本發(fā)明涉及一種新型尿苷類磷酰胺前藥或其異構(gòu)體、可藥用鹽、水合物與溶劑化物及其制備方法與其在醫(yī)藥上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：丙肝屬于全球流行性疾病，目前患者數(shù)超過2億，其中中國患者有數(shù)千萬。ns5b抑制劑是一種聚合酶抑制劑，通過與ns5brna-依賴的rna聚合酶結(jié)合干擾病毒的復(fù)制。此類藥物有兩種類型：核苷類抑制劑及非核苷類抑制劑。核苷類抑制劑是活性部位抑制劑，偽裝成聚合酶的天然底物插入到rna鏈中，中斷rna的復(fù)制。因此此類藥物能對抗所有基因型的hcv感染，病毒對其抗藥性也非常低。其中2-氟-2-甲基去氧尿苷三磷酸是一個細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)效ns5b抑制劑，但在體內(nèi)無法轉(zhuǎn)運(yùn)至病灶?？梢圆捎闷浞腔钚孕问?-氟-2-甲基去氧尿苷單磷酸的前藥，其在體內(nèi)代謝成2-氟-2-甲基去氧尿苷單磷酸后活化成2-氟-2-甲基去氧尿苷三磷酸，從而抑制ns5b，發(fā)揮抗hcv作用。目前采用在磷酸基團(tuán)上加入掩蔽基團(tuán)從而形成前藥的策略，其中一個掩蔽基團(tuán)與磷酸基團(tuán)形成磷酰胺結(jié)構(gòu)、另一個基團(tuán)與磷酸基團(tuán)形成磷酯類的化合物被證實(shí)有肝靶向效應(yīng)。成酯基團(tuán)包括各種芳環(huán)和芳雜環(huán)在替諾福韋前藥上的應(yīng)用，尤其是苯酚酯(cn201310041647.4,wo02082841)，但成酯基團(tuán)為相對無毒性的芐基或天然醇或糖或維生素的2-氟-2-甲基去氧尿苷單磷酸的前藥未見合成與生物活性研究報道。本發(fā)明的目的在于提供一類新型尿苷單磷酰胺類前藥化合物與其制備方法以及其在制備治療病毒感染性疾病的藥物中的用途，以同時提高藥物的肝靶向性和生物利用度，從而提高藥物療效，減少藥物用量并降低毒性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明人發(fā)明了一類尿苷類磷酰胺前藥化合物，本發(fā)明化合物在大鼠灌胃后可以在肝部有效代謝、磷酸化轉(zhuǎn)化成活性產(chǎn)物2-氟-2-甲基去氧尿苷三磷酸，而且與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明化合物在血漿中更穩(wěn)定，其活性代謝產(chǎn)物2-氟-2-甲基去氧尿苷三磷酸在血漿中完全檢測不到，從而降低了由于血漿代謝導(dǎo)致活性代謝產(chǎn)物出現(xiàn)在非靶器官從而引起的系統(tǒng)毒副作用。本發(fā)明的目的是提供一種抗病毒尿苷類磷酰胺前藥，為通式ⅰ所示的化合物或其光學(xué)異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽，式中：r獨(dú)立地選自有取代或無取代的芐基基團(tuán)、取代或未取代的c5-c50直鏈或環(huán)狀的天然產(chǎn)物片段，或選自半合成或者全合成的糖類、維生素、醇類，及其結(jié)構(gòu)改造或修飾后得到的類似物片段；r1，r2，r3分別獨(dú)立地選自h、取代或未取代的c1-c10直鏈烴基、c3-c10支鏈烴基、c3-c10環(huán)烴基、c6-c10芳香烴基或雜芳基，其中所述取代為一個到三個獨(dú)立地選自o，s，n，se的雜原子，或者r1與r2，r1與r3，r2與r3與連接它們的結(jié)構(gòu)部分一起形成取代或未經(jīng)取代的3-8元環(huán)；z獨(dú)立地選自o，s，se，-nh-或-ch2-；所述的前藥還包括，如通式ⅰ所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的溶劑化物、其光學(xué)異構(gòu)體。本發(fā)明所述的前藥，優(yōu)選的，其中：r獨(dú)立地選自有取代或無取代的芐基基團(tuán)，或選自母核為c3-c8的直鏈或環(huán)狀的天然產(chǎn)物片段，或選自半合成或者全合成的糖類、維生素、醇類，及其結(jié)構(gòu)改造或修飾后得到的類似物片段；r1，r2，r3分別獨(dú)立地選自h、取代或未取代的c1-c10直鏈烴基、c3-c10支鏈烴基、c3-c10環(huán)烴基、c6-c10芳香烴基或雜芳基，其中所述取代為一個到三個獨(dú)立地選自o,s,n,se的雜原子，或者r1與r2，r1與r3，r2與r3與連接它們的結(jié)構(gòu)部分一起形成取代或未經(jīng)取代的3-8元環(huán)；z選自o，s，se，-nh-或-ch2-。本發(fā)明所述的前藥，進(jìn)一步優(yōu)選，其中：r獨(dú)立地選自有取代或無取代的芐基基團(tuán)，或選自母核為c3-c8的天然產(chǎn)物，所述天然產(chǎn)物選自各種單糖類或其類似物片段，或選自各種多糖或其類似物片段，或選自脂溶性維生素，或選自天然醇類或其類似物；r1，r2，r3分別獨(dú)立地選自h、取代或未取代的c1-c10直鏈烴基、c3-c10支鏈烴基、c3-c10環(huán)烴基、c6-c10芳香烴基或雜芳基，其中所述取代為一個到三個獨(dú)立地選自o,s,n,se的雜原子，或者r1與r2，r1與r3，r2與r3與連接它們的結(jié)構(gòu)部分一起形成取代或未經(jīng)取代的3-8元環(huán)；z選自o，s，se，-nh-或-ch2-。本發(fā)明所述的前藥，進(jìn)一步優(yōu)選，其中：r獨(dú)立地選自有取代或無取代的芐基基團(tuán)，或選自母核為c3-c8的天然產(chǎn)物，所述天然產(chǎn)物選自各種單糖類或其類似物片段，或選自各種多糖類或其類似物片段，或選自脂溶性維生素，或選自天然醇類或其類似物；r1，r2，r3分別獨(dú)立地選自h、取代或未取代的c1-c10直鏈烴基、c3-c10支鏈烴基、c3-c10環(huán)烴基、c6-c10芳香烴基或雜芳基，其中所述取代為一個到三個獨(dú)立地選自o,s,n,se的雜原子，或者r1與r2，r1與r3，r2與r3與連接它們的結(jié)構(gòu)部分一起形成取代或未經(jīng)取代的3-8元環(huán)；z為o或s。本發(fā)明所述的前藥，進(jìn)一步優(yōu)選的，其中：r獨(dú)立地選自苯環(huán)上無取代的芐基基團(tuán)；或者亞甲基上無取代的芐基基團(tuán)；或者苯環(huán)上取代基獨(dú)立地選自鄰位或?qū)ξ蝗〈腸1-c10直鏈烴基、oc1-c10烷氧烴基、c3-c10支鏈烴基、c3-c10環(huán)烴基、c6-c10芳香烴基或雜芳基的芐基基團(tuán)；或者亞甲基上取代基獨(dú)立地選自c1-c10直鏈烴基、oc1-c10烷氧烴基、c3-c10支鏈烴基、c3-c10環(huán)烴基、c6-c10芳香烴基或雜芳基的芐基基團(tuán)；或選自母核為c3-c8的各種單糖類或其類似物片段，或選自各種多糖類或其類似物片段，或選自脂溶性維生素，或選自天然醇類或其類似物；r1，r2，r3分別獨(dú)立地選自h、取代或未取代的c1-c10直鏈烴基、c3-c10支鏈烴基、c3-c10環(huán)烴基、c6-c10芳香烴基或雜芳基，其中所述取代為一個到三個獨(dú)立地選自o,s,n,se的雜原子，或者r1與r2，r1與r3，r2與r3與連接它們的結(jié)構(gòu)部分一起形成取代或未經(jīng)取代的3-8元環(huán)；z為o或s。本發(fā)明所述的前藥，進(jìn)一步優(yōu)選的，其中：r獨(dú)立地選自：苯環(huán)上無取代的芐基基團(tuán)；或者亞甲基上無取代的芐基基團(tuán)；或者苯環(huán)上取代基獨(dú)立地選自甲基或/和甲氧基的芐基基團(tuán)；或者亞甲基上取代基獨(dú)立地選自c1-c10直鏈烴基、oc1-c10烷氧烴基、c3-c10支鏈烴基、c3-c10環(huán)烴基、c6-c10芳香烴基或雜芳基的芐基基團(tuán)，當(dāng)芐基苯環(huán)上只有一個取代基且在鄰位時，取代基為非甲基；r1為異丙基；r2為甲基，所連接的碳原子構(gòu)型為r或者s；r3為h；z為o。本發(fā)明所述的前藥，進(jìn)一步優(yōu)選的，式中：r獨(dú)立地選自苯環(huán)上無取代的芐基基團(tuán)，或選自苯環(huán)上的取代基團(tuán)為甲基或/和甲氧基的芐基基團(tuán)，當(dāng)芐基苯環(huán)上只有一個取代基且在鄰位時，取代基為非甲基；r1為異丙基；r2為甲基，所連接的碳原子構(gòu)型為r或者s；r3為h；z為o。本發(fā)明所述的前藥，更進(jìn)一步優(yōu)選的，式中：r獨(dú)立地選自苯環(huán)上無取代的芐基基團(tuán)，或選自苯環(huán)上的取代基團(tuán)為甲基或/和甲氧基的芐基基團(tuán)，當(dāng)芐基苯環(huán)上只有一個取代基且在鄰位時，取代基為非甲基；r1為異丙基；r2為甲基，所連接的碳原子構(gòu)型為s構(gòu)型；r3為h；z為o。本發(fā)明所述的前藥，特別優(yōu)選的，為以下結(jié)構(gòu)的化合物或其光學(xué)異構(gòu)體、或其藥學(xué)上可接受的鹽，或其藥學(xué)上可接受的鹽、或化合物或其光學(xué)異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽的這三類形式化合物的溶劑化物：本發(fā)明的前藥，其中所述式(i)化合物藥學(xué)上可接受的鹽，包括與無機(jī)酸，如鹽酸、硫酸形成的鹽，與有機(jī)酸，如乙酸、三氟乙酸、檸檬酸、馬來酸、草酸、琥珀酸、苯甲酸、酒石酸、富馬酸、扁桃酸、抗壞血酸或蘋果酸形成的鹽，以及氨基酸，如丙氨酸、天冬氨酸、賴氨酸形成的鹽或與磺酸，如甲磺酸、對甲苯磺酸形成的鹽。根據(jù)需要和化合物的性質(zhì)，也可按常規(guī)方法將它們制備成堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銀鹽、鋇鹽等，如鉀鹽，鈉鹽，銨鹽，鈣鹽，鎂鹽。本發(fā)明的式(i)化合物也可以溶劑化物(如水合物)的形式存在，因此，這些溶劑化物(如水合物)也包括在本發(fā)明的化合物之內(nèi)。本發(fā)明進(jìn)一步包括所述的前藥的制備方法，所述方法之一反應(yīng)式如下：1.1)三氯氧磷在堿的作用下與含羥基的醇類或糖類或者含芐基的化合物反應(yīng)后，再與氨基酸酯和含苯環(huán)的活性芳香試劑反應(yīng)得到活性磷酯中間體；其中y為o原子或者s原子或者se原子，r4為氫原子或者任意含硅或者含氟的活潑離去基團(tuán)，w為任意鹵素原子或者硝基集團(tuán)，n為0-5任意整數(shù)。1.2)磷酯中間體與尿苷類似物33在堿的存在下反應(yīng)生成如式ⅰ所示的尿苷單磷酰胺類前藥。所述步驟1.1)中：堿是無機(jī)堿或有機(jī)堿，優(yōu)選有機(jī)堿，進(jìn)一步優(yōu)選有機(jī)堿為胺類化合物，例如但不限于二異丙基乙基胺，三乙胺，叔丁基胺，二乙胺等；含芐基的化合物指各種取代或者無取代的鹵化芐或芐醇，更優(yōu)選為各種取代或者無取代芐溴或各種取代或者無取代芐醇；所述步驟1.2)中：堿是無機(jī)堿或有機(jī)堿，優(yōu)選有機(jī)堿，進(jìn)一步優(yōu)選有機(jī)堿為胺類化合物，例如但不限于二異丙基乙基胺，三乙胺，叔丁基胺，二乙胺等。所述方法之二反應(yīng)式如下：2.1)尿苷單磷酸化合物34與含羥基的醇類或糖類或帶芐基基團(tuán)的化合物在堿的作用下反應(yīng)得到尿苷單磷酯中間體；2.2)尿苷單磷酯中間體在堿的存在下與末端含nh-基團(tuán)的化合物分子中含-nh-基團(tuán)的環(huán)狀化合物在縮合劑作用下反應(yīng)生成如式ⅰ所示的尿苷單磷酰胺類前藥。所述步驟2.1)中：堿是無機(jī)堿或有機(jī)堿，優(yōu)選有機(jī)堿，進(jìn)一步優(yōu)選有機(jī)堿為胺類化合物，例如但不限于二異丙基乙基胺，三乙胺，叔丁基胺，二乙胺等；帶芐基基團(tuán)的化合物是各種取代或者無取代的鹵化芐或芐醇，優(yōu)選為各種取代或者無取代芐溴或各種取代或者無取代芐醇；所述步驟2.2)中：堿是無機(jī)堿或有機(jī)堿，優(yōu)選有機(jī)堿，進(jìn)一步優(yōu)選有機(jī)堿為胺類化合物，例如但不限于二異丙基乙基胺，三乙胺，叔丁基胺，二乙胺等。本發(fā)明進(jìn)一步包括化合物手性分離的方法，hplc反向制備柱分離或者手性柱分離收集各保留時間的洗脫液，干燥得到各手性異構(gòu)體。本發(fā)明進(jìn)一步包括含有本發(fā)明所述的前藥和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。所述的前藥可以治療病毒感染性疾病如丙型肝炎或者丙肝病毒引起的疾病。本發(fā)明的藥物組合物，優(yōu)選的是單位劑量的藥物制劑形式，在制成藥物制劑時可以制成任何可藥用的劑型，這些劑型選自：片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、貼劑。優(yōu)選的是口服制劑形式，最佳優(yōu)選的是片劑，膠囊劑。進(jìn)一步的，本發(fā)明所述藥物組合物還含有藥學(xué)上可接受的載體?？梢圆捎弥苿W(xué)常規(guī)技術(shù)制備該藥物制劑，如將本發(fā)明的替新型尿苷單磷酸酰胺類前藥化合物、或其水合物、或其溶劑化物、或其藥學(xué)上可接受的鹽或其拆分的單一異構(gòu)體與藥學(xué)上可接受的載體混合。所述藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于：甘露醇、山梨醇、山梨酸或鉀鹽、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素a、維生素c、維生素e、維生素d、氮酮、edta二鈉、edta鈣鈉，一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、吐溫60-80、司盤-80、蜂蠟、羊毛脂、液體石蠟、十六醇、沒食子酸酯類、瓊脂、三乙醇胺、堿性氨基酸、尿素、尿囊素、碳酸鈣、碳酸氫鈣、聚乙二醇、環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的藥物組合物，在制成藥劑時，單位劑量的藥劑可含有本發(fā)明的藥物活性物質(zhì)0.1-1000mg，其余為藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體以重量計可以是制劑總重量的0.1-99.9％。本發(fā)明的藥物組合物在使用時根據(jù)病人的情況確定用法用量。以下為名詞術(shù)語的解釋說明：所述單糖類或其類似物為包括但不限于核糖，去氧核糖，阿拉伯糖，阿洛糖，呋喃糖，木糖，鼠李糖，葡萄糖，甘露糖等；所述多糖類或其類似物片段，例如但不限于蔗糖，乳糖，麥芽糖，纖維二糖等；所述脂溶性維生素是指不溶于水而溶于脂肪及有機(jī)溶劑的維生素，包括維生素a、維生素d、維生素e、維生素k；所述天然醇類或其類似物，例如但不限于白藜蘆醇，黃酮醇，薄荷醇等。本發(fā)明提供的化合物具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、結(jié)構(gòu)上：與索非布韋結(jié)構(gòu)相比，用毒性較小的芐基或者天然醇類或者天然糖類或者維生素類取代索非布韋結(jié)構(gòu)中的苯基，從而使代謝片段從神經(jīng)毒性和心臟毒性較高的苯酚替換成相對無毒的芐醇或者天然醇類或者天然糖類或者維生素類化合物；2、效果上：本發(fā)明提供的化合物在大鼠灌胃后可以在肝部有效代謝、磷酸化轉(zhuǎn)化成活性產(chǎn)物2-氟-2-甲基去氧尿苷三磷酸，而活性代謝產(chǎn)物在血液中完全檢測不到。而且與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的化合物在人血漿中更穩(wěn)定，從而在保持化合物的生物活性的同時降低了由于血漿代謝引起活性代謝產(chǎn)物出現(xiàn)在非靶器官因而導(dǎo)致的系統(tǒng)毒副作用。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)地解釋本發(fā)明，使得本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本專利。合成路線或具體實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并不以任何方式限定本發(fā)明。合成路線一：合成路線二：實(shí)施例1：化合物21的制備往三頸瓶中加入pocl3(14.2g，92.5mmol，1.00eq)，無水二氯甲烷(300ml)，混合均勻后冷卻至-40℃，在此溫度攪拌下滴加化合物11(見合成路線一中的原料11，10.0g，92.5mmol，1.00eq)和無水三乙胺(9.36g，92.5mmol，1.00eq)在無水二氯甲烷(100ml)中的混合液，30分鐘滴加完畢后保溫-78℃攪拌2小時。在此溫度下往反應(yīng)混合物中加入化合物31(14.7g，87.8mmol，0.95eq)和無水二氯甲烷(50ml)，然后滴加三乙胺(18.7g，185mmol，2.00eq)的無水二氯甲烷(50ml)溶液，30分鐘滴加完畢后，自然升至室溫，攪拌2小時后冷卻至0℃。往反應(yīng)混合物中滴加化合物32(10.2g，55.5mmol，0.60eq)和三乙胺(11.2g，111mmol，1.20eq)的無水二氯甲烷(50ml)混合液，20分鐘滴加完畢后，在室溫條件下攪拌過夜(16小時)，減壓旋干溶劑。殘渣用水(200ml)和乙酸乙酯(100ml)分液，水相用乙酸乙酯(50ml×2)進(jìn)一步萃取后合并有機(jī)相，有機(jī)相用鹽水(50ml)洗滌后無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓旋干溶劑后進(jìn)行柱層析(硅膠，200-300目，乙酸乙酯/石油醚體積比為1/10～1/1)，得到白色固體21，收率89.8％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.37～7.38(m,5h),5.19～5.23(m,2h),4.99～5.09(m,1h),3.97～4.08(m,1h),3.75-3.84(m,1h),1.41(dd,j＝7.2hz,j＝12.8hz,3h),1.22-1.27(m,6h)；19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-153.57～-153.71(m,2f),-159.76～-160.01(m,1f),-162.15～-162.34(m,2f)；31pnmr(400mhz,cdcl3)δ3.91(s,1p).實(shí)施例2：化合物22的制備制備方法同實(shí)施例1，其中化合物11用化合物12(見合成路線一中的原料12)，替代。收率84.9％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.36-7.18(m,4h),5.25-5.22(m,2h),5.08-4.97(m,1h),4.07-3.95(m,1h),3.82-3.72(m,1h),2.38,2.37(s,s,3h),1.43-1.36(dd,j＝20,8.0hz,3h),1.27-1.20(m,6h)；19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-153.61～-153.75(m,2f),-159.76～-160.01(m,1f),-162.14～-162.33(m,2f)；31pnmr(400mhz,cdcl3)δ4.02,3.97(s,s,1p).實(shí)施例3：化合物23的制備制備方法同實(shí)施例1，其中化合物11用化合物13(見合成路線一中的原料13)替代。收率79.7％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.36-7.27(m,2h),6.98-6.94(m,1h),6.90-6.88(m,1h),5.33-5.21(m,2h),5.09-4.99(m,1h),4.10-4.01(m,1h),3.91-3.83(m,4h),1.43(dd,j＝9.2,7.2hz,3h),1.28-1.23(m,6h)；19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-153.48～-153.64(m,2f),-160.11～-160.35(m,1f),-162.40～-162.59(m,2f)；31pnmr(400mhz,cdcl3)δ3.96,3.88(s,s,1p).實(shí)施例4：化合物24的制備制備方法同實(shí)施例1，其中化合物11用化合物14(見合成路線一中的原料14)替代。收率70.2％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.27-7.16(dd,j＝36,8.0hz,4h),5.16-5.14(d,j＝8.0hz,2h),5.05-4.98(m,1h),4.05-3.96(m,1h),3.76-3.71(m,1h),2.36(3,3h),1.43,1.41(s,s,3h),1.23,1.22(s,s,6h)；19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-153.63～-153.69(m,2f),-160.07～-160.09(m,1f),-162.34～-162.44(m,2f)；31pnmr(400mhz,cdcl3)δ3.91(s,1p).實(shí)施例5：化合物25的制備制備方法同實(shí)施例1，其中化合物11用化合物15(見合成路線一中的原料15)替代。收率15.4％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.38-7.29(m,2h),6.89-6.85(m,1h),6.80-6.78(m,1h),5.36-5.24(m,2h),5.15-5.04(m,1h),4.12-4.04(m,1h),3.89-3.85(m,4h),1.45(dd,j＝9.2,7.2hz,3h),1.27-1.21(m,6h)；19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-153.30～-153.46(m,2f),-160.08～-160.32(m,1f),-162.59～-162.70(m,2f)；31pnmr(400mhz,cdcl3)δ3.95(s,1p).實(shí)施例6：化合物01的制備方法一：在0℃條件下，往化合物33(5mmol)的dmf(20ml)懸浮液中，緩慢滴加1m叔丁基氯化鎂(7.5mmol)，滴加完畢后保持在0℃反應(yīng)1h后緩慢滴加化合物21(5.75mmol，由實(shí)施例1制備得到)的thf溶液(20ml)，滴加完畢后保持在0℃反應(yīng)1h后自然升至室溫攪拌過夜。往反應(yīng)液加入20ml冰水?dāng)嚢?.5h淬滅反應(yīng)后，用乙酸乙酯(3×20ml)萃取反應(yīng)液，有機(jī)相用鹽水(20ml)洗滌后無水硫酸鈉干燥。過濾，減壓旋干溶劑后進(jìn)行柱層析(硅膠，200-300目，甲醇/二氯甲烷＝1/20)，得到白色固體01，收率58.4％。方法二：往化合物34(5mmol)的乙腈(20ml)懸浮液中依次加入dipea(10mmol)、化合物41(見合成路線二中的原料41,5mmol)，將此混合物在加熱回流下攪拌16小時后減壓旋干，殘渣加入吡啶(20ml)溶解后，再依次加入三乙胺(5ml)和化合物31(見合成路線一中的原料31,10mmol)，加熱到50℃攪拌30分鐘后在此溫度下加入三苯基膦(15mmol)和2,2’-二硫二吡啶(15mmol)，保溫在50℃攪拌3小時后減壓旋干。殘渣硅膠柱層析(甲醇/二氯甲烷洗脫)得到白色固體產(chǎn)物，收率32.6％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.47(brs,1h),7.48,7.46(s,s,1h),7.45-7.34(m,5h),6.19,6.15(s,s,1h),5.74-5.71(dd,j＝4.0hz,1h),5.11-4.96(m,3h),4.40-4.29(m,3h),4.09-4.07(m,3h),3.81-3.75(m,1h),1.30-1.29(s,s,6h),1.25-1.21(m,6h)；19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-162.02,-162.35(s,s,1f)；31pnmr(400mhz,cdcl3)δ8.72,8.67(s,s,1p).實(shí)施例7：化合物02的制備制備方法一同實(shí)施例6方法一，其中化合物21用化合物22替代。收率54.2％。制備方法二同實(shí)施例6方法二，其中化合物41用化合物42(見合成路線二中的原料42)替代。收率30.6％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.16(brs,1h),7.47,7.45(s,s,1h),7.35-7.20(m,4h),6.19,6.15(s,s,1h),5.73,5.71(dd,j＝8.0hz,1h),5.17-4.97(m,3h),4.40-4.23(m,3h),4.09-4.03(m,1h),3.95-3.73(m,3h),2.38(s,3h),1.42-1.28(m,6h),1.23-1.21(m,6h)；19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-163.94(s,1f)；31pnmr(400mhz,cdcl3)δ8.79(s,1p).實(shí)施例8：化合物03的制備制備方法一同實(shí)施例6方法一，其中化合物21用化合物23替代。收率48.3％。制備方法二同實(shí)施例6方法二，其中化合物41用化合物43(見合成路線二中的原料43)替代。收率28.9％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.90(brs,1h),7.52-7.49(m,1h),7.37-7.32(m,2h),6.99-6.89(m,2h),6.21,6.16(s,s,1h),5.75～5.47(d,d,j＝8.0hz,j＝8.0hz,1h),5.16-5.08(m,2h),5.05-4.96(m,1h),4.42-4.30(m,2h),4.09-4.07(m,1h),3.95-3.72(m,6h),1.88(brs,2h),1.42-1.34(m,6h),1.25-1.22(m,6h)；19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-162.30,-162.90(s,s,1f)；31pnmr(400mhz,cdcl3)δ8.77,8.71(s,s,1p).實(shí)施例9：化合物04的制備制備方法一同實(shí)施例6方法一，其中化合物21用化合物24替代。收率52.9％。制備方法二同實(shí)施例6方法二，其中化合物41用化合物44(見合成路線二中的原料44)替代。收率25.3％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.06(brs,1h),7.47-7.40(m,1h),7.28-7.16(m,4h),6.99-6.89(m,2h),6.18(d,j＝20hz,1h),5.71,5.45(d,d,j＝8.0hz,j＝8.0hz,1h),5.09-4.94(m,3h),4.40-4.28(m,2h),4.08-4.06(m,1h),3.95-3.72(m,3h),2.36,2.34(s,s,3h),1.43-1.22(m,12h)；19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-162.03,-162.45(s,s,1f)；31pnmr(400mhz,cdcl3)δ8.73,8.66(s,s,1p).實(shí)施例10：化合物05的制備制備方法一同實(shí)施例6方法一，其中化合物21用化合物25替代。收率57.3％。制備方法二同實(shí)施例6方法二，其中化合物41用化合物45(見合成路線二中的原料45)替代。收率22.5％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.87(brs,1h),7.55-7.52(m,1h),7.35-7.30(m,2h),6.97-6.86(m,2h),6.19(d,j＝8.0hz,1h),5.77～5.49(m,1h),5.25-5.18(m,2h),5.12-4.99(m,1h),4.57-4.45(m,2h),4.21-4.17(m,1h),3.98-3.76(m,6h),2.05(brs,2h),1.44-1.32(m,6h),1.24-1.20(m,6h)；19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-162.30,-162.90(s,s,1f)；31pnmr(400mhz,cdcl3)δ8.77,8.71(s,s,1p).實(shí)施例11：單一手性化合物的分離制備hplc反向色譜柱分離：取實(shí)施例6中化合物01經(jīng)hplc制備分離(制備柱：diamonsilc18，5μm，150x21.1mm；流動相：20％乙腈水溶液(v/v))等度洗脫后按出峰順序先后得到化合物01b和01a。hplc手性色譜柱分離：取實(shí)施例6中化合物01經(jīng)手性柱制備分離(制備柱：chiralpakad-h，0.46cmi.d.×25cml；流動相：正己烷/異丙醇＝65/35(v/v)等度洗脫后按出峰順序先后得到化合物01a和01b?；衔?1a：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.07(brs,1h),7.42-7.33(m,6h),6.19,6.15(d,j＝16hz,1h),5.46,5.44(d,j＝8.0hz,1h),5.12-4.98(m,3h),4.40,4.39(d,j＝4.0hz,2h),4.09,4.07(d,j＝8.0hz,1h),3.92-3.73(m,4h),1.39-1.33(m,6h),1.24,1.22(d,j＝8.0hz,6h)；19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-162.47(s,1f)；31pnmr(400mhz,cdcl3)δ8.70(s,1p).化合物01b：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.97(brs,1h),7.48,7.46(s,s,1h),7.42-7.36(m,5h),6.19,6.15(s,s,1h),5.74,5.72(d,j＝8.0hz,1h),5.14-4.97(m,3h),4.41-4.29(m,2h),4.14-3.73(m,5h),1.43-1.22(m,12h)；19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-162.02(s,1f)；31pnmr(400mhz,cdcl3)δ8.77(s,1p).對前藥化合物而言，最關(guān)鍵的是前藥在非靶器官系統(tǒng)中的穩(wěn)定性和在靶器官部分的代謝活性。在系統(tǒng)(如胃腸道，血液等)中穩(wěn)定性越高，在靶器官(如本發(fā)明中的肝臟等)中代謝成活性化合物的量越高，則化合物毒性越低、藥效越高。試驗例中本發(fā)明化合物、參照化合物等前藥均代謝成活性代謝物尿苷類三磷酸后發(fā)揮抗丙肝病毒作用。目前結(jié)構(gòu)相近的前藥化合物是cn101918424a(申請?zhí)枮?00880103023.8)實(shí)施例25中公布的化合物(簡稱2008年專利化合物06)、在cn102459299a(申請?zhí)枮?01080032541.2)中公布的其單一手性異構(gòu)體(簡稱2010年專利化合物06a，2010年專利化合物06b)，以及在us9156874中公布的化合物(見公開文本中的權(quán)利要求15中第39頁右欄第2、3化合物，其二者拆分前的化合物，簡稱2013年專利化合物未拆分對映體02)，這些化合物與本發(fā)明的化合物具有相同的母藥結(jié)構(gòu)2-氟-2-甲基去氧尿苷和活性代謝產(chǎn)物2-氟-2-甲基去氧尿苷三磷酸，但肝靶向片段不同。理論上本發(fā)明的化合物優(yōu)勢在于活性相當(dāng)或更高或由于在血液系統(tǒng)中結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定從而系統(tǒng)毒性更小。進(jìn)一步地相對于2008年專利化合物06而言，本發(fā)明的化合物代謝生成的苯甲酸類化合物則相對安全，克服了2008年專利化合物06釋放出毒性苯酚的缺陷，在活性優(yōu)越的同時具備更低毒性的優(yōu)勢。進(jìn)一步相對于2013年專利化合物未拆分對映體02來說，由于本發(fā)明化合物肝靶向片段中的非鄰甲基取代的芐基基團(tuán)比鄰甲基芐基更穩(wěn)定，在血液酯酶代謝中芐基脫落活性較低，因此血液中的活性母藥相對減少，肝臟中的活性代謝物相對增加，從而體現(xiàn)出更好的活性。本發(fā)明的化合物芐基脫落后毒性更小，具有更優(yōu)的系統(tǒng)穩(wěn)定性和更低的毒性，這些推測在實(shí)際研究中得到了數(shù)據(jù)支持和驗證。具體如以下所述試驗例：試驗例1：細(xì)胞水平抗hbv活性與細(xì)胞毒性對比實(shí)驗運(yùn)用丙型肝炎病毒(hcv)基因型(gt)1b穩(wěn)轉(zhuǎn)復(fù)制子(replicon)細(xì)胞株系統(tǒng)，測定化合物對hcvgt1b復(fù)制子的抑制活性，本實(shí)驗中采用化合物06a(gs-7977)作為參考化合物，監(jiān)控實(shí)驗質(zhì)量。1、化合物結(jié)構(gòu)被試化合物為本發(fā)明實(shí)施例中列舉的化合物01、03、04、05；化合物01拆分后得到的單一手性異構(gòu)體01a、01b；參照化合物為2008年專利化合物06、2010年專利化合物06a、2013年專利化合物未拆分對映體02。2、化合物稀釋：用100％dmso配制成20mm母液，對化合物dmso母液進(jìn)行稀釋并加入96孔實(shí)驗板中。dmso終濃度為0.5％。體外抗hcv活性實(shí)驗和細(xì)胞毒性實(shí)驗所有化合物起始濃度為20μm，5倍稀釋，6個濃度dmso終濃度為0.5％。3、細(xì)胞處理：在上述96孔細(xì)胞板中種入hcv-1b復(fù)制子細(xì)胞(8,000細(xì)胞/孔)，隨后置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。4、細(xì)胞活性檢測：每孔加入細(xì)胞生長熒光滴定檢測試劑，37℃、5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞1小時后，用分光光度儀檢測系統(tǒng)envision檢測fluorescence信號值，原始數(shù)據(jù)(rfu)用于化合物細(xì)胞毒性計算。5、抗hcv復(fù)制子活性檢測：每孔加熒光素酶發(fā)光底物bright-glo，5分鐘內(nèi)用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)envision檢測luminescence信號值，原始數(shù)據(jù)(rlu)用于化合物抑制活性計算。6、數(shù)據(jù)處理：使用如下公式將步驟1.3的原始數(shù)據(jù)(rfu)處理為細(xì)胞活力百分?jǐn)?shù)：使用如下公式將步驟1.4的原始數(shù)據(jù)(rlu)處理為抑制百分?jǐn)?shù)：*cpd：化合物孔的信號值；hpe(hundredpercenteffect)：100％有效作用對照孔信號值，孔中只有dmem培養(yǎng)液；zpe(zeropercenteffect)：無效作用對照孔信號值，用0.5％dmso代替化合物。將細(xì)胞活力百分?jǐn)?shù)、抑制百分?jǐn)?shù)分別導(dǎo)入graphpadprism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得出化合物對應(yīng)的曲線及其細(xì)胞毒性(cc50)和其對hcv復(fù)制子的抑制活性(ec50)數(shù)值。7、實(shí)驗結(jié)果與結(jié)論：表1：化合物抗hcv復(fù)制子活性ec50值和對hcvgt1b復(fù)制子細(xì)胞毒性cc50值本次實(shí)驗中共有6個受試化合物和3個對照化合物，實(shí)驗結(jié)果總結(jié)如下：受試化合物01和對照化合物06(2008年專利化合物06)顯示出較好的抑制hcvgt1b復(fù)制活性，ec50值在10μm級以下，化合物01活性優(yōu)于對照化合物06，受試化合物04和對照化合物02(2013年專利化合物未拆分對映體02)抑制hcvgt1b復(fù)制的活性相對較弱，ec50值在10μm-20μm之間；另外2個受試化合物03、05抑制hcvgt1b復(fù)制的活性ec50值高于最大測試濃度20μm。本發(fā)明的化合物01、03、04、05與對照化合物02、06的結(jié)構(gòu)相似，因此具有相似的藥效作用，其中化合物01抑制hcvgt1b復(fù)制的活性略優(yōu)于2008年專利化合物06和2013年專利化合物02，化合物04的活性略優(yōu)于2013年專利化合物未拆分對映體02。選取化合物01、06的單一手性對映體化合物01a、01b、06a進(jìn)行活性對比發(fā)現(xiàn)，單一手性異構(gòu)體01a抑制hcvgt1b復(fù)制的活性略優(yōu)于化合物2010年專利化合物06a。試驗例2：穩(wěn)定性研究結(jié)果下述穩(wěn)定性試驗方法按照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行，表中顯示的數(shù)據(jù)為測試條件下被試化合物在孵育不同時間段后的殘留百分比。1、模擬胃液穩(wěn)定性(測試濃度：10μm)：見表2：表2：模擬胃液穩(wěn)定性測定(測試濃度：10μm)compounds％0h％1h％2h％6h％24h0110096.81105.99100.7671.322013年專利化合物未拆分對映體0210082.7082.4574.8041.562008年專利化合物0610095.1998.4784.0849.36奧美拉唑(omeprazole20μm)1005.242.760.200.002、模擬腸液穩(wěn)定性(測試濃度：10μm)：見表3表3：模擬腸液穩(wěn)定性測定(測試濃度：10μm)compounds％0h％1h％2h％6h％24h011001.690.080.000.002013年專利化合物未拆分對映體021000.630.080.000.002008年專利化合物061000.000.000.000.00苯丁酸氮芥(chlorambucil)10043.833.910.000.003、人血漿穩(wěn)定性(測試濃度：2μm)：見表4表4：人血漿穩(wěn)定性檢測(測試濃度：2μm)4、人肝s9穩(wěn)定性參數(shù)(測試濃度：1μm)：見表5表5：人肝s9穩(wěn)定性參數(shù)(測試濃度：1μm)上述(7-ethoxycumarin)7-乙氧基香豆素、(7-hydroxycoumarin)7-羥基香豆素、(propantheline)溴丙胺太林、(chlorambucil)苯丁酸氮芥、(omeprazole)奧美拉唑等相關(guān)對照品的實(shí)驗數(shù)據(jù)可以驗證本系列實(shí)驗的有效性。穩(wěn)定性初步研究實(shí)驗數(shù)據(jù)顯示，在模擬胃液、模擬腸液和人血中的穩(wěn)定性，化合物01均高于2013年專利化合物未拆分對映體02和2008年專利化合物06。在人肝s9中，化合物01與2008年專利化合物06的穩(wěn)定性相當(dāng)，代謝成活性母藥的速率相當(dāng)，預(yù)示在肝細(xì)胞中相同濃度的化合物具有相當(dāng)?shù)幕钚浴＞C合比較，化合物01和化合物02、06相比具有更高的胃腸道和血液系統(tǒng)代謝穩(wěn)定性，從而非病灶部分藥物濃度更低，病灶部位藥物濃度更高，預(yù)示著化合物01與2013年專利化合物未拆分對映體02、2008年專利化合物06相比在體內(nèi)具有更好的肝靶向性和更低的系統(tǒng)毒性。試驗例3：體外心臟毒性研究1、實(shí)驗細(xì)胞與化合物配制實(shí)驗采用從avivabiosciences公司獲得的能穩(wěn)定表達(dá)herg鉀離子通道的cho細(xì)胞，細(xì)胞在37℃，5％co2，恒定濕度環(huán)境中孵育?；衔锖完栃詫φ栈衔锇⒚滋媪?amitriptyline，sigma-aldrich,bcbj8594v)溶解于100％二甲基亞砜(dmso)后等度稀釋，細(xì)胞外液中dmso的最終濃度不高于0.30％，保存于-20℃?zhèn)溆谩?、手動膜片鉗記錄化合物于室溫下在multiclamppatch-clampamplifier上采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)進(jìn)行測試，輸出信號采用digidata1440a/d-d/a板進(jìn)行數(shù)字化，pclamp10軟件進(jìn)行記錄控制。設(shè)置最小密封電阻為500mohms，最小特異herg電流為0.4na進(jìn)行質(zhì)量控制。3、數(shù)據(jù)分析采用clampfit(v10.2,moleculardevices)，excel2003和graphpadprism5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。電流計算公式：i/icontrol＝bottom+(top-bottom)/(1+10^((logic50-logc)*hillslope4、實(shí)驗結(jié)果與結(jié)論：見表6表6：體外心臟毒性實(shí)驗結(jié)果compoundsic50(μm)hillslopenumberofcells阿米替林(amitriptyline)3.191.18401a>30.00-201b>30.00-22010年專利化合物06a>10.00-2結(jié)論：herg實(shí)驗中化合物01a、01bic50均在10μm以上，06a的ic50在10μm以上，預(yù)示同劑量下01a、01b比2010年專利化合物06a在導(dǎo)致心臟毒性方面的安全性略優(yōu)。試驗例4：大鼠體內(nèi)代謝與組織分布實(shí)驗1、實(shí)驗動物、藥物配制方法與給藥方案18只sd大鼠(雄性，6-9周齡，購自維通利華動物中心)隨機(jī)分為6組，每組3只，給藥前先禁食12h，禁食期間自由給水，給藥4小時后禁食結(jié)束。分析天平上精密稱取50mg化合物，加入95％(0.5％cmc-na)/5％solutol水溶液混合渦旋混勻，超聲待用。給藥劑量為50mg/kg，給藥濃度10mg/ml，給藥體積為5ml/kg。2、樣品采集方案與處理方法樣品采集方案：大鼠灌胃給藥后于1h，2h，3h，6h，12h和24h取血和肝組織。血漿樣品處理方法：大鼠全血轉(zhuǎn)移到預(yù)先加入3μl0.5m的k2edta作為抗凝劑的離心ep管中后，立即取200μl全血加入到含有800μl預(yù)冷75％meoh/25％can和內(nèi)標(biāo)(v75％meoh/25％acn:vblood＝4:1)的ep管中，以沉淀蛋白、保證受試物在全血中的穩(wěn)定性。樣品渦旋振蕩2分鐘后在4℃左右、12,000rpm條件下離心15分鐘，分離75％meoh/25％acetonitrile提取物和細(xì)胞/蛋白碎片。樣品在-70℃保存，取上清液30μl，加入30μl水后渦旋混合并于4℃離心后，取上清液5μl進(jìn)樣進(jìn)行l(wèi)c/ms/ms分析。肝組織樣品處理方法：取小鼠組織樣品置于塑料ep管中，加入5倍(w:v)的1.75mlmeoh與5μl50％koh水溶液和0.75ml268mmedta溶液所配成的溶液，混合均勻后取60μl樣品，加入240μl內(nèi)標(biāo)溶液混合，渦旋振蕩2min，離心10min(13000rpm，4℃)，取30μl上清液，加入30μl水，渦旋混合并于4℃離心后，取上清液5μl進(jìn)樣進(jìn)行l(wèi)c/ms/ms分析。3、樣品分析方法采用lc-ms/ms-o(api4000)液質(zhì)聯(lián)用儀和色譜柱：acquityuplcbehc181.7μm2.1×50mm，采用tolbutamide為內(nèi)標(biāo)化合物，uplc-ms進(jìn)樣后進(jìn)行梯度洗脫分析，分別記錄內(nèi)標(biāo)、待測化合物和代謝產(chǎn)物tsl1100的保留時間和峰面積，采用軟件phoenixwinnonlin6.2.1通過srm定量檢測方法進(jìn)行分析。4、樣品分析結(jié)果與結(jié)論：見表7表7大鼠灌胃后代謝產(chǎn)物在肝組織的pk參數(shù)表7結(jié)果顯示：在全血中完全檢測不到三磷酸類活性代謝產(chǎn)物，在肝臟中檢測到有活性代謝產(chǎn)物，其pk參數(shù)如下表。結(jié)果說明此類化合物可以在肝臟有效富集轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物；驗證了其肝靶向性，預(yù)示了其抗hcv活性。試驗例選取的代表性化合物證實(shí)了本發(fā)明中的新型尿苷單磷酸酰胺類前藥化合物可以用于制備治療丙肝病毒感染性疾病的藥物。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實(shí)施方式及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁12