211>20<212>dna<213>人工序列<400>34tatcctgcgtggatgctgta20<210>35<211>24<212>dna<213>人工序列<400>35agtaggttagcattcatattatgt24<210>36<211>22<212>dna<213>人工序列<400>36ccagtcctccagtaggttagca22<210>37<211>21<212>dna<213>人工序列<400>37tccttttctttagggggtgct21<210>38<211>18<212>dna<213>人工序列<400>38gggtcctgtttaactggc18<210>39<211>18<212>dna<213>人工序列<400>39tggtagagggtggtggta18<210>40<211>23<212>dna<213>人工序列<400>40tttcacgggcatcatatttagtt23<210>41<211>20<212>dna<213>人工序列<400>41actacagtaacaaayaattg20<210>42<211>23<212>dna<213>人工序列<400>42tgacatgtaattgctgctgattg23<210>43<211>23<212>dna<213>人工序列<400>43tgacatgtaattgctgctgattg23<210>44<211>22<212>dna<213>人工序列<400>44acaaacaactgattatgccaac22<210>45<211>20<212>dna<213>人工序列<400>45ctactagcctgtgtacctac20<210>46<211>20<212>dna<213>人工序列<400>46aggctgtgtattcattagcc20<210>47<211>20<212>dna<213>人工序列<400>47ccaatcatccaacagtgcct20<210>48<211>21<212>dna<213>人工序列<400>48catggtgtgcaggtaagccat21<210>49<211>21<212>dna<213>人工序列<400>49tgtttgtgcaacagattgagt21<210>50<211>25<212>dna<213>人工序列<400>50ctgacacaactgtgttcactagcaa25<210>51<211>25<212>dna<213>人工序列<400>51tcttccaatatccggtcctgttgat25當(dāng)前第1頁12