本發(fā)明屬于生物發(fā)酵的方法，尤其是涉及一種富含小肽的苜蓿蛋白粉制備方法。

背景技術(shù)：

植物活性肽的制備途徑有兩種：一是提取植物本身所固有各種天然活性物質(zhì)；二是通過特有的方法從植物蛋白中提取植物活性肽。但是，植物中固有的天然活性物質(zhì)很少，分離復雜，所以，一般都是從植物蛋白中分離植物活性肽。常見的從植物蛋白中分離植物活性肽的方法有酶解法、微生物發(fā)酵法、酸堿水解法等。酶解法是最常用的一種制備植物活性肽的方法，酶解法生產(chǎn)的植物活性肽安全性高，條件溫和，易控制，已經(jīng)成為制備植物活性肽的主要方法。但酶解法生產(chǎn)苜蓿肽的缺點是使用酶的成本較高，同時對酶的篩選過程較復雜，不易獲得高產(chǎn)酶。而微生物發(fā)酵法是一種新的制備植物活性肽的方法，該方法主要是利用能產(chǎn)蛋白酶的菌株對植物蛋白進行酶解得到植物活性肽。微生物發(fā)酵法制備植物活性肽的菌種來源豐富，酶產(chǎn)量較高，成本低廉，操作簡便。但同樣存在諸如菌種退化、菌株的生物安全性等缺點。而酸堿水解法是將酸或堿加入到含蛋白的水溶液中使其水解，離心得到植物活性肽。雖然該方法價格低廉，操作簡便，但是該方法中存在很大的弊端，酸水解會使l-型氨基酸受損，產(chǎn)生有毒物質(zhì)；堿水解的產(chǎn)物有移位，水解過程很難控制。

為了解決以上存在的問題，人們一直在尋求一種理想的技術(shù)解決方案。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種富含小肽的苜蓿蛋白粉制備方法，以解決上述問題。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種富含小肽的苜蓿蛋白粉制備方法，具體包括以下步驟：

菌種活化：分別提供一種白腐菌和一種啤酒酵母菌；然后分別將所述白腐菌和所述啤酒酵母菌進行活化培養(yǎng)，得到活化后的白腐菌和活化后的啤酒酵母菌；

發(fā)酵種子液的制備：分別對所述活化后的白腐菌和所述活化后的啤酒酵母菌進行擴繁培養(yǎng)，制得白腐菌擴大種子液和啤酒酵母菌擴大種子液；將所述啤酒酵母菌擴大種子液和所述白腐菌擴大種子液進行混合，制得發(fā)酵種子液；

固態(tài)發(fā)酵：將原苜蓿粉、玉米粉、糖蜜和水均勻混合，得到預混物料；向所述預混物料中加入所述發(fā)酵種子液進行發(fā)酵，制得苜蓿蛋白粗粉；

苜蓿蛋白的提?。翰捎脡A提酸沉法從所述苜蓿蛋白粗粉中提取苜蓿蛋白，制得富含小肽的苜蓿蛋白粉；

其中，所述菌種活化步驟中，所述白腐菌為糙皮側(cè)耳pleurotusostreatus，保藏編號為cgmccno.13696，菌絲體為多核，一孢內(nèi)隨機分布多達15個細胞核，菌絲一般無隔膜，也無鎖狀聯(lián)合。所述啤酒酵母菌為釀酒酵母saccharomycescerevisiae，保藏編號為cgmccno.13751，菌落為乳白色，有光澤，平坦，邊緣整齊；上述菌種均于2017年03月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，具體地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

基于上述，所述菌種活化的步驟包括：首先提供兩份pda固體培養(yǎng)基，然后分別將所述白腐菌和所述啤酒酵母菌接種于兩份所述pda固體培養(yǎng)基上并在28℃下恒溫培養(yǎng)，分別得到所述活化后的白腐菌和所述活化后的啤酒酵母菌。

基于上述，所述pda固體培養(yǎng)基的制備方法包括：首先按照質(zhì)量比為（8～10）：（1～3）：1的比例分別稱取馬鈴薯、蔗糖和瓊脂，將所述馬鈴薯洗凈去皮切塊并置于蒸餾水中進行蒸煮，經(jīng)紗布過濾后得到活化馬鈴薯泥，然后將所述蔗糖和所述瓊脂溶解于所述活化馬鈴薯泥中并進行滅菌處理，制得所述pda固體培養(yǎng)基。

基于上述，所述發(fā)酵種子液的制備步驟包括：首先按照質(zhì)量比為（8～10）：（1～3）的比例分別稱取馬鈴薯、蔗糖，將所述馬鈴薯洗凈去皮切塊并置于蒸餾水中進行蒸煮，經(jīng)紗布過濾后得到擴大培養(yǎng)馬鈴薯泥，然后將所述蔗糖溶解于所述擴大培養(yǎng)馬鈴薯泥中并進行滅菌處理，制得兩份所述pda液體培養(yǎng)基；

然后將所述活化后的白腐菌接種到一份所述pda液體培養(yǎng)基中，并在28℃、120r/min條件下震蕩培養(yǎng)80h～95h，制得所述白腐菌擴大種子液；將所述活化后的啤酒酵母菌接種于另一份所述pda液體培養(yǎng)基中，并在28℃、120r/min條件下震蕩培養(yǎng)10h～15h，制得所述啤酒酵母菌擴大種子液；最后按照體積比為（2～3）：1的比例將所述啤酒酵母菌擴大種子液和所述白腐菌擴大種子液進行混合，制得所述發(fā)酵種子液。

基于上述，所述固態(tài)發(fā)酵的步驟包括：首先將苜蓿全株粉碎并經(jīng)10目篩篩分處理制得所述原苜蓿粉，然后向所述原苜蓿粉中加水、所述玉米粉和所述糖蜜得到預混物料；按照占所述原苜蓿粉質(zhì)量5%的接種量向所述預混物料中加入所述發(fā)酵種子液，并置于28℃下進行發(fā)酵100h～130h，制得所述苜蓿蛋白粗粉；其中，所述原苜蓿粉與水的質(zhì)量比為1：（1～3），所述原苜蓿粉與所述玉米粉的質(zhì)量比為100：（0.5～2），所述原苜蓿粉與所述糖蜜的質(zhì)量比為100：（1～3）。

基于上述，所述苜蓿蛋白的提取步驟包括：按照質(zhì)量比為1：（5～10）的比例向所述苜蓿蛋白粗粉中加水并調(diào)節(jié)ph為9.0，將其放置于30℃～45℃水浴浸提處理15min～30min后，進行一次離心處理并將沉淀移除，得到一次上清液，調(diào)整所述一次上清液的ph為4.0進行二次離心處理，去除二次上清得到二次沉淀物，將所述二次沉淀物進行冷凍干燥處理，制得所述富含小肽的苜蓿蛋白粉。

本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步，具體的說，本發(fā)明所提供的一種富含小肽的苜蓿蛋白粉制備方法，采用由白腐菌和啤酒酵母菌組成的混合菌對苜蓿粉進行固態(tài)發(fā)酵，使得經(jīng)發(fā)酵后的苜蓿粉產(chǎn)生的粗蛋白質(zhì)的含量得到大幅增加，同時纖維素的含量得到降低，酸溶性肽含量增加，使其成為一種富含小肽和高蛋白含量的苜蓿蛋白粉。進一步的，在發(fā)酵過程中會同時產(chǎn)生各種消化酶、中小分子蛋白或功能肽、氨基酸、維生素、益生菌等，利于動物吸收，提高了苜蓿粉的營養(yǎng)價值和利用率。且該制備方法步驟簡單、易于操作。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供的富含小肽的苜蓿蛋白粉制備方法中的白腐菌生長曲線。

圖2為本發(fā)明提供的富含小肽的苜蓿蛋白粉制備方法中的啤酒酵母菌生長曲線。

具體實施方式

下面通過具體實施方式，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的詳細描述。

本實施例提供一種富含小肽的苜蓿蛋白粉制備方法，具體包括以下步驟：

菌種活化：分別提供一種白腐菌和一種啤酒酵母菌，所述白腐菌為糙皮側(cè)耳pleurotusostreatus，保藏編號為cgmccno.13696；所述啤酒酵母菌為釀酒酵母saccharomycescerevisiae，保藏編號為cgmccno.13751。分別稱取馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂粉20g和1000ml蒸餾水，將所述馬鈴薯洗凈去皮切塊并置于所述蒸餾水中進行蒸煮，經(jīng)8層紗布過濾后得到活化馬鈴薯泥，然后將所述蔗糖和所述瓊脂粉溶解于所述活化馬鈴薯泥中并在121℃滅菌25min，制得pda固體培養(yǎng)基，然后分別將所述白腐菌和所述啤酒酵母菌接種于所述pda固體培養(yǎng)基上并在28℃下恒溫培養(yǎng)，分別得到活化后的白腐菌和活化后的啤酒酵母菌；

發(fā)酵種子液的制備：首先分別稱取馬鈴薯200g、蔗糖20g和蒸餾水1000ml，將所述馬鈴薯洗凈去皮切塊并置于所述蒸餾水中進行蒸煮，經(jīng)8層紗布過濾后得到擴大培養(yǎng)馬鈴薯泥；將所述蔗糖溶解于所述擴大培養(yǎng)馬鈴薯泥中并在121℃滅菌25min，制得兩份pda液體培養(yǎng)基；

然后將所述活化后的白腐菌接種于一份所述pda液體培養(yǎng)基中，并在28℃、120r/min條件下震蕩培養(yǎng)90h，制得白腐菌擴大種子液；將所述活化后的啤酒酵母菌接種于另一份所述pda液體培養(yǎng)基中，并在28℃、120r/min條件下震蕩培養(yǎng)14h，制得啤酒酵母菌擴大種子液；最后按照體積比為2：1的比例將啤酒酵母菌擴大種子液和所述白腐菌擴大種子液進行混合，制得發(fā)酵種子液；

固態(tài)發(fā)酵：首先將苜蓿全株粉碎至10目制得原苜蓿粉，然后按照質(zhì)量比為1：1.52的比例向所述原苜蓿粉中加水，并加入占所述原苜蓿粉質(zhì)量的2%的玉米粉和3%的糖蜜得到預混物料，按照占所述原苜蓿粉質(zhì)量5%的接種量向所述預混物料中加入所述發(fā)酵種子液，并置于28℃下進行發(fā)酵130h，制得苜蓿蛋白粗粉；

苜蓿蛋白的提?。喊凑召|(zhì)量比為1：8的比例向所述苜蓿蛋白粗粉中加水并調(diào)節(jié)ph為9.0，將其放置于45℃水浴浸提處理30min后，進行一次離心處理并將沉淀移除，得到一次上清液，調(diào)整所述一次上清液的ph為4.0進行二次離心處理，去除二次上清得到二次沉淀物，將所述二次沉淀物進行冷凍干燥處理，制得富含小肽的苜蓿蛋白粉。

由此可見，本實施例提供的富含小肽的苜蓿蛋白粉制備方法的影響因素比較多，比如，上述發(fā)酵種子液步驟中的各工藝參數(shù)、上述固態(tài)發(fā)酵步驟中的各工藝參數(shù)和上述固態(tài)發(fā)酵步驟中的各工藝參數(shù)。下面就針對這些影響因素，對本實施例提供的富含小肽的苜蓿蛋白粉制備方法作進一步的闡述。

1、白腐菌發(fā)酵苜蓿粉的條件優(yōu)化

（1）白腐菌生長曲線的測定

首先按照本實施例中所述的活化步驟，將所述白腐菌進行活化培養(yǎng)，得到活化后的白腐菌，取適量所述活化后的白腐菌接種于所述pda液體培養(yǎng)基中，于28℃、120r/min培養(yǎng)，每隔12h取樣，過濾，65℃烘干，測定菌絲的干重，以時間為橫坐標，菌絲體的干重為縱坐標繪制白腐菌的標準曲線，具體結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出：培養(yǎng)后的白腐菌的菌絲體干重隨著時間的增長在不斷增加，在96h左右達到最高，隨后開始進入衰亡期，在20h～96h呈現(xiàn)對數(shù)增長，根據(jù)接種時間在對數(shù)期接種最好的原理，選取培養(yǎng)90h的白腐菌種子液進行接種。

（2）白腐菌固態(tài)發(fā)酵苜蓿粉條件優(yōu)化

以料水比、發(fā)酵時間、接種量及發(fā)酵溫度為因素，以發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)和真蛋白質(zhì)含量的變化為檢測指標，利用上述白腐菌對苜蓿粉固態(tài)發(fā)酵過程進行單因素試驗分析。

即分別以苜蓿粉為培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)初始苜蓿粉與水質(zhì)量比為：1：0.8、1：1.2、1：1.5和1：1.8，在其它條件保持不變的情況下進行發(fā)酵；分別選擇25℃、28℃、31℃和34℃為發(fā)酵溫度，在其它條件相同的情況下進行發(fā)酵；分別將培養(yǎng)90h的白腐菌種子液按數(shù)量級分別為105cfu/g、106cfu/g、107cfu/g和108cfu/g進行接種，在其它條件相同的情況下進行發(fā)酵；分別將發(fā)酵條件分別設定為36h、72h、108h和144h，在其它條件相同的情況下進行發(fā)酵。上述發(fā)酵結(jié)束后，分別將發(fā)酵樣品在65℃風干8h，空氣中回潮，粉碎，過40目篩，測定其粗蛋白質(zhì)和真蛋白含量。組合上述發(fā)酵因素得出，利用白腐菌對苜蓿粉進行固態(tài)發(fā)酵的工藝為料水比1：1.2，發(fā)酵時間為72h，接種量為108cfu/g，發(fā)酵溫度是28℃。

2、啤酒酵母菌發(fā)酵苜蓿粉的條件優(yōu)化

（1）啤酒酵母菌生長曲線的測定

首先按照本實施例中所述的活化步驟，將所述啤酒酵母菌進行活化培養(yǎng)，得到活化后的啤酒酵母菌，取適量所述活化后的啤酒酵母菌接種于所述pda液體培養(yǎng)基中，于28℃、120r/min培養(yǎng)，每隔3h取樣測定od600nm值，以時間為橫坐標，od600nm值為縱坐標繪制啤酒酵母的生長曲線，具體結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出：培養(yǎng)6h后的啤酒酵母菌od值快速上升，菌株進入對數(shù)期；在15h到18h中間，od值逐漸平穩(wěn)，菌株進入穩(wěn)定期，18h后進入衰亡期。因為在對數(shù)期接種相對較好，所以，選擇在14h進行接種。

（2）啤酒酵母固態(tài)發(fā)酵苜蓿粉條件優(yōu)化

在本試驗中以料水比、發(fā)酵時間、接種量及發(fā)酵溫度對啤酒酵母固態(tài)發(fā)酵苜蓿粉進行單因素試驗分析，以粗蛋白質(zhì)和真蛋白質(zhì)為檢測指標。即首先采用苜蓿粉為培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)初始料水比為：1：0.8、1：1.2、1：1.5和1：1.8，在其它條件相同的情況下進行發(fā)酵；分別選擇25℃、28℃、31℃和34℃為發(fā)酵溫度，在其它條件相同的情況下進行發(fā)酵；將培養(yǎng)好的種子液按數(shù)量級為105cfu/g、106cfu/g、107cfu/g和108cfu/g進行接種，在其它條件相同的情況下進行發(fā)酵；將發(fā)酵條件分別設定為36h、72h、108h和144h，在其它條件相同的情況下進行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后測定其粗蛋白質(zhì)和真蛋白質(zhì)的含量。根據(jù)所測粗蛋白質(zhì)和真蛋白質(zhì)含量的高低，確定各個因素的最佳試驗水平。組合上述發(fā)酵因素得出，利用啤酒酵母固態(tài)發(fā)酵苜蓿粉的工藝為料水比1：1.5，發(fā)酵時間為108h，接種量為108cfu/g，發(fā)酵溫度是28℃。

3、混合菌發(fā)酵條件優(yōu)化

根據(jù)白腐菌及啤酒酵母菌固態(tài)發(fā)酵苜蓿粉單因素試驗的結(jié)果，以兩種菌株共同發(fā)酵，選擇對發(fā)酵結(jié)果影響較大的料水比、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間為因素，每個因素取3個水平，建立回歸模型進行響應面分析設計，進一步優(yōu)化各因素的參數(shù)值。其中建立的回歸模型具體如下：

y=4.26+0.20x1+0.69x2+0.29x3-0.42x12-0.32x1x2+0.0025x1x3-0.80x22-0.31x2x3-0.59x32。

然后采用sas9.0軟件對該回歸模型進行分析，繪制料水比、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度3個因素間相互影響粗蛋白質(zhì)相對增加量的響應面圖和等高線圖觀察響應面。并對上述回歸模型求一階偏導數(shù)，整理方程組得：x1=0.0513，x2=0.4048，x3=0.101，將x1、x2、x3代入上述回歸模型，得到預測粗蛋白質(zhì)增加量最大值為4.44%，即粗蛋白質(zhì)含量為26.81%。而由x1、x2、x3整理得啤酒酵母發(fā)酵苜蓿的最佳條件為料水比1：1.52，發(fā)酵時間為122.6h，發(fā)酵溫度為28.3℃。

為了驗證上述回歸模型的有效性，對響應面優(yōu)化得到的最佳條件，即料水比1：1.52，發(fā)酵時間122.6h，發(fā)酵溫度28.3℃進行實際苜蓿粉固態(tài)發(fā)酵試驗，并重復三次，測得實際發(fā)酵后的苜蓿粉中，粗蛋白質(zhì)的含量為26.65%，與預測值26.81%接近，相對誤差為0.60%?？梢娫撃Ｐ涂梢杂行У靥岣哕俎４值鞍踪|(zhì)的含量。對采用最佳條件發(fā)酵的苜蓿粉進行纖維素的檢測，測得發(fā)酵后的苜蓿粉纖維素含量為15.73%，比未經(jīng)發(fā)酵的苜蓿纖維素含量19.30%降低了18.50%。這對于苜蓿粉粗纖維含量高，適口性差，有較好的改善。

其中需要說明的是：繪制的等高線圖的傾斜度可以確定兩者對響應值的影響程度，傾斜度越高，即坡度越陡，說明兩者交互作用越顯著。等高線圖可以直觀地反映各因素對響應值的影響，以便找出最佳工藝參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用，等高線中的最小橢圓的中心點即是響應面的最高點。此外，等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。

4、苜蓿肽的提取

采用酸提堿沉法進行苜蓿肽的提取，以料水比、堿提ph、浸提溫度、浸提時間及酸沉ph為因素，進行單因素試驗，選擇最優(yōu)條件，確定苜蓿蛋白的提取工藝。

（1）料水比

精確稱取10g苜蓿草粉，加水，使料水比分別為1：7、1：8、1：9，之后，用0.1mol/l的naoh溶液調(diào)節(jié)ph為9.0，并在溫度為45℃的水浴浸提30min，再以3500r/min離心處理30min，去除沉淀，上清液用0.1mol/l的鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph為4.0，再以3500r/min離心處理30min，去除上清液，冷凍干燥。

（2）堿提ph

精確取10g發(fā)酵好的苜蓿草粉，調(diào)節(jié)料水比為1：8，用0.1mol/l的naoh溶液調(diào)節(jié)堿提ph分別為8.0、9.0、10.0，45℃水浴浸提30min，以3500r/min離心處理30min，將沉淀移除，上清液用0.1mol/l的鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph為4.0，以3500r/min離心處理30min，去除上清液，將沉淀冷凍干燥。

（3）浸提溫度

稱取10g在上述試驗中發(fā)酵好的苜蓿草粉，調(diào)節(jié)料水比為1:8，用0.1mol/l的naoh溶液調(diào)節(jié)ph為9.0，分別調(diào)節(jié)浸提溫度為30℃、45℃、60℃的水浴對其浸提30min，浸提結(jié)束后，以3500r/min離心處理30min，將沉淀移除，上清液用0.1mol/l的鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph為4.0，再以3500r/min離心處理30min，去除上清，將沉淀冷凍干燥。

（4）浸提時間

精確取10g發(fā)酵好的苜蓿草粉，調(diào)節(jié)料水比為1：8，用0.1mol/l的naoh溶液調(diào)節(jié)ph為9.0，以45℃的水浴浸提30min，再以3500r/min離心處理30min，將沉淀移除，上清液用0.1mol/l的鹽酸溶液調(diào)節(jié)酸沉ph為4.0，3500r/min離心30min，去除上清，將沉淀冷凍干燥。

（5）酸沉ph

精確稱取10g苜蓿草粉，加水，使料水比為1：8，之后，用0.1mol/l的naoh溶液調(diào)節(jié)堿提ph為9.0，45℃水浴浸提30min，3500r/min離心30min，去除沉淀，將上清液用0.1mol/l的鹽酸溶液調(diào)節(jié)酸沉ph分別為3.0、4.0和5.0，3500r/min離心30min，去除上清，將沉淀冷凍干燥。

分別對上述步驟所提取的苜蓿肽進行基本的理化性質(zhì)測試，結(jié)果表明：在料水比為1：8，堿提ph為9.0，浸提時間為30min，浸提溫度為45℃，酸沉ph為4.0下提取得到的苜蓿肽吸油性和吸水性明顯優(yōu)于未經(jīng)發(fā)酵的樣品提取的苜蓿肽；發(fā)酵后樣品提取的苜蓿肽含有4種多肽、保留時間較長。

最后應當說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對其限制；盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解：依然可以對本發(fā)明的具體實施方式進行修改或者對部分技術(shù)特征進行等同替換；而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，其均應涵蓋在本發(fā)明請求保護的技術(shù)方案范圍當中。