本申請是分案申請，原申請的申請?zhí)枮?01410519492.5，申請日為2014年9月30日，發(fā)明名稱為“制備頭孢菌素c的發(fā)酵方法和該方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基”。
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種制備頭孢菌素c的發(fā)酵方法以及在該發(fā)酵方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
頭孢菌素c是頂頭孢霉(cephalosporiumacremonium)的代謝產(chǎn)物，是繼青霉素之后的又一重要的β-內(nèi)酰胺類抗生素，其結(jié)構(gòu)式如下：
頭孢菌素c作為頭孢類抗生素半合成的前體物質(zhì)，其生產(chǎn)水平?jīng)Q定著頭孢類抗生素的市場供應(yīng)量，對制備頭孢菌素c的發(fā)酵方法的深入研究和工藝優(yōu)化，有著重要的社會和經(jīng)濟意義。例如，優(yōu)化發(fā)酵工藝，可以提高發(fā)酵效價，進而提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。
對制備頭孢菌素c發(fā)酵水平的影響因素主要包括發(fā)酵培養(yǎng)基、菌種、過程控制等，其中菌種的生產(chǎn)能力是最顯著的影響因素，但菌種改進存在基因改造技術(shù)難度大，自然、誘變選育概率低、篩選周期長等缺陷，因此對于工業(yè)生產(chǎn)最有效的方式是最大限度地發(fā)掘已擁有菌種的生產(chǎn)能力，從發(fā)酵培養(yǎng)基和過程工藝條件、補料控制等著手。
目前國內(nèi)外采用的發(fā)酵培養(yǎng)基主要為半合成培養(yǎng)基，除了部分無機鹽外，還包括植物油、花生餅粉、淀粉、糊精和蛋氨酸等半合成有機原料，這些物料或作為碳源、或作為氮源、或作為微量元素的供應(yīng)體，或兼有以上作用。總而言之頭孢菌素c的發(fā)酵培養(yǎng)基成分復(fù)雜，如何調(diào)配這些物料最大限度地滿足頂頭孢霉菌體增殖和合成頭孢菌素c是發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的原則。
此外，在發(fā)酵培養(yǎng)頭孢菌素c的過程中，碳、氮源的補加時間和補加量對頂頭孢霉合成頭孢菌素c的速率起著重要作用。
段生兵等(“混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)頭孢菌素c過程優(yōu)化”，工業(yè)微生物，2014,44(2)：1-6)采用含有淀粉、玉米漿、糊精、蛋氨酸、尿素、硫酸銨等物質(zhì)的初始培養(yǎng)基，按照do-state混合碳源流加策略，在發(fā)酵過程中補加混合碳源(葡萄糖+豆油)，發(fā)酵190h，頭孢菌素c濃度達到36990μg/ml。
現(xiàn)有文獻報道的頭孢菌素c發(fā)酵方法發(fā)酵周期長，發(fā)酵效價不高，難以滿足工業(yè)化要求。
l-α-氨基己二酸是一種氨基酸，其與半胱氨酸、纈氨酸共同組成頭孢菌素c合成的前體物質(zhì)，它們在三肽合成酶(acv合成酶)的作用下縮合成δ-l-α-氨基己二酰-l-半胱氨酰-d-纈氨酸(lld-acv)三肽，參與到頭孢菌素c的合成途徑中，而acv合成酶是其中的限速酶。l-α-氨基己二酸對acv合成酶的影響及對最終cpc(頭孢菌素c)合成量的影響還未見報道。本發(fā)明人在制備頭孢菌素c的發(fā)酵過程中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別按一定比例添加了前體物質(zhì)之一的l-α-氨基己二酸、d-α-氨基己二酸或者d,l-α-氨基己二酸，發(fā)現(xiàn)促進了頭孢菌素c的生物合成能力，并提高了發(fā)酵效價。同時，本發(fā)明人優(yōu)化了種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成配方以及發(fā)酵工藝，使發(fā)酵效價最佳化。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
技術(shù)問題
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵效價、生產(chǎn)效率高的改進的制備頭孢菌素c的發(fā)酵方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種在所述制備頭孢菌素c的發(fā)酵方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基。
技術(shù)方案
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種制備頭孢菌素c的發(fā)酵方法，該方法包括如下步驟：
步驟1：取頂頭孢霉，經(jīng)活化后，接種至種子培養(yǎng)基中，在ph6.8～7.2、溫度27～30℃下培養(yǎng)60～80小時，制備種子，其中所述種子培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，豆餅粉25～35g/l，玉米漿14～25g/l，蔗糖23～32g/l，葡萄糖8～12g/l，碳酸鈣4～6g/l，以及豆油9～20ml/l；
步驟2：將上述步驟1制得的種子接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在ph5.2～5.8、溫度24～29℃，發(fā)酵110～150小時，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，氨基己二酸3～12g/l，花生粉25～45g/l，棉籽蛋白17～30g/l，谷朊粉30～50g/l，豆餅粉20～35g/l，玉米漿40～70ml/l，葡萄糖5～10g/l，蔗糖10～20g/l，蛋氨酸9～15g/l，硫酸銨10～20g/l，硫酸鈣12～18g/l，碳酸鈣5～9g/l，豆油70～120ml/l，以及消泡劑1～2ml/l，
且在發(fā)酵過程中，溶解氧濃度在30％以上；根據(jù)需要補加硫酸銨、豆油、消泡劑和氨水；
步驟3：將步驟2所得發(fā)酵液離心分離，取上層澄清液體，得到頭孢菌素c上清液。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在所述制備頭孢菌素c的發(fā)酵方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基，組成如下：以去離子水為介質(zhì)，氨基己二酸3～12g/l，花生粉25～45g/l，棉籽蛋白17～30g/l，谷朊粉30～50g/l，豆餅粉20～35g/l，玉米漿40～70ml/l，葡萄糖5～10g/l，蔗糖10～20g/l，蛋氨酸9～15g/l，硫酸銨10～20g/l，硫酸鈣12～18g/l，碳酸鈣5～9g/l，豆油70～120ml/l，以及消泡劑1～2ml/l。
有益效果
本發(fā)明在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入了氨基己二酸3～12g/l，同時優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成配方以及發(fā)酵工藝條件，促進頭孢菌素c的生物合成能力，并顯著提高發(fā)酵效價，頭孢菌素c效價達到38061～44837μg/ml，且不影響頭孢菌素c的質(zhì)量，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
附圖說明
圖1為發(fā)酵培養(yǎng)基中氨基己二酸的濃度與頭孢菌素c發(fā)酵效價對應(yīng)關(guān)系圖。
具體實施方式
下面，更具體地說明本發(fā)明的制備頭孢菌素c的發(fā)酵方法以及在該發(fā)酵方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基。
在本說明書中，對溫度作如下定義，由于在實驗過程中，設(shè)定一個具體的溫度，在實際操作過程中一般會浮動±0.5℃，例如25℃涵蓋了25℃±0.5℃。
根據(jù)本發(fā)明，在所述制備頭孢菌素c的發(fā)酵方法中，其中：
在所述步驟1中：
對所述頂頭孢霉不作限定，只要其通過發(fā)酵法可以產(chǎn)生頭孢菌素c即可。例如，所述頂頭孢霉可以來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(atcc)(americantypeculturecollection)，保藏號為36225。
所述頂頭孢霉進行斜面培養(yǎng)活化，斜面培養(yǎng)基組成為：以去離子水為介質(zhì)，麥芽汁10～15g/l，蛋白胨10～15g/l，以及瓊脂22g/l，消前ph為7.0～7.4；斜面培養(yǎng)方法為：在27℃～29℃，相對濕度40％～65％下，培養(yǎng)11～13天。
所述頂頭孢霉經(jīng)斜面培養(yǎng)活化后，使用無菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌懸液，接入至種子培養(yǎng)基中，在ph6.8～7.2、溫度27～30℃下培養(yǎng)60～80小時，制備種子液，其中所述種子培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，豆餅粉25～35g/l，玉米漿14～25g/l，蔗糖23～32g/l，葡萄糖8～12g/l，碳酸鈣4～6g/l，以及豆油9～20ml/l。
在所述步驟2中：
取上述步驟1制得的種子液，菌絲濃度為16％～22％，按照15％～20％(v/v)的接種比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在ph5.2～5.8、溫度24～29℃，發(fā)酵110～150小時，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，氨基己二酸3～12g/l，花生粉25～45g/l，棉籽蛋白17～30g/l，谷朊粉30～50g/l，豆餅粉20～35g/l，玉米漿40～70ml/l，葡萄糖5～10g/l，蔗糖10～20g/l，蛋氨酸9～15g/l，硫酸銨10～20g/l，硫酸鈣12～18g/l，碳酸鈣5～9g/l，豆油70～120ml/l，以及消泡劑1～2ml/l，
且在發(fā)酵過程中，溶解氧濃度在30％以上；根據(jù)需要補加硫酸銨、豆油、消泡劑和氨水。
在所述步驟2中，所述氨基己二酸可以為l-α-氨基己二酸、d-α-氨基己二酸或者l,d-α-氨基己二酸。根據(jù)實驗，圖1示出了發(fā)酵培養(yǎng)基中氨基己二酸的濃度與頭孢菌素c發(fā)酵效價對應(yīng)關(guān)系圖，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，氨基己二酸的濃度為3～12g/l，且優(yōu)選為5～10g/l，最優(yōu)選為5～6g/l。
在所述步驟2中，所述消泡劑可以為聚丙二醇(ppg)2000。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：以去離子水為介質(zhì)，氨基己二酸5～10g/l，花生粉28～40g/l，棉籽蛋白20～30g/l，谷朊粉32～45g/l，豆餅粉24～32g/l，玉米漿40～65ml/l，葡萄糖5.5～10g/l，蔗糖12～19g/l，蛋氨酸9～14g/l，硫酸銨11～19g/l，硫酸鈣14～18g/l，碳酸鈣5.5～8g/l，豆油75～115ml/l，以及ppg20001～2ml/l。
進一步優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：以去離子水為介質(zhì)，氨基己二酸5g/l，花生粉28g/l，棉籽蛋白20g/l，谷朊粉32g/l，豆餅粉24g/l，玉米漿40ml/l，葡萄糖6g/l，蔗糖13g/l，蛋氨酸10g/l，硫酸銨11g/l，硫酸鈣14g/l，碳酸鈣5.5g/l，豆油75ml/l，以及ppg20001ml/l。
在發(fā)酵過程中，根據(jù)需要補加硫酸銨、豆油、消泡劑和氨水。更具體地，在發(fā)酵40～70h之間，以0.1～0.3g/l/h的速率補加硫酸銨，70h后停止補加硫酸銨；
在發(fā)酵50～120h之間，以2～5g/l/h的速率補加豆油，120h后停止補加豆油；
在發(fā)酵120～145h之間補加ppg2000進行消泡處理，補加量為0.03～0.06g/l泡沫發(fā)酵液總量，以消除泡沫；
在發(fā)酵過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph為7.2～7.4，隨著發(fā)酵進行發(fā)酵液ph逐漸下降，至5.8～5.2時，開啟ph自控設(shè)備，用氨水以控制ph為5.2～5.8，所用氨水濃度優(yōu)選為18％～22％(w/v)。
在所述步驟2中，發(fā)酵時間為110～150小時，優(yōu)選為130～150小時，最優(yōu)選為145小時；在發(fā)酵30～45h前，發(fā)酵溫度為27℃～29℃，在發(fā)酵30～45h后，發(fā)酵溫度為24℃～26℃。
在所述步驟3中，在發(fā)酵完成后，將步驟2所得發(fā)酵液進行離心分離，得到頭孢菌素c上清液。
下面通過實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護范圍不局限于這些實施例中。
在下面實施例中，
菌絲濃度測定：取10ml發(fā)酵液于10ml離心管中，4000r/min離心20min，計算固形物體積占發(fā)酵液總體積的比例。
頭孢菌素c效價測定：采用hplc法，色譜柱：odsc184.6×150mm，5μm；流動相：1.0g磷酸二氫鈉于1000ml甲醇、乙腈和水(按體積140:40:850)的混合液中，混合溶解，用四丁基氫氧化銨調(diào)ph至7.0，并用0.45μm微孔濾膜過濾，得到的濾液為流動相；流速：1.0ml/min，紫外檢測波長：254nm，室溫，進樣量20μl。頭孢菌素c的純度以頭孢菌素c液相峰面積占總面積的百分比計。
頂頭孢霉來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(atcc)(americantypeculturecollection)，保藏號為36225。
實施例1
發(fā)酵培養(yǎng)基
組成如下：d-α-氨基己二酸7g/l；花生粉35g/l；棉籽蛋白22g/l；谷朊粉45g/l；豆餅粉24g/l；玉米漿48ml/l；葡萄糖7g/l；蔗糖12g/l；蛋氨酸11g/l；硫酸銨13g/l；硫酸鈣14g/l；碳酸鈣7g/l；豆油105ml/l；以及ppg20001ml/l。
制備：將谷朊粉與豆油混合溶解，其他原料以去離子水為溶劑溶解，溶解后混合定容于發(fā)酵罐中，用20％(w/v)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始ph為7.2～7.4(在發(fā)酵時，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液ph逐漸下降至5.2～5.8)。
制備頭孢菌素c的發(fā)酵
步驟1：
取頂頭孢霉進行斜面培養(yǎng)活化，斜面培養(yǎng)基組成為：以去離子水為介質(zhì)，麥芽汁12g/l，蛋白胨12g/l，以及瓊脂22g/l，消前ph為7.0；斜面培養(yǎng)方法為：在28℃，相對濕度40％～65％下，培養(yǎng)12天；
所述頂頭孢霉經(jīng)斜面培養(yǎng)活化后，使用無菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌懸液，接入種子培養(yǎng)基中，在ph7.2、溫度28℃下培養(yǎng)68小時，制備種子液，其中所述種子培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，豆餅粉30g/l，玉米漿15g/l，蔗糖25g/l，葡萄糖10g/l，碳酸鈣5g/l，以及豆油10ml/l。
步驟2：
取步驟1制備的種子液，菌絲濃度為18％～20％，按照15％(v/v)的接種比例接種至上述制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵145h；在0～40h時發(fā)酵溫度為28℃，40h后控制為25℃；在發(fā)酵階段發(fā)酵液ph逐漸下降至5.3，且在發(fā)酵過程中補加氨水、硫酸銨、豆油和ppg2000；
氨水補加：在發(fā)酵液ph下降至5.3，開啟ph自控系統(tǒng)，通過補加氨水溶液(20％，w/v)維持ph5.3，直至發(fā)酵結(jié)束；
硫酸銨補加：在發(fā)酵40～70h之間，以0.1g/l/h(以純硫酸銨計)的速率補加硫酸銨溶液(20％，w/v)，70h后停止補加硫酸銨；
豆油補加：在發(fā)酵50～120h之間，以3g/l/h的速率補加豆油，120h后停止補加豆油；
消泡劑補加：在發(fā)酵120～145h之間，補加ppg2000進行消泡處理，補加量為0.03g/l泡沫發(fā)酵液總量，以消除泡沫；
整個發(fā)酵過程溶解氧濃度控制30％以上。
步驟3：
在發(fā)酵結(jié)束后，將所得的發(fā)酵液4000rpm離心20min后所得上清液即為頭孢菌素c溶液。
同時，按照上述方法，檢測菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c的純度，結(jié)果示于下面表1中。
表1實施例1的菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c檢測結(jié)果
實施例2
發(fā)酵培養(yǎng)基
組成如下：l-α-氨基己二酸12g/l；花生粉45g/l；棉籽蛋白30g/l；谷朊粉50g/l；豆餅粉35g/l；玉米漿70ml/l；葡萄糖10g/l；蔗糖20g/l；蛋氨酸15g/l；硫酸銨20g/l；硫酸鈣18g/l；碳酸鈣9g/l；豆油120ml/l；以及ppg20002ml/l。
制備：將谷朊粉與豆油混合溶解，其他原料以去離子水為溶劑溶解，溶解后混合定容于發(fā)酵罐中，用20％(w/v)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始ph為7.2～7.4。
制備頭孢菌素c的發(fā)酵
步驟1：
取頂頭孢霉進行斜面培養(yǎng)活化，斜面培養(yǎng)基組成為：以去離子水為介質(zhì)，麥芽汁12g/l，蛋白胨10g/l，以及瓊脂22g/l，消前ph為7.2；斜面培養(yǎng)方法為：在27℃，相對濕度40％～65％下，培養(yǎng)12天；
所述頂頭孢霉經(jīng)斜面培養(yǎng)活化后，使用無菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌懸液，接入種子培養(yǎng)基中，在ph7.0、溫度28℃下培養(yǎng)72小時，制備種子，其中所述種子培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，豆餅粉25g/l，玉米漿20g/l，蔗糖28g/l，葡萄糖8g/l，碳酸鈣6g/l，以及豆油15ml/l。
步驟2：
取步驟1制備的種子液，菌絲濃度為16％～18％，按照18％(v/v)的接種量接種至上述制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵145h；在0～45h時發(fā)酵溫度為28℃，45h后控制為25℃；在發(fā)酵階段發(fā)酵液ph逐漸下降至5.5，且在發(fā)酵過程中補加氨水、硫酸銨、豆油和ppg2000；
氨水補加：在發(fā)酵液ph下降至5.5，開啟ph自控系統(tǒng)，通過補加氨水溶液(20％，w/v)維持ph5.5，直至發(fā)酵結(jié)束；
硫酸銨補加：在發(fā)酵40～70h之間，以0.2g/l/h(以純硫酸銨計)的速率補加硫酸銨溶液(20％，w/v)，70h后停止補加硫酸銨；
豆油補加：在發(fā)酵50～120h之間，以2g/l/h的速率補加豆油，120h后停止補加豆油；
消泡劑補加：在發(fā)酵120～145h之間，補加ppg2000進行消泡處理，補加量為0.04g/l泡沫發(fā)酵液總量，以消除泡沫；
整個發(fā)酵過程溶氧濃度控制30％以上。
步驟3：
在發(fā)酵結(jié)束后，將所得的發(fā)酵液4000rpm離心20min后所得上清液即為頭孢菌素c溶液。
同時，按照上述方法，檢測菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c的純度，結(jié)果示于下面表2中。
表2實施例2的菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c檢測結(jié)果
實施例3
發(fā)酵培養(yǎng)基
組成如下：d-α-氨基己二酸10g/l；花生粉40g/l；棉籽蛋白25g/l；谷朊粉45g/l；豆餅粉32g/l；玉米漿65ml/l；葡萄糖9g/l；蔗糖19g/l；蛋氨酸14g/l；硫酸銨19g/l；硫酸鈣17g/l；碳酸鈣8g/l；豆油115ml/l；以及ppg20001.5ml/l。
制備：將谷朊粉與豆油混合溶解，其他原料以去離子水為溶劑溶解，溶解后混合定容于發(fā)酵罐中，用20％(w/v)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始ph為7.2～7.4。
制備頭孢菌素c的發(fā)酵
步驟1：
取頂頭孢霉進行斜面培養(yǎng)活化，斜面培養(yǎng)基組成為：以去離子水為介質(zhì)，麥芽汁10g/l，蛋白胨10g/l，以及瓊脂22g/l，消前ph為7.4；斜面培養(yǎng)方法為：在29℃，相對濕度40％～65％下，培養(yǎng)11天；
所述頂頭孢霉經(jīng)斜面培養(yǎng)活化后，使用無菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌懸液，接入種子培養(yǎng)基中，在ph7.0、溫度29℃下培養(yǎng)72小時，制備種子，其中所述種子培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，豆餅粉30g/l，玉米漿20g/l，蔗糖30g/l，葡萄糖10g/l，碳酸鈣5g/l，以及豆油10ml/l。
步驟2：
取步驟1制備的種子液，菌絲濃度為18％～20％，按照15％(v/v)的接種比例接種至上述制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵145h；在0～35h時發(fā)酵溫度為28℃，35h后控制為25℃；在發(fā)酵階段發(fā)酵液ph逐漸下降至5.3，且在發(fā)酵過程中補加氨水、硫酸銨、豆油和ppg2000；
氨水補加：在發(fā)酵液ph下降至5.3，開啟ph自控系統(tǒng)，通過補加氨水溶液(20％，w/v)維持ph5.3，直至發(fā)酵結(jié)束；
硫酸銨補加：在發(fā)酵40～70h之間，以0.2g/l/h(以純硫酸銨計)的速率補加硫酸銨溶液(20％，w/v)，70h后停止補加硫酸銨；
豆油補加：在發(fā)酵50～120h之間，以4g/l/h的速率補加豆油，120h后停止補加豆油；
消泡劑補加：在發(fā)酵120～145h之間，補加ppg2000進行消泡處理，補加量為0.04g/l泡沫發(fā)酵液總量，以消除泡沫；
整個發(fā)酵過程溶氧濃度控制30％以上。
步驟3：
在發(fā)酵結(jié)束后，將所得的發(fā)酵液4000rpm離心20min后所得上清液即為頭孢菌素c溶液。
同時，按照上述方法，檢測菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c的純度，結(jié)果示于下面表3中。
表3實施例3的菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c檢測結(jié)果
實施例4
發(fā)酵培養(yǎng)基
組成如下：l-α-氨基己二酸5g/l；花生粉28g/l；棉籽蛋白20g/l；谷朊粉32g/l；豆餅粉24g/l；玉米漿40ml/l；葡萄糖6g/l；蔗糖13g/l；蛋氨酸10g/l；硫酸銨11g/l；硫酸鈣14g/l；碳酸鈣5.5g/l；豆油75ml/l；以及ppg20001ml/l。
制備：將谷朊粉與豆油混合溶解，其他原料以去離子水為溶劑溶解，溶解后混合定容于發(fā)酵罐中，用20％(w/v)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始ph為7.2～7.4。
制備頭孢菌素c的發(fā)酵
步驟1：
取頂頭孢霉進行斜面培養(yǎng)活化，斜面培養(yǎng)基組成為：以去離子水為介質(zhì)，麥芽汁15g/l，蛋白胨15g/l，以及瓊脂22g/l，消前ph為7.4；斜面培養(yǎng)方法為：在28℃，相對濕度40％～65％下，培養(yǎng)12天；
所述頂頭孢霉經(jīng)斜面培養(yǎng)活化后，使用無菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌懸液，接入種子培養(yǎng)基中，在ph7.0、溫度30℃下培養(yǎng)64小時，制備種子，其中所述種子培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，豆餅粉35g/l，玉米漿25g/l，蔗糖32g/l，葡萄糖12g/l，碳酸鈣4g/l，以及豆油20ml/l。
步驟2：
取步驟1制備的種子，菌液濃度為20％～22％，按照15％(v/v)的接種量接種至上述制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵145h；在0～30h時發(fā)酵溫度為28℃，30h后控制為25℃；在發(fā)酵階段發(fā)酵液ph逐漸下降至5.5，且在發(fā)酵過程中補加氨水、硫酸銨、豆油和ppg2000；
氨水補加：在發(fā)酵液ph下降至5.5，開啟ph自控系統(tǒng)，通過補加氨水溶液(20％，w/v)維持ph5.5，直至發(fā)酵結(jié)束；
硫酸銨補加：在發(fā)酵40～70h之間，以0.3g/l/h(以純硫酸銨計)的速率補加硫酸銨溶液(20％，w/v)，70h后停止補加硫酸銨；
豆油補加：在發(fā)酵50～120h之間，以5g/l/h的速率補加豆油，120h后停止補加豆油；
消泡劑補加：在發(fā)酵120～145h之間，補加ppg2000進行消泡處理，補加量為0.03g/l泡沫發(fā)酵液總量，以消除泡沫；
整個發(fā)酵過程溶氧濃度控制30％以上。
步驟3：
在發(fā)酵結(jié)束后，將所得的發(fā)酵液4000rpm離心20min后所得上清液即為頭孢菌素c溶液。
同時，按照上述方法，檢測菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c的純度，結(jié)果示于下面表4中。
表4實施例4的菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c檢測結(jié)果
實施例5
發(fā)酵培養(yǎng)基
組成如下：l-α-氨基己二酸8g/l；花生粉35g/l；棉籽蛋白20g/l；谷朊粉35g/l；豆餅粉29g/l；玉米漿53ml/l；葡萄糖8g/l；蔗糖15g/l；蛋氨酸12g/l；硫酸銨15g/l；硫酸鈣18g/l；碳酸鈣7g/l；豆油100ml/l；以及ppg20001.5ml/l。
制備：將谷朊粉與豆油混合溶解，其他原料以去離子水為溶劑溶解，溶解后混合定容于發(fā)酵罐中，用20％(w/v)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始ph為7.2～7.4。
制備頭孢菌素c的發(fā)酵
步驟1：
取頂頭孢霉進行斜面培養(yǎng)活化，斜面培養(yǎng)基組成為：以去離子水為介質(zhì)，麥芽汁12g/l，蛋白胨15g/l，以及瓊脂22g/l，消前ph為7.3；斜面培養(yǎng)方法為：在27℃，相對濕度40％～65％下，培養(yǎng)12天；
所述頂頭孢霉經(jīng)斜面培養(yǎng)活化后，使用無菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌懸液，接入種子培養(yǎng)基中，在ph6.8、溫度28℃下培養(yǎng)78小時，制備種子，其中所述種子培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，豆餅粉30g/l，玉米漿25g/l，蔗糖28g/l，葡萄糖10g/l，碳酸鈣5g/l，以及豆油15ml/l。
步驟2：
取步驟1制備的種子，菌液濃度為16％～18％，按照20％(v/v)的接種比例接種至上述制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵145h；在0～30h時發(fā)酵溫度為29℃，30h后控制為26℃；在發(fā)酵階段發(fā)酵液ph逐漸下降至5.5，且在發(fā)酵過程中補加氨水、硫酸銨、豆油和ppg2000；
氨水補加：在發(fā)酵液ph下降至5.5，開啟ph自控系統(tǒng)，通過補加氨水溶液(20％，w/v)維持ph5.5，直至發(fā)酵結(jié)束；
硫酸銨補加：在發(fā)酵40～70h之間，以0.1g/l/h(以純硫酸銨計)的速率補加硫酸銨溶液(20％，w/v)，70h后停止補加硫酸銨；
豆油補加：在發(fā)酵50～120h之間，以4g/l/h的速率補加豆油，120h后停止補加豆油；
消泡劑補加：在發(fā)酵120～145h之間，補加ppg2000進行消泡處理，補加量為0.05g/l泡沫發(fā)酵液總量，以消除泡沫；
整個發(fā)酵過程溶氧濃度控制30％以上。
步驟3：
在發(fā)酵結(jié)束后，將所得的發(fā)酵液4000rpm離心20min后所得上清液即為頭孢菌素c溶液。
同時，按照上述方法，檢測菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c的純度，結(jié)果示于下面表5中。
表5實施例5的菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c檢測結(jié)果
實施例6
發(fā)酵培養(yǎng)基
組成如下：d-α-氨基己二酸6g/l；花生粉30g/l；棉籽蛋白25g/l；谷朊粉40g/l；豆餅粉32g/l；玉米漿59ml/l；葡萄糖5.5g/l；蔗糖17g/l；蛋氨酸13g/l；硫酸銨17g/l；硫酸鈣15g/l；碳酸鈣5.5g/l；豆油115ml/l；以及ppg20002ml/l。
制備：將谷朊粉與豆油混合溶解，其他原料以去離子水為溶劑溶解，溶解后混合定容于發(fā)酵罐中，用20％(w/v)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始ph為7.2～7.4。
制備頭孢菌素c的發(fā)酵
步驟1：
取頂頭孢霉進行斜面培養(yǎng)活化，斜面培養(yǎng)基組成為：以去離子水為介質(zhì)，麥芽汁10g/l，蛋白胨12g/l，以及瓊脂22g/l，消前ph為7.2；斜面培養(yǎng)方法為：在28℃，相對濕度40％～65％下，培養(yǎng)13天；
所述頂頭孢霉經(jīng)斜面培養(yǎng)活化后，使用無菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌懸液，接入種子培養(yǎng)基中，在ph7.2、溫度30℃下培養(yǎng)68小時，制備種子，其中所述種子培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，豆餅粉25g/l，玉米漿15g/l，蔗糖30g/l，葡萄糖12g/l，碳酸鈣4g/l，以及豆油20ml/l。
步驟2：
取步驟1制備的種子，菌液濃度為18％～20％，按照18％(v/v)的接種比例接種至上述制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵145h；在0～40h時發(fā)酵溫度為29℃，40h后控制為24℃；在發(fā)酵階段發(fā)酵液ph逐漸下降至5.3，且在發(fā)酵過程中補加氨水、硫酸銨、豆油和ppg2000；
氨水補加：在發(fā)酵液ph下降至5.3，開啟ph自控系統(tǒng)，通過補加氨水溶液(20％，w/v)維持ph5.3，直至發(fā)酵結(jié)束；
硫酸銨補加：在發(fā)酵40～70h之間，以0.2g/l/h(以純硫酸銨計)的速率補加硫酸銨溶液(20％，w/v)，70h后停止補加硫酸銨；
豆油補加：在發(fā)酵50～120h之間，以3g/l/h的速率補加豆油，120h后停止補加豆油；
消泡劑補加：在發(fā)酵120～145h之間，補加ppg2000進行消泡處理，補加量為0.04g/l泡沫發(fā)酵液總量，以消除泡沫；
整個發(fā)酵過程溶氧濃度控制30％以上。
步驟3：
在發(fā)酵結(jié)束后，將所得的發(fā)酵液4000rpm離心20min后所得上清液即為頭孢菌素c溶液。
同時，按照上述方法，檢測菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c的純度，結(jié)果示于下面表6中。
表6實施例6的菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c檢測結(jié)果
實施例7
發(fā)酵培養(yǎng)基
組成如下：dl-α-氨基己二酸3g/l；花生粉25g/l；棉籽蛋白17g/l；谷朊粉30g/l；豆餅粉20g/l；玉米漿40ml/l；葡萄糖5g/l；蔗糖10g/l；蛋氨酸9g/l；硫酸銨10g/l；硫酸鈣12g/l；碳酸鈣5g/l；豆油70ml/l；以及ppg20001ml/l。
制備：將谷朊粉與豆油混合溶解，其他原料以去離子水為溶劑溶解，溶解后混合定容于發(fā)酵罐中，用20％(w/v)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始ph為7.2～7.4。
制備頭孢菌素c的發(fā)酵
步驟1：
取頂頭孢霉進行斜面培養(yǎng)活化，斜面培養(yǎng)基組成為：以去離子水為介質(zhì)，麥芽汁15g/l，蛋白胨12g/l，以及瓊脂22g/l，消前ph為7.3；斜面培養(yǎng)方法為：在29℃，相對濕度40％～65％下，培養(yǎng)11天；
所述頂頭孢霉經(jīng)斜面培養(yǎng)活化后，使用無菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌懸液，接入種子培養(yǎng)基中，在ph6.8、溫度30℃下培養(yǎng)72小時，制備種子，其中所述種子培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，豆餅粉35g/l，玉米漿20g/l，蔗糖28g/l，葡萄糖8g/l，碳酸鈣5g/l，以及豆油15ml/l。
步驟2：
取步驟1制備的種子，菌液濃度為16％～18％，按照20％(v/v)的接種量接種至上述制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵145h；在0～35h時發(fā)酵溫度為27℃，35h后控制為25℃；在發(fā)酵階段發(fā)酵液ph逐漸下降至5.8，且在發(fā)酵過程中補加氨水、硫酸銨、豆油和ppg2000；
氨水補加：在發(fā)酵液ph下降至5.8，開啟ph自控系統(tǒng)，通過補加氨水溶液(20％，w/v)維持ph5.8，直至發(fā)酵結(jié)束；
硫酸銨補加：在發(fā)酵40～70h之間，以0.3g/l/h(以純硫酸銨計)的速率補加硫酸銨溶液(20％，w/v)，70h后停止補加硫酸銨；
豆油補加：在發(fā)酵50～120h之間，以4g/l/h的速率補加豆油，120h后停止補加豆油；
消泡劑補加：在發(fā)酵120～145h之間，補加ppg2000進行消泡處理，補加量為0.03g/l泡沫發(fā)酵液總量，以消除泡沫；
整個發(fā)酵過程溶氧濃度控制30％以上。
步驟3：
在發(fā)酵結(jié)束后，將所得的發(fā)酵液4000rpm離心20min后所得上清液即為頭孢菌素c溶液。
同時，按照上述方法，檢測菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c的純度，結(jié)果示于下面表7中。
表7實施例7的菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c檢測結(jié)果
實施例8
發(fā)酵培養(yǎng)基
組成如下：l-α-氨基己二酸6g/l；花生粉28g/l；棉籽蛋白30g/l；谷朊粉45g/l；豆餅粉29g/l；玉米漿45ml/l；葡萄糖6g/l；蔗糖13g/l；蛋氨酸13g/l；硫酸銨13g/l；硫酸鈣16g/l；碳酸鈣7.5g/l；豆油95ml/l；以及ppg20001ml/l。
制備：將谷朊粉與豆油混合溶解，其他原料以去離子水為溶劑溶解，溶解后混合定容于發(fā)酵罐中，用20％(w/v)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始ph為7.2～7.4。
制備頭孢菌素c的發(fā)酵
步驟1：
取頂頭孢霉進行斜面培養(yǎng)活化，斜面培養(yǎng)基組成為：以去離子水為介質(zhì)，麥芽汁12g/l，蛋白胨12g/l，以及瓊脂22g/l，消前ph為7.4；斜面培養(yǎng)方法為：在29℃，相對濕度40％～65％下，培養(yǎng)11天；
所述頂頭孢霉經(jīng)斜面培養(yǎng)活化后，使用無菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌懸液，接入種子培養(yǎng)基中，在ph7.2、溫度29℃下培養(yǎng)78小時，制備種子，其中所述種子培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，豆餅粉30g/l，玉米漿25g/l，蔗糖28g/l，葡萄糖10g/l，碳酸鈣5g/l，以及豆油15ml/l。
步驟2：
取步驟1制備的種子，菌液濃度為18％～20％，按照20％(v/v)的接種量接種至上述制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵145h；在0～45h時發(fā)酵溫度為28℃，45h后控制為26℃；在發(fā)酵階段發(fā)酵液ph逐漸下降至5.5，且在發(fā)酵過程中補加氨水、硫酸銨、豆油和ppg2000；
氨水補加：在發(fā)酵液ph下降至5.5，開啟ph自控系統(tǒng)，通過補加氨水溶液(20％，w/v)維持ph5.5，直至發(fā)酵結(jié)束；
硫酸銨補加：在發(fā)酵40～70h之間，以0.2g/l/h(以純硫酸銨計)的速率補加硫酸銨溶液(20％，w/v)，70h后停止補加硫酸銨；
豆油補加：在發(fā)酵50～120h之間，以3g/l/h的速率補加豆油，120h后停止補加豆油；
消泡劑補加：在發(fā)酵120～145h之間，補加ppg2000進行消泡處理，補加量為0.06g/l泡沫發(fā)酵液總量，以消除泡沫；
整個發(fā)酵過程溶氧濃度控制30％以上。
步驟3：
在發(fā)酵結(jié)束后，將所得的發(fā)酵液4000rpm離心20min后所得上清液即為頭孢菌素c溶液。
同時，按照上述方法，檢測菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c的純度，結(jié)果示于下面表8中。
表8實施例8的菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c檢測結(jié)果
實施例9
發(fā)酵培養(yǎng)基
組成如下：d-α-氨基己二酸7g/l；花生粉40g/l；棉籽蛋白27g/l；谷朊粉32g/l；豆餅粉32g/l；玉米漿59ml/l；葡萄糖10g/l；蔗糖19g/l；蛋氨酸9g/l；硫酸銨19g/l；硫酸鈣15g/l；碳酸鈣8g/l；豆油95ml/l；以及ppg20001.5ml/l。
制備：將谷朊粉與豆油混合溶解，其他原料以去離子水為溶劑溶解，溶解后混合定容于發(fā)酵罐中，用20％(w/v)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始ph為7.2～7.4。
制備頭孢菌素c的發(fā)酵
步驟1：
取頂頭孢霉進行斜面培養(yǎng)活化，斜面培養(yǎng)基組成為：以去離子水為介質(zhì)，麥芽汁10g/l，蛋白胨15g/l，以及瓊脂22g/l，消前ph為7.0；斜面培養(yǎng)方法為：在28℃，相對濕度40％～65％下，培養(yǎng)12天；
所述頂頭孢霉經(jīng)斜面培養(yǎng)活化后，使用無菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌懸液，接入種子培養(yǎng)基中，在ph7.0、溫度28℃下培養(yǎng)72小時，制備種子，其中所述種子培養(yǎng)基組成如下：
以去離子水為介質(zhì)，豆餅粉35g/l，玉米漿15g/l，蔗糖25g/l，葡萄糖8g/l，碳酸鈣5g/l，以及豆油15ml/l。
步驟2：
取步驟1制備的種子，菌液濃度為18％～20％，按照15％(v/v)的接種量接種至上述制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵145h；在0～35h時發(fā)酵溫度為28℃，35h后控制為26℃，此階段發(fā)酵液ph逐漸下降至5.8，且在發(fā)酵過程中補加氨水、硫酸銨、豆油和ppg2000；
氨水補加：在發(fā)酵液ph下降至5.8，開啟ph自控系統(tǒng)，通過補加氨水溶液(20％，w/v)維持ph5.8，直至發(fā)酵結(jié)束；
硫酸銨補加：在發(fā)酵40～70h之間，以0.3g/l/h(以純硫酸銨計)的速率補加硫酸銨溶液(20％，w/v)，70h后停止補加硫酸銨；
豆油補加：在發(fā)酵50～120h之間，以2g/l/h的速率補加豆油，120h后停止補加豆油；
消泡劑補加：在發(fā)酵120～145h之間，補加ppg2000進行消泡處理，補加量為0.03g/l泡沫發(fā)酵液總量，以消除泡沫；
整個發(fā)酵過程溶氧濃度控制30％以上。
步驟3：
在發(fā)酵結(jié)束后，將所得的發(fā)酵液4000rpm離心20min后所得上清液即為頭孢菌素c溶液。
同時，按照上述方法，檢測菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c的純度，結(jié)果示于下面表9中。
表9實施例9的菌絲濃度、頭孢菌素c效價和頭孢菌素c檢測結(jié)果
實施例1～實施例9培養(yǎng)基組成、過程補料及發(fā)酵結(jié)果統(tǒng)計見表10。
按照本發(fā)明提供的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，發(fā)酵145h發(fā)酵效價可以達到38061～44837μg/ml，較現(xiàn)有報道方法制備的頭孢菌素c效價增長顯著。在優(yōu)選范圍內(nèi)，發(fā)酵145h發(fā)酵效價可以達到40228～44837μg/ml。在最佳培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)條件下，發(fā)酵145h發(fā)酵效價可以達到44837μg/ml，較文獻報道(190h，發(fā)酵效價36990μg/ml)提高了21.21％。
通過對優(yōu)選范圍內(nèi)實施例的對比發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵效價的高低與氨基己二酸的加量多少有一定關(guān)系(見圖1)，而與其他物料無直接對應(yīng)關(guān)系。
綜合來看，本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基及對應(yīng)的培養(yǎng)方法能顯著提高頂頭孢霉合成頭孢菌素c的能力，且不影響頭孢菌素c的質(zhì)量，具有工業(yè)應(yīng)用價值。