本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種xp11.2的新易位伴侶及其檢測引物和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

2004年who對(duì)1997年腎細(xì)胞癌病理組織學(xué)分類進(jìn)行了修改，新增了xp11.2易位/tfe3基因融合相關(guān)性腎癌(xp11.2易位性腎癌)。tfe3基因位于xp11.2，是xp11.2易位性腎癌的唯一驅(qū)動(dòng)基因，其致病機(jī)理清晰明確：這類腫瘤均涉及位于xp11.2的tfe3基因同其它染色體易位及其所致形成融合基因，通過啟動(dòng)子變換從而高表達(dá)tfe3融合蛋白，而tfe3作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，通過與特異的dna結(jié)構(gòu)相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄調(diào)控體內(nèi)多種基因表達(dá)最終致病。目前至少有10種不同的易位伴侶和融合基因被報(bào)道，包括aspl-tfe3、prcc-tfe3、sfpq-tfe3、nono-tfe3、cltc-tfe3、luc7l3-tfe3、khsrp-tfe3、parp14-tfe3、dvl2-tfe3和rbm10-tfe3等，每例腫瘤內(nèi)僅存在單一的易位形式。除腎細(xì)胞癌外，一些軟組織間葉腫瘤同樣存在tfe3基因致病性的基因易位，包括腺泡狀軟組織肉瘤、部分上皮樣血管周細(xì)胞腫瘤等，這些間葉腫瘤和xp11.2易位性腎癌一起統(tǒng)稱為xp11.2易位性腫瘤。

xp11.2易位性腫瘤是一罕見類型腫瘤，雖然其總體發(fā)病率很低，但在兒童腎癌患者中約1/3為此類腎癌，并且回顧性研究表明此類腫瘤在我國并不罕見。該疾病以發(fā)病年齡輕為突出特征，因此造成極其沉重的家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)。且研究已證實(shí)，xp11.2易位性腎癌預(yù)后要比非xp11.2易位性腎癌預(yù)后差，并且不同基因類型xp11.2易位性腎癌的預(yù)后有所區(qū)別。此外，有明確證據(jù)表明xp11.2易位性腫瘤的患者對(duì)血管內(nèi)皮生長因子受體(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，vegfr)或哺乳動(dòng)物雷帕霉素(mammaliantargetofrapamycin，mtor)分子靶向治療敏感。另有研究表明，met酪氨酸激酶為aspl-tfe3融合基因的靶基因，并有望成為xp11.2易位性腫瘤的治療靶點(diǎn)。因此，根據(jù)基因型來精確診斷此類腫瘤顯得十分重要。

目前常用的診斷xp11.2易位性腫瘤的檢測方法主要包括免疫組織化學(xué)和熒光原位雜交。免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞核tfe3融合蛋白直觀、快捷、價(jià)格低，但其缺點(diǎn)是該方法容易受到多種因素影響，如組織固定時(shí)間、組織修復(fù)方式、抗體克隆號(hào)以及人為的判讀因素等等，使得結(jié)果可能出現(xiàn)假陽性或假陰性。染色體熒光原位雜交(fish)始于傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)和dna技術(shù)的結(jié)合，快速靈敏、特異性好，可以檢測隱匿或微小的染色體畸變以及復(fù)雜核型；還可以使用多種熒光標(biāo)記，顯示dna片段及基因之間的相對(duì)位置與方向，空間定位精確。但這兩種檢測方法只能提示存在tfe3蛋白的高表達(dá)或tfe3基因的易位，均不能明確腫瘤中發(fā)生的具體易位改變。精確檢測xp11.2易位性腫瘤的易位伴侶和融合基因位點(diǎn)，不僅是患者預(yù)后預(yù)測的依據(jù)，也是未來靶向治療的指導(dǎo)，因此，明確xp11.2易位性腫瘤的基因易位位點(diǎn)，具有重要的臨床意義。

xp11.2易位性腫瘤是一種每個(gè)個(gè)體間異質(zhì)性較大的腫瘤類型，目前已知的融合基因形式就包括aspl-tfe3、prcc-tfe3、sfpq-tfe3、nono-tfe3、cltc-tfe3、luc7l3-tfe3、khsrp-tfe3、parp14-tfe3、dvl2-tfe3和rbm10-tfe3等十余種。

目前高通量測序是唯一可以明確未知易位位點(diǎn)的檢測手段，然而高通量測序費(fèi)用高昂，檢測周期長，檢測平臺(tái)稀缺，對(duì)樣品質(zhì)量要求高，不利于普及推廣，對(duì)于大多數(shù)患者來說也不是首選檢測手段。依賴以往經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)已知的融合位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性的pcr引物組合，對(duì)腫瘤組織中提取出的rna逆轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行pcr擴(kuò)增并測序，檢測融合基因具體易位位點(diǎn)，是最準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)的方法。因此，發(fā)現(xiàn)新的致病融合位點(diǎn)，進(jìn)而設(shè)計(jì)pcr引物將有利于xp11.2易位性腫瘤檢測準(zhǔn)確度的進(jìn)一步提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種xp11.2的新易位伴侶。

本發(fā)明的另一目的是提供該新易位伴侶的檢測引物。

本發(fā)明的又一目的是提供引物的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種xp11.2的新易位伴侶，為matr3-tfe3基因易位，matr3基因位于5q31.2(5號(hào)染色體，位置139273752-139331677，序列來自genebank，序列版本號(hào)grch38.p7)，共19個(gè)外顯子；基因融合發(fā)生于matr3的15號(hào)外顯子與tfe3基因4號(hào)外顯子之間。我們通過高通量測序方法檢測未知融合對(duì)象的xp11.2腫瘤患者的標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)所述的xp11.2的新易位伴侶：matr3-tfe3基因易位，這一位點(diǎn)國內(nèi)外文獻(xiàn)均未報(bào)道過，原有tfe3融合基因擴(kuò)增引物也無法檢測出這一融合基因，因此會(huì)導(dǎo)致漏診。

所述的xp11.2的新易位伴侶優(yōu)選包含seqidno.5所示的核苷酸序列。

本發(fā)明所述的xp11.2的新易位伴侶在制備matr3-tfe3易位性腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。

一種檢測matr3-tfe3易位性腫瘤的pcr引物，為檢測本發(fā)明所述的matr3-tfe3基因易位的pcr引物。所有能夠檢測本發(fā)明所述matr3-tfe3基因易位的引物對(duì)均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

針對(duì)本發(fā)明找到的新的新易位伴侶，我們?cè)趍atr3的15號(hào)外顯子和tfe3的4號(hào)外顯子內(nèi)分別設(shè)計(jì)引物。遵循引物設(shè)計(jì)原則，引物最好在模板cdna的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，引物長度在15bp-30bp之間，引物gc含量在40％～60％之間，退火溫度最好接近72℃，引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，擴(kuò)增條帶單一特異。由于工作中經(jīng)常需要在石蠟固定標(biāo)本中開展工作，石蠟標(biāo)本rna碎裂嚴(yán)重，因此擴(kuò)增產(chǎn)物不宜過長，需要控制在300bp以下。

經(jīng)過多次調(diào)試和驗(yàn)證，最終設(shè)計(jì)的引物序列為：matr3-e15-f1：cagttcagtgggagacgaga(seqidno.1)；tfe3-e4-r1:gcgttgggttctccagat(seqidno.2)，理論擴(kuò)增產(chǎn)物長161bp，擴(kuò)增產(chǎn)物(融合基因)的全部序列如下：cagttcagtgggagacgagaccgatcttgctaatttaggtgatgtggcttctgatgggaaaaaggaaccatcagataaagctgtgaaaaaagatggaagtgcttcagcagcagcaaagaaaaagcttaaaaaggtgcagacccatctggagaacccaacgc(seqidno.5)。為保障檢測成功率，我們還設(shè)計(jì)了另一對(duì)替補(bǔ)引物：引物序列為：matr3-e15-f2：ggtgatgtggcttctgatg(seqidno.3)；tfe3-e4-r2:cgagtgtggtggacaggt(seqidno.4)，理論擴(kuò)增產(chǎn)物長184bp，擴(kuò)增產(chǎn)物(融合基因)的全部序列如下：ggtgatgtggcttctgatgggaaaaaggaaccatcagataaagctgtgaaaaaagatggaagtgcttcagcagcagcaaagaaaaagcttaaaaaggtgcagacccatctggagaacccaacgcgctaccacctgcagcaggcgcgccggcagcaggtgaaacagtacctgtccaccacactcg(seqidno.6)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，兩對(duì)引物均可成功擴(kuò)增出目的條帶，條帶單一、特異。

本發(fā)明所述的pcr引物在制備matr3-tfe3易位性腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。

一種matr3-tfe3易位性腫瘤診斷試劑盒，包括本發(fā)明所述的pcr引物。

有益效果：

本發(fā)明針對(duì)高通量測序發(fā)現(xiàn)的新融合位點(diǎn)設(shè)計(jì)了特異性的pcr引物，擴(kuò)大了原引物組合的檢測范圍，應(yīng)用于臨床，可提高診斷該類腫瘤的檢出率和準(zhǔn)確率。為診斷分型及分子靶向治療提供依據(jù)。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該引物組合診斷的特異性和敏感性均達(dá)到了100％，且操作對(duì)象只需要在石蠟包埋組織切片上進(jìn)行，時(shí)間僅為三個(gè)工作日。采用本發(fā)明提供的探針組合進(jìn)行檢測matr3-tfe3易位性腫瘤，不但方便、快速、可靠而且檢出率高，可用于制備matr3-tfe3易位性腫瘤診斷試劑盒，為matr3-tfe3易位性腫瘤的快速準(zhǔn)確的診斷提供了新的工具。

附圖說明

圖1：在已知matr3-tfe3融合型腫瘤中應(yīng)用本發(fā)明引物組合(matr3-e15-f1；tfe3-e4-r1)進(jìn)行驗(yàn)證，成功檢出的matr3-tfe3融合基因測序圖。

圖2：在已知matr3-tfe3融合型腫瘤中應(yīng)用本發(fā)明替補(bǔ)引物組合(matr3-e15-f2；tfe3-e4-r2)進(jìn)行驗(yàn)證，成功檢出的matr3-tfe3融合基因測序圖。

圖3：在未知融合對(duì)象的xp11.2腫瘤病例中應(yīng)用本發(fā)明引物組合(matr3-e15-f1；tfe3-e4-r1)，成功檢出的matr3-tfe3融合基因測序圖。

圖4：在未知融合對(duì)象的xp11.2腫瘤病例中應(yīng)用本發(fā)明替補(bǔ)引物組合(matr3-e15-f2；tfe3-e4-r2)，成功檢出的matr3-tfe3融合基因測序圖。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。

實(shí)施例1針對(duì)明確診斷的病例進(jìn)行驗(yàn)證：

對(duì)于高通量測序rna-seq檢測出matr3exon15-tfe3exon4新融合位點(diǎn)的病例，使用我們?cè)O(shè)計(jì)的引物進(jìn)行驗(yàn)證。

一、rna的提?。?/p>

嚴(yán)格按照rneasyffpekit操作說明進(jìn)行提取。①脫蠟：將收集好的玻片進(jìn)行二甲苯脫蠟，再用無水乙醇漂洗，風(fēng)干后用手術(shù)刀片刮下來裝入1.5mlep管中；②酶解：加入150μl消化液,再加入10μl蛋白酶k，混勻，56℃酶解15min,80℃15min，冰上冷卻；③加入16μldndna酶緩沖液,再加入10μldnasei,混勻，室溫靜置15mimin,12000rpm離心15min，取上清；④加入320μl結(jié)合液液再加入720μl無水乙醇，混勻，分2次轉(zhuǎn)移至吸附柱中，8000rpm離心1min，，棄廢液；⑤洗滌：加入500μl洗滌液,8000rpm離心1min；重復(fù)洗滌一次，棄廢液，將吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的2ml收集管中，12000rpm離心5min；⑥洗脫：將吸附柱轉(zhuǎn)移到1.5ml的ep管中，加入100μl的洗脫液，室溫靜置1min,12000rpm離心1min，將收集好的洗脫液(即dna提取液)進(jìn)行濃度和純度測定，-80℃保存存待用。

二、逆轉(zhuǎn)錄pcrrt-pcr

采用試劑盒(k1622，revertaidfirststrandcdnasynthesiskit，mbi)對(duì)rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，方法詳見試劑盒說明。pcr擴(kuò)增引物為本專利matr3-tfe3融合基因引物組合。反應(yīng)體系包括：0.125μltakaraextaq^tmhs液，2.5μl10×taqbuffer(mg²⁺plus)，2μldntp(均購自日本takara公司)，引物濃度為20μmol/l，cdna模版為100ng，無菌去離子水加至25μl。pcr擴(kuò)增條件為94℃變性3min后，94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35次循環(huán)，最后72℃延伸5min。pcr產(chǎn)物用3％瓊脂糖，電壓100v，電泳，溴化乙啶染色后于紫外光下觀察結(jié)果，并送測序。

結(jié)果：分別用本發(fā)明兩對(duì)引物(matr3-e15-f1/tfe3-e4-r1；和matr3-e15-f2/tfe3-e4-r2)pcr后均可見單一特異的電泳條帶，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，得到matr3exon15-tfe3exon4融合基因序列(圖1、圖2)，證明本項(xiàng)目設(shè)計(jì)的引物組合可靠且敏感。

實(shí)施例2針對(duì)未知易位伴侶的xp11.2腫瘤進(jìn)行檢測

我們對(duì)35例未知易位伴侶的xp11.2腫瘤使用本發(fā)明的引物組合進(jìn)行檢測，rna提取、逆轉(zhuǎn)錄pcr和測序方法同上。

結(jié)果：使用本發(fā)明設(shè)計(jì)引物組合檢測，共1例檢測出matr3-tfe3融合基因(圖3、圖4)，通過免疫組織化學(xué)、熒光原位雜交等方法驗(yàn)證，結(jié)果真實(shí)可靠。

評(píng)價(jià)：本發(fā)明引物組合是對(duì)原有xp11.2融合基因引物的補(bǔ)充，涵蓋了tff3融合基因的未報(bào)道位點(diǎn)，增加了rt-pcr方法診斷該腫瘤的檢出率。

<110>中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院

<120>一種xp11.2的新易位伴侶及其檢測引物和應(yīng)用

<160>6

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物matr3-e15-f1

<400>1

cagttcagtgggagacgaga20

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物tfe3-e4-r1

<400>2

gcgttgggttctccagat18

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物matr3-e15-f2

<400>3

ggtgatgtggcttctgatg19

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物tfe3-e4-r2

<400>4

cgagtgtggtggacaggt18

<210>5

<211>161

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>融合基因擴(kuò)增產(chǎn)物

<400>5

cagttcagtgggagacgagaccgatcttgctaatttaggtgatgtggcttctgatgggaa60

aaaggaaccatcagataaagctgtgaaaaaagatggaagtgcttcagcagcagcaaagaa120

aaagcttaaaaaggtgcagacccatctggagaacccaacgc161

<210>6

<211>184

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>融合基因擴(kuò)增產(chǎn)物

<400>6

ggtgatgtggcttctgatgggaaaaaggaaccatcagataaagctgtgaaaaaagatgga60

agtgcttcagcagcagcaaagaaaaagcttaaaaaggtgcagacccatctggagaaccca120

acgcgctaccacctgcagcaggcgcgccggcagcaggtgaaacagtacctgtccaccaca180

ctcg184