本發(fā)明涉及具有呈味效果的肽，具體涉及具有厚味的γ-谷氨酰肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

γ-谷氨酰肽廣泛存與多種動植物和發(fā)酵食品中，是一種安全天然、安全的食品成分。常見的谷胱甘肽其一級結(jié)構(gòu)是γ-glu-cys-gly，是一種典型的γ-谷氨酰肽?，F(xiàn)代研究表明γ-谷氨酰肽與生物體的代謝活動和生理功能有關(guān)，此外大部分γ-谷氨酰肽具有鎮(zhèn)定減壓、舒緩疲勞、抗癌解毒、絡(luò)合重金屬離子、維持細胞金屬離子平衡等生理功能。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰肽還具有較強的呈味特性。2002年日本味之素株式會社公開了通過探索具有casr激動劑活性的多種多樣的化合物，發(fā)現(xiàn)具有更優(yōu)異的濃味賦予作用，特別是具有前味型的濃味賦予作用，且具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，可以簡便而低成本地生產(chǎn)的能夠賦予濃味的物質(zhì)，提供包含該物質(zhì)的濃味賦予劑，以及將該物質(zhì)與其他具有casr激動劑活性的物質(zhì)組合使用而成的復(fù)合濃味賦予劑。包含γ-glu-abu(l-γ-谷氨酰-l-2-氨基丁酸)的濃味賦予劑，以及該物質(zhì)與其他具有casr激動劑活性的物質(zhì)組合使用而成的復(fù)合濃味賦予劑(專利申請?zhí)?01080024054.1)。

在低濃度條件下的大部分γ-谷氨酰肽具有輕微澀味，隨著濃度的提高，γ-谷氨酰肽開始呈現(xiàn)基本味道。例如γ-glu-glu在濃度為10mmol/l時有鮮味，γ-glu-tyr的苦味閾值是其澀味閾值的兩倍。在鮮味溶液中，γ-谷氨酰肽具有厚味，閾值也在明顯下降。隨著人們對呈味肽的進一步了解，學(xué)者發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰肽具有厚味物質(zhì)的特征：1.在水溶液中基本沒有味道或只有輕微的味道(澀味或酸味)；2.能夠與體系中的其他呈味物質(zhì)發(fā)生協(xié)同增效作用，添加到含有鮮味物質(zhì)的溶液體系中，不會改變?nèi)芤旱幕疚队X強度，但是能協(xié)調(diào)各種味道，顯著增加濃厚感(kokumi)；3.與純水溶液相比，在鮮味溶液中閾值明顯下降。

表1已報道γ-谷氨酰肽呈味特性和閾值一覽表

迄今為止，尚未見γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr具有濃厚味的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種利用谷氨酰胺酶合成γ-谷氨酰肽的制備方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。

一種寡肽，其氨基酸序列為γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr。

本發(fā)明提供的濃厚味賦予劑，由所述寡肽和如下一種以上的肽組合而成：γ-glu-x-gly(x表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-glu-val-y(y表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-glu-abu、γ-glu-ala、γ-glu-gly、γ-glu-cys、γ-glu-met、γ-glu-thr、γ-glu-val、γ-glu-orn、asp-gly、cys-gly、cys-met、glu-cys、gly-cys、leu-asp、d-cys、γ-glu-met(o)、γ-glu-γ-glu-val、γ-glu-val-nh2、γ-glu-val-ol、γ-glu-ser、γ-glu-tau、γ-glu-cys(s-me)(o)、γ-glu-leu、γ-glu-ile、γ-glu-t-leu和γ-glu-cys(s-me)。

一種含有所述寡肽的調(diào)味料，其含有330mg/kg以上的γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr和。

一種含有所述寡肽的調(diào)味料，含有330mg/kg以上的γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr。

一種含有所述寡肽的調(diào)味料，含有1000mg/kg以上的γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr。

所述寡肽的制備方法，具體是：谷氨酰胺與游離酪氨酸，摩爾比為1-2:1，溶于水中得溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)ph為7.0-10.0，添加谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶0.02-1％(w/w)，在25-50℃反應(yīng)3-12小時，后用4mol/l鹽酸回調(diào)ph至7～8之間，90℃滅酶10min，得到含γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr的反應(yīng)液。采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流動相a液為0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流動相b液為0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱溫為40℃，流速為1ml/min，反應(yīng)液的進樣量10μl，采用高效液相色譜對反應(yīng)液進行梯度洗脫，出峰時間為5.530的峰即為寡肽γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr。

進一步地，所述溶液中谷氨酰胺的濃度為400-1000mmol/l。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點：

1)本發(fā)明首次公開了γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr具有厚味特性。

2)首次公開了利用谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶催化制備γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr。

附圖說明

圖1為反應(yīng)后混合物的液相色譜圖；

圖2為γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr的二級質(zhì)譜圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和實例對本發(fā)明的具體是實施作進一步舉例，但本發(fā)明的實施和保護不限于此。

實施例1

將解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)swjs22(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.8425，已經(jīng)經(jīng)在中國專利申請?zhí)?01510222162.4的申請中提交了保藏證明)以1％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：4％豆粕、2％麩皮、2％玉米粉)中，37～39℃發(fā)酵培養(yǎng)30h。將發(fā)酵液于4℃，10000r/min條件下高速離心10min，過濾得上清液，即谷氨酰胺酶粗酶液。

將600mm谷氨酰胺和600mm酪氨酸溶于100g水中，分別調(diào)節(jié)溶液的ph值至9.0，加入1g粗酶液，在40℃分別反應(yīng)12h后，用4mol/l鹽酸回調(diào)ph至7.0后，90℃滅酶10min，得到含有γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr的反應(yīng)液。

采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流動相a液為0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流動相b液為0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱溫為40℃，流速為1ml/min，反應(yīng)液的進樣量10μl，采用高效液相色譜對反應(yīng)液進行梯度洗脫(條件：0min時90％的a液和10％的b液梯度5min內(nèi)降低到85％的a液和15％的b液，下一個5min內(nèi)降低到20％a液和80％的b液)。5.530min的峰即為寡肽γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr。收集5.530min的寡肽峰，進行感官評價和uplc-ms/ms分析。

uplc-ms/ms對反應(yīng)產(chǎn)物進行定性分析：包括：anagilent1290seriesuplcsystem(agilenttechnologies)用于分離各γ-glu-peptides,帶有anelec-trosprayionization(esi)的質(zhì)譜系統(tǒng)(q-tofms/ms，brukerdaltonics)進行定性分析。色譜柱為：agilentzorbaxrrhdsb-c18(2.1x50mm,1.8μm)。進樣量為5μl。液相條件為：溶液a為0.1％甲酸-水溶液，和溶液b為0.1％甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫程序為：0–10％b,0-5.0min；10-15％b,5.0-10.0min；然后100％b,10.0-12.0min。ms條件：ionization(離子化)：正離子模式；dryinggas(干燥氣體)：350℃下10l/min；nebulizer(噴霧器壓力)：25psig；fragmentor(毛細管電壓)：30v。對收集物進行uplc-ms/ms分析，其檢測結(jié)果如圖2。

由圖2可知，其一級結(jié)構(gòu)為γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr。

實施例2

將枯草芽胞桿菌atcc6633以1％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：4％豆粕、2％麩皮、2％玉米粉)中，37～39℃發(fā)酵培養(yǎng)48h。將發(fā)酵液于4℃，10000r/min條件下高速離心10min，過濾得上清液，即γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶粗酶液。

將600mm谷氨酰胺和600mm酪氨酸溶于100g水中，分別調(diào)節(jié)溶液的ph值至8.0，加入1gγ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶粗酶液，在40℃分別反應(yīng)6h后，用4mol/l鹽酸回調(diào)ph至7.0后，90℃滅酶10min，得到富含γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr的反應(yīng)液。采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流動相a液為0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流動相b液為0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱溫為40℃，流速為1ml/min，反應(yīng)液的進樣量10μl，采用高效液相色譜對反應(yīng)液進行梯度洗脫，收集5.530min的寡肽峰即為γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr。

實施例3

添加0.033％(g/g)γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr醬油中，評價其呈味特性變化。其中，醬油為市售海天金標醬油。感官評價實驗由30-41歲有感官評價經(jīng)驗的7位男性和9位女性組成。感官評價結(jié)果表明，超過80％感官評價小組成員認為添加0.025％γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr的醬油，其厚味具有明顯提高。

實施例3

稱取0.025g和0.04g的γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr，以及0.5g食鹽和0.3g味精，溶解于100g水中，并和空白樣(0.5g食鹽溶于100g水中)進行感官評價。感官評價實驗由30-41歲有感官評價經(jīng)驗的7位男性和9位女性組成，感官評價結(jié)果見表1。

由表1可見，γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr在食鹽水中的閾值分別為0.04g/100g，添加味精可明顯降低γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr的刺激呈味閾值，為0.025g/100g。

表1

16位感官評價小組中有13人發(fā)現(xiàn)0.5％食鹽和0.3％味精溶液中添加γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr的樣品具有顯著的厚味增強效果，3人認為厚味略有增強。

實施例4

將雞胸肉與10倍重量去離子水混合，100℃煮沸30min后，過濾去除不溶性物質(zhì)和油脂，加入雞湯重量0.3％的食鹽后，分別添加雞湯重量0.04％和0.06％的γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr，并交由感官評價小組對雞湯的厚味進行評價，結(jié)果見表2。感官評價實驗由30-41歲有感官評價經(jīng)驗的11位男性和9位女性組成。

表2

由表2可見，雞湯中添加0.025％和0.04％的γ-glu-γ-glu-γ-glu-tyr，大部分感官評價成員認為雞湯的厚味有顯著或略有增加。