本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及一種新的環(huán)狀hsa_circrna_400031的應用。

背景技術：

肝臟是身體內極其重要的代謝器官，其功能的失調會影響機體正常的新陳代謝和內環(huán)境的變化。原發(fā)性肝癌(primarylivercancer，plc)是一類發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，一般由化學致癌物或環(huán)境因素引發(fā)的慢性肝病或肝硬化發(fā)展而來，但是目前發(fā)病機制還未闡明，病理診斷和治療手段有一定的局限性。同種異體肝移植是目前治療plc最徹底、有效的方法，但如何提高供肝利用率和受者生存率一直也是醫(yī)療界所面臨的問題。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)用于plc早期診斷以及治療作用評估的新生物標記物。

近年來，隨著分子生物學基因芯片技術的發(fā)展，越來越多的研究者利用該技術探索了各類生物小分子與疾病的關系，而環(huán)狀rna(circularrna,circrna)是目前研究重大疾病分子機理的熱點。circrna是一類保守性好、特異性高，對靶基因能發(fā)揮調控作用的內源性非編碼rna。因此篩選出具有差異表達的circrna作為疾病相關的生物標志物，并對其進行功能研究，可以更好地了解疾病發(fā)生的分子機制，進而提高相關疾病的預防和診斷水平。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于公開一種新的環(huán)狀rna的序列及其應用。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

一種環(huán)狀rna，其序列是如seqidno：1所示。

優(yōu)選的，該環(huán)狀rna可以作為肝癌檢測、治療、預后靶點進行應用。

一種肝癌檢測試劑盒，該試劑盒中含有能夠定量檢測序列為seqidno：1的環(huán)狀rna的試劑。

優(yōu)選的，該試劑盒中含有實時熒光定量檢測序列為seqidno：1的環(huán)狀rna的引物序列。

進一步優(yōu)選的，環(huán)狀rna引物序列是：

f：5’-ctcctcctgtctttctcctcctt-3’(seqidno：4)；

r：5’-gtcctgtggctatgctttgtga-3’(seqidno：5)。

一種肝功能指標檢測試劑盒，該試劑盒中含有能夠定量檢測序列為seqidno：1的環(huán)狀rna的試劑。

優(yōu)選的，該試劑盒中含有實時熒光定量檢測序列為seqidno：1的環(huán)狀rna的引物序列。

進一步優(yōu)選的，環(huán)狀rna引物序列是：

f：5’-ctcctcctgtctttctcctcctt-3’(seqidno：4)；

r：5’-gtcctgtggctatgctttgtga-3’(seqidno：5)。

優(yōu)選的，肝功能指標為谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶中的至少一種。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明申請公開的circrna在肝癌手術前后具有比較明顯的表達差異，目前用于肝癌的臨床輔助診斷技術尚不完善，因此該circrna具有作為肝癌相關的生物標志物的潛能。

附圖說明

圖1為hsa_circrna_400031在肝移植術前1天、肝移植術后1天、3天、7天的表達量。

具體實施方式

以下具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不作為對本發(fā)明的限定。

實施例1

在對肝癌進行研究的過程中，發(fā)現(xiàn)了一個環(huán)狀rna。其序列是：

ctgctgtgaggccagggtccaggggcagcctggaggggagcacagtggtcttgagacgcagcctcacaaagcatagccacaggacctctcccttgggccctagcacctgcctgggcacagaggcaaggaagagcctctgagacccctccttcctgtcccacaggacaggaaatgctcagagttgccaggggacctgggcaaagactcaaagctaacaagtgacagaaatgggacttgagccagaccttttgactccaagtccagcactctatccccctctcccatgcacctcctctcctcctgtctttctcctcctttctgcgtattatgaggtgccaagacctgatataggggatggaggtaaaaagagatggggtgagaagctgcagcccctcctccc(seqidno：1)，將其命名為hsa_circrna_400031。

實驗例2材料與處理：

1)外周血標本的收集

標本收取于中國人民解放軍第一八一醫(yī)院腎臟科進行plc肝移植手術前1天、術后1天、術后3天、術后7天患者，以及于中國人民解放軍第一八一醫(yī)院門診部門體檢正常的健康志愿者的外周血，每個標本收集0.5ml于0.5ml的凍存管中并置于-80℃冰箱保存，儲存?zhèn)溆?。所有研究對象均知情同意參加本項實驗，且該過程經醫(yī)院倫理委員會審查批準。

2)樣品的制備與評估

rna樣品制備

實驗分為肝癌病人肝移植術前1天組、術后1天、術后3天、術后7天組和健康對照組。

每組取2ml混樣全血，用1mltrizol試劑和移液管將細胞吹吸裂解液幾次，而懸浮細胞則是在離心的沉淀中加入trizol試劑并用移液管反復吹吸以裂解細胞，在trizol試劑加入前不要洗滌細胞以免增加mrna降解的可能。

為了將核酸蛋白復合體完全解離，把加了trizol的樣品于15-30℃放置5min；每1ml的trizol試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋；手動劇烈振蕩管體15s后，15-30℃孵育2-3min；4℃下12,000×g離心15mim；離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層核上層的無色的水相；rna全部被分配于水相中；水相的體積大約使勻漿時加入的trizol試劑的60％。

將水相轉移到新離心管中；水相與異丙醇混合使其中的rna沉淀(加入異丙醇的量為每個樣品勻漿加入1mltrizol試劑時加0.5ml的異丙醇)；混勻后15-30℃孵育10min后，于4℃12,000×g離心10min；rna沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。

移去上清液，每1mltrizol試劑勻漿的樣品中加入至少75％的乙醇1ml用于清洗rna沉淀；振蕩后，4℃7,500×g離心5min。

最后，為了不降低rna的可溶性，在空氣中不完全干燥rna沉淀5-10min。溶解rna時，先加入無rna酶的水用槍反復吹打幾次，然后55-60℃孵育10min。獲得的rna溶液保存于-70℃。

總rna純化及質檢

使用nanodropnd-1000評估rna量和質量，吸光度在260和280mn處測定，a260/a280的比值需要接近2.0(1.8-2.1之間均可)，并且a260/a230比值要大于1.8。rna完整性和純度通過標準變性凝膠電泳進行評估。具體實驗過程如下。

在微量離心管中分別加入重新溶解的rna≤85μl、10×反應緩沖液10μl、baseline-zerodna酶5μl、無rna酶的水至100μl；37℃孵育30min；加入350μl緩沖液rlt，混勻；加入250μl乙醇(96–100％)，吸打混勻；將上述700μl的樣品加入到安裝在2ml收集管上的rneasy小型離心柱中，小心地蓋上蓋子，在≥8000×g的離心機上離心15s，棄去流體；在rneasy小柱中加入500μl緩沖液rpe(rpe緩沖液第一次使用前，按瓶上所述加入4倍體積的96-100％乙醇配成工作溶液)，小心地蓋上蓋子≥8000×g離心15s，洗滌rneasy膜，棄去流體；再次加入500μl緩沖液rpe，蓋上蓋子，≥8000×g離心2min，洗滌rneasy膜；把rneasy柱放在一新的2ml的收集管中，用過濾法去除舊的收集管，全速離心1min；rneasy柱轉移到一新的1.5ml的離心管中，吸取適量無rna酶的水直接加入到rneasy膜中；蓋上管蓋，≥8000×g離心1min，洗脫；最后進行rna定量和質量控制。

實驗例3實時熒光定量pcr檢測

根據術前組(術前1天組)與健康對照組比較上調且術后組(術后1天、3天、7天組)與術前組比較下調，或者術前組與健康對照組比較下調且術后組與術前組比較上調的篩選原則隨機挑選驗證的circrna進行熒光定量驗證。以2-δδct法計算差異倍數，通過rt-pcr檢測。pcr引物序列如下：

表1rt-pcr引物列表

采用rt-pcr進行驗證。建立8μl體系，加入2×mastermix5μl，正、反向引物各0.5μl，蒸餾水2μl。將8μl混合液加到384-pcr板對應的每個孔中，加入對應的2μlcdna，小心粘上sealingfilm封口膜，并短暫離心混合。將上述384-pcr板置于realtimepcr儀上進行pcr反應。反應程序如下：95℃，10min；40個pcr循環(huán)(95℃，10s；60℃，60s收集熒光)。為了建立pcr產物的熔解曲線，擴增反應結束后，按(95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s)；并從60℃緩慢加熱到99℃(儀器自動進行-ramprate為0.05℃/s)。由于受rna濃度定量誤差和rna逆轉錄效率誤差等的影響，每個樣品的2μl體積的cdna其含量并不完全相同，為校正此差異，我們使用管家基因β-actin(不同樣品間表達量基本恒定)作為內參，以樣品待測基因的值除以此樣品內參的值，最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量。

肝移植術前1天、術后1天、術后3天、術后7天及健康對照者的5組外周血標本均可見擴增曲線，引物的擴增效率較高，熔解曲線符合標準，引物的特異性較好(表2)。

表2cricrna在標準曲線中與擴增相關的數值

實驗例4rt-pcr檢測結果分析

為了檢測hsa_circrna_400031在肝移植術前1天(肝癌患者)、術后1天、術后3天、術后7天以及健康對照組之間是否存在差異表達，發(fā)明人將circrna的ct值經β-actin內參基因的ct校正后得到的△ct值用于兩組間相對表達比值：2^-△△ct，以及兩組間是否存在顯著差異的p值計算(表3、表4)。從圖1可知，hsa_circrna_400031在肝移植術前1天的表達量相對于健康對照組極其顯著下調(p<0.01)，并且在肝移植術后1天、3天、7天有著顯著上調的趨勢。

表3肝移植組和健康對照組circrna的△ct值

表4肝移植組和健康對照組之間circrna表達的p值和2^-△△ct值

注：^*p<0.05代表兩組之間存在顯著差異表達；^**p<0.01代表兩組之間存在極其顯著差異表達。

實驗例5肝移植患者圍手術期實驗組

收取4例2014年12月1日至2015年8月31日于中國人民解放軍第一八一醫(yī)院確診為plc并進行肝移植手術的患者。4例患者均為男性，平均年齡40.25±6.40歲，中位年齡42.5歲。所有患者有長期大量飲酒病史，治療前診斷為酒精性肝硬化發(fā)展成plc，且無其他腫瘤病史和肝炎感染病史。

患者和健康個體的臨床特征從第181醫(yī)院的數據庫中提取并總結在表2-1中。谷草轉氨酶(aspartatetransaminase，ast)和谷丙轉氨酶(alanineaminotransferase，alt)是用于評估肝功能的常用指標，在0-50iu/l之間為正常參考值，表5顯示，經移植術后plc患者的肝功能逐漸恢復正常。

表5肝移植患者和健康對照組的臨床特征

sequencelisting

<110>深圳市東億健康服務有限公司

<120>hsa_circrna_400031在肝癌的診斷、治療及預后中的應用

<130>

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>400

<212>dna

<213>hsa_circrna_400031

<400>1

ctgctgtgaggccagggtccaggggcagcctggaggggagcacagtggtcttgagacgca60

gcctcacaaagcatagccacaggacctctcccttgggccctagcacctgcctgggcacag120

aggcaaggaagagcctctgagacccctccttcctgtcccacaggacaggaaatgctcaga180

gttgccaggggacctgggcaaagactcaaagctaacaagtgacagaaatgggacttgagc240

cagaccttttgactccaagtccagcactctatccccctctcccatgcacctcctctcctc300

ctgtctttctcctcctttctgcgtattatgaggtgccaagacctgatataggggatggag360

gtaaaaagagatggggtgagaagctgcagcccctcctccc400

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gtggccgaggactttgattg20

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cctgtaacaacgcatctcatatt23

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctcctcctgtctttctcctcctt23

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gtcctgtggctatgctttgtga22