本發(fā)明涉及超聲診斷用靶向試劑，具體涉及一種肝癌超聲診斷靶向試劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

肝癌在亞洲是一種可引起高死亡率的侵襲性癌癥，早期診斷和治療對(duì)于提高肝癌患者的存活幾率非常重要。超聲檢查由于其無創(chuàng)無輻射、操作方便、價(jià)格低廉、對(duì)設(shè)備場(chǎng)地要求低等優(yōu)勢(shì)，是臨床診斷腫瘤的重要手段，然而，由于超聲診斷自身局限性，較小的肝癌組織難以檢測(cè)出來。

隨著各種新型超聲造影劑的出現(xiàn)和超聲顯像技術(shù)的不斷發(fā)展，微泡造影劑(如國內(nèi)臨床采用braco公司生產(chǎn)的sonovue造影劑)開始應(yīng)用于惡性腫瘤的檢查，但其敏感性較低，特異性不高，是一種無定向選擇作用的全身性造影劑。此外，尚有采用全氟溴辛烷等氟碳制備納米造影劑的報(bào)道(張華娟等.一種全氟碳化合物脂質(zhì)體納米球及其制備方法.中國專利，申請(qǐng)?zhí)?01210549252.0)，從而克服微泡造影劑無法達(dá)到血管外腫瘤組織成像的。但是，早期肝癌病人的臨床癥狀相對(duì)隱蔽，這為肝癌的診斷帶來了很大的困難。

國內(nèi)外近幾年已經(jīng)開始了靶向超聲造影劑的相關(guān)研究，通過通過靶向超聲造影劑，使其聚集于靶組織，達(dá)到特異性增強(qiáng)顯影效果。與普通超聲造影劑相比，靶向超聲造影通過特異性作用于病變區(qū)生物分子組成成分，來突出顯示病變部位，從而提高超聲診斷的準(zhǔn)確性與敏感性。通常是將靶向超聲造影劑是將特異性抗體或配體與微泡表面連接，靜脈注射后，使其能夠較長時(shí)間定向地聚積于靶組織或器官，使靶區(qū)超聲圖像特異性增強(qiáng)或進(jìn)行靶向治療。

現(xiàn)有技術(shù)中，將特異性抗體或配體與微泡表面連接方式通常采用將特異性抗體或配體生物素化，而后再添加親和素，然后通過親和素和生物素的連接作用使得特異性抗體或配體與微泡進(jìn)行連接，然而上述連接作用存在一定問題，由于抗體或配體生物素化后可能影響其生物活性，同時(shí)受血流剪切力的影響，靶向超聲造影劑與靶組織不能緊密吸附，從而使得靶向定位功能降低，這在肝癌的造影劑中表現(xiàn)尤為明顯。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，發(fā)明人經(jīng)過長期的技術(shù)與實(shí)踐探索，提供一種肝癌超聲診斷靶向試劑，并提供一種構(gòu)建肝癌超聲診斷靶向試劑的方法，以及該肝癌超聲診斷靶向試劑在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：

一種肝癌超聲診斷靶向試劑，該試劑為endoglin靶向微泡，該靶向微泡包括脂質(zhì)外殼和氣體內(nèi)芯，所述脂質(zhì)外殼的外表面連接有endoglin單克隆抗體。

優(yōu)選的，所述脂質(zhì)外殼由二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、聚乙二醇1500(peg1500)混合制成；

所述氣體內(nèi)芯為生物惰性氣體，進(jìn)一步優(yōu)選為全氟丙烷氣體(c3f8)。

一種肝癌超聲診斷靶向試劑的制備方法，包括如下步驟：

1)將二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)和聚乙二醇1500(peg1500)按質(zhì)量比1:4～7:3溶于氯仿中制成懸浮液，將所述懸浮液混勻，在干燥氮?dú)庾饔孟滦纬闪字∧ぃ?/p>

2)在磷脂薄膜中加入tris緩沖溶液，室溫下?lián)u床震蕩使得磷脂溶液分散至透明得脂質(zhì)外殼；

3)將含有脂質(zhì)外殼的磷脂溶液置于西林瓶中，并將將西林瓶中的空氣置換成生物惰性氣體，震蕩制備超聲微泡；

4)取endoglin單克隆抗體溶于pbs-edta緩沖液(4×pe,ph7.4)中，將巰基乙醇溶于pbs緩沖液(ph7.4)中，將所述pbs-edta緩沖液和所述pbs緩沖液混合，37℃孵育，超濾得單鏈抗體；

5)將單鏈抗體與超聲微泡在4℃孵育過夜，用離心漂浮法清洗3～4次除去沒有連接在超聲微泡上的單鏈抗體，得到endoglin靶向微泡。

優(yōu)選的，所述步驟1)中二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)和聚乙二醇1500(peg1500)的質(zhì)量比為1:5：3；

優(yōu)選的，所述步驟3)中震蕩頻率為2000～3000次/分鐘(進(jìn)一步優(yōu)選為2500次/分鐘)，震蕩時(shí)間為20～40秒(進(jìn)一步優(yōu)選為30秒)。采用上述震蕩頻率和震蕩時(shí)間，能夠有效控制得到的超聲微泡的粒徑小于600nm，從而使得微泡更易進(jìn)入腫瘤組織間隙，使得endoglin單克隆抗體能夠與腫瘤中成體血管內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中的endoglin結(jié)合，從而使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確；同時(shí)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，加大震蕩頻率或延長震蕩時(shí)間只能使得壞泡率升高，并不能進(jìn)一步減小微泡粒徑。

本發(fā)明還公開了上述肝癌超聲診斷靶向試劑在超聲肝癌靶向診斷中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述應(yīng)用中超聲成像參數(shù)為：采用二次諧波顯像模式，顯像頻率為5～10mhz，機(jī)械指數(shù)(mi)0.3～0.6，增益為-20db。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述應(yīng)用中超聲成像參數(shù)為：采用二次諧波顯像模式，顯像頻率為10mhz，機(jī)械指數(shù)(mi)0.5，增益為-20db。

本發(fā)明檢測(cè)肝癌的endoglin靶向微泡，其中所述的超聲微泡與endoglin單克隆抗體的連接是利用微泡表面的順丁烯二酰亞胺鍵和單克隆抗體打開后的巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醚鍵，從而將單克隆抗體片段連接在微泡上，不僅使單克隆抗體的分子量減半，暴露保守段中的巰基，而且不影響抗體的抗原識(shí)別效能，由于未進(jìn)行生物素化等操作，并不影響單克隆抗體的生物活性，從而使得靶向生物活性更高。

本發(fā)明技術(shù)原理：endoglin,即cd105,是一種同源二聚體跨膜糖蛋白，包含561個(gè)氨基酸殘基，是tgfβ受體復(fù)合物中的重要組分。endoglin在成體血管內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道了endoglin在腫瘤組織如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌的重構(gòu)的或新生的血管里過量表達(dá)，但是endoglin在早期肝癌組織細(xì)胞中是否過量表達(dá)，能否作為靶向造影劑的靶向材料尚未報(bào)道。發(fā)明人通過試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，endoglin能夠與與肝癌微血管特異性結(jié)合，通過構(gòu)建endoglin靶向微泡，從而用于肝癌腫瘤血管新生的診斷即提供一種有效的早期肝癌的診斷手段。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明設(shè)計(jì)的一種肝癌超聲診斷靶向試劑，可以通過靜脈注射使靶向微泡穿過腫瘤血管，進(jìn)入腫瘤組織間隙，與成體血管內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞特異性結(jié)合，從而在腫瘤部位有效富集以及停留延長，通過聚集成像清晰區(qū)分病變組織和周圍的正常組織，應(yīng)用非線性諧波成像技術(shù)，達(dá)到肝癌的靶向分子顯影；同時(shí)，為了使得微泡能夠更加方便進(jìn)入腫瘤組織間隙，發(fā)明人通過調(diào)整試驗(yàn)參數(shù)，從而使得微泡(約占總量的95％)粒徑小于等于600nm，從而使得微泡進(jìn)入腫瘤組織間隙更加便捷；而且本發(fā)明中的超聲微泡與endoglin單克隆抗體的連接是利用微泡表面的順丁烯二酰亞胺鍵和單克隆抗體打開后的巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醚鍵，采用非共價(jià)鍵的結(jié)合方式，使得連接更為緊密，從而防止在超聲造影過程中單克隆抗體與微泡脫落分離，影響試驗(yàn)效果；而且由于本發(fā)明中并不額外添加生物素修飾，使得單克隆抗體的生物活性完全不受影響，使得試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

附圖說明

圖1為以微氣泡為靶點(diǎn)的超聲成像示意圖，其中(a)微氣泡注射前；(b)注射后，血管中結(jié)合的和游離的微氣泡都能被超聲檢測(cè)到；(c)連續(xù)性破壞性脈沖破壞了成像平面中所有的微氣泡(包括結(jié)合的和流動(dòng)的)，之后循環(huán)中仍存留的微氣泡再次循環(huán)到成像平面。因此，強(qiáng)度的變化代表了結(jié)合的微氣泡的程度。

圖2為皮下荷瘤(hcc)裸鼠靶向endoglin的超聲分子成像圖。其中，圖(a)在破壞性脈沖(灰色區(qū)域)結(jié)束后，感興趣的追蹤區(qū)域的超聲信號(hào)強(qiáng)度圖；左側(cè)是破壞前，右側(cè)是破壞后。破壞性脈沖導(dǎo)致的強(qiáng)度的變化是特異性結(jié)合微氣泡多少的指標(biāo)。破壞性脈沖之前的線性信號(hào)代表血液中結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞和游離的微氣泡，以及組織信號(hào)，破壞性脈沖之后的線性信號(hào)對(duì)應(yīng)著仍然存在于血液循環(huán)中的微氣泡和剩余組織回聲，而不代表結(jié)合過程。從破壞性脈沖之前的平均強(qiáng)度扣除之后的平均強(qiáng)度，即獲得了dte的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)。圖(b)為參量成像，圖的右角顯示了dte的比例尺；圖(c)為靶向endoglin的微氣泡和對(duì)照組同型微氣泡的dte。dte＝tead-tebd.n＝4；**p<0.001.te:targetedenhancement，定向增強(qiáng),dte:differentialtargetedenhancement,差異性定向增強(qiáng)，ad:afterdestruction，破壞后，bd:beforedestruction，破壞前。

圖3為裸鼠肝臟和hepg2皮下移植腫瘤中endoglin的表達(dá)。利用endoglin抗體對(duì)裸鼠肝臟(a)和hepg2移植腫瘤(b)進(jìn)行免疫染色。箭頭指向色陽性的血管；(c)endoglinmrna的相對(duì)表達(dá)量，n＝4；**p<0.001；(d)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)endoglin蛋白表達(dá)。

圖4為用培養(yǎng)hepg2細(xì)胞的條件培養(yǎng)液處理huvecs后對(duì)endoglin表達(dá)的影響。

用培養(yǎng)hepg2細(xì)胞的條件培養(yǎng)液處理huvecs后，檢測(cè)endoglin的mrna和蛋白水平。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請(qǐng)所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請(qǐng)的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)肝癌超聲造影靶向性不高；

有鑒于此，本發(fā)明的一種典型實(shí)施方式中，提供一種肝癌超聲診斷靶向試劑，該試劑為endoglin靶向微泡，該靶向微泡包括脂質(zhì)外殼和氣體內(nèi)芯，所述脂質(zhì)外殼的外表面連接有endoglin單克隆抗體。

本發(fā)明的又一種典型實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)外殼由二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)和聚乙二醇1500混合制成；

本發(fā)明的又一種典型實(shí)施方式中，所述氣體內(nèi)芯為生物惰性氣體，進(jìn)一步優(yōu)選為全氟丙烷氣體(c3f8)。

本發(fā)明的又一種典型實(shí)施方式中，一種肝癌超聲診斷靶向試劑的制備方法，包括如下步驟：

1)將二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)和聚乙二醇1500按質(zhì)量比1:4～7:3溶于氯仿中制成懸浮液，將所述懸浮液混勻，在干燥氮?dú)庾饔孟滦纬闪字∧ぃ?/p>

2)在磷脂薄膜中加入tris緩沖溶液，室溫下?lián)u床震蕩使得磷脂溶液分散至透明得脂質(zhì)外殼；

3)將含有脂質(zhì)外殼的磷脂溶液置于西林瓶中，并將將西林瓶中的空氣置換成生物惰性氣體，震蕩制備超聲微泡；

4)取endoglin單克隆抗體溶于pbs-edta緩沖液(pe,4×,ph7.4)中，將巰基乙醇溶于pbs緩沖液(ph7.4)中，將所述pbs-edta緩沖液和所述pbs緩沖液混合，37℃孵育，超濾得單鏈抗體；

5)將單鏈抗體與超聲微泡在4℃孵育過夜，用離心漂浮法清洗3～4次除去沒有連接在超聲微泡上的單鏈抗體，得到endoglin靶向微泡。

本發(fā)明的又一種典型實(shí)施方式中，所述步驟1)中二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)和聚乙二醇1500的質(zhì)量比為1:5：3；

本發(fā)明的又一種典型實(shí)施方式中，所述步驟3)中震蕩頻率為2000～3000次/分鐘(進(jìn)一步優(yōu)選為2500次/分鐘)，震蕩時(shí)間為20～40秒(進(jìn)一步優(yōu)選為30秒)。采用上述震蕩頻率和震蕩時(shí)間，能夠有效控制得到的超聲微泡的粒徑小于600nm，從而使得微泡更易進(jìn)入腫瘤組織間隙，使得endoglin單克隆抗體能夠與腫瘤中成體血管內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中的endoglin結(jié)合，從而使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確；同時(shí)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，加大震蕩頻率或延長震蕩時(shí)間只能使得壞泡率升高，并不能進(jìn)一步減小微泡粒徑。

本發(fā)明的又一種典型實(shí)施方式中，提供了一種肝癌超聲診斷靶向試劑的制備方法，包括如下步驟：

1)將二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)和聚乙二醇1500按質(zhì)量比1:5:3溶于氯仿中制成懸浮液，將所述懸浮液混勻，在干燥氮?dú)庾饔孟滦纬闪字∧ぃ?/p>

2)在磷脂薄膜中加入tris緩沖溶液，室溫下?lián)u床震蕩使得磷脂溶液分散至透明得脂質(zhì)外殼；

3)將含有脂質(zhì)外殼的磷脂溶液置于西林瓶中，并將將西林瓶中的空氣置換成全氟丙烷氣體，震蕩制備超聲微泡，震蕩頻率為2500次/分鐘，震蕩時(shí)間為30秒；

4)取endoglin單克隆抗體溶于pbs-edta緩沖液(pe,4×,ph7.4)中，將巰基乙醇溶于pbs緩沖液(ph7.4)中，將所述pbs-edta緩沖液和所述pbs緩沖液混合，37℃孵育，超濾得單鏈抗體；

5)將單鏈抗體與超聲微泡在4℃孵育過夜，用離心漂浮法清洗3～4次除去沒有連接在超聲微泡上的單鏈抗體，得到endoglin靶向微泡。

本發(fā)明的又一種典型實(shí)施方式中，還公開了上述肝癌超聲診斷靶向試劑在超聲肝癌靶向診斷中的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一種典型實(shí)施方式中，所述應(yīng)用中超聲成像參數(shù)為：采用二次諧波顯像模式，顯像頻率為5～10mhz，機(jī)械指數(shù)(mi)0.3～0.6，增益為-20db。

本發(fā)明的又一種典型實(shí)施方式中，所述應(yīng)用中超聲成像參數(shù)為：采用二次諧波顯像模式，顯像頻率為10mhz，機(jī)械指數(shù)(mi)0.5，增益為-20db。

下面進(jìn)一步以具體實(shí)施例進(jìn)行闡述。

實(shí)施例

實(shí)驗(yàn)步驟

1.動(dòng)物模型balb/c裸小鼠，3～4周齡，雄性，體質(zhì)18～22g，spf級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期hepg2肝癌細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×10⁷/ml，于每只裸鼠腹部皮下接種0.1ml懸浮液，待三周后進(jìn)行造影觀察；

2.超聲儀器參數(shù)設(shè)置采用二次諧波顯像模式，顯像頻率為10mhz，機(jī)械指數(shù)(mi)0.5，增益為-20db；

3.采用常規(guī)免疫組化,qrt-pcr，westernblot對(duì)裸鼠的肝臟組織和移植的肝癌組織進(jìn)行分析；使用hepg2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvecs)進(jìn)行培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

靶向超聲成像

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都接受超聲對(duì)比成像，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的急性毒副反應(yīng)。為了證實(shí)mbendoglin結(jié)合的特異性，注射mbisotype(mbisotype即僅有超聲微泡，不連接有endoglin)以排除非特異性結(jié)合的干擾。在用veov2100系統(tǒng)(visualsonics,toronto,canada)收集超聲圖像后，用內(nèi)裝的軟件自動(dòng)分析mbendoglin和mbisotype的差異性靶向增強(qiáng)信號(hào)。先前研究表明，endoglin是血管新生良好的生物標(biāo)記物。在本研究中，我們把endoglin的單克隆抗體連在微氣泡上，去靶向裸鼠皮下移植肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞表面過表達(dá)的endoglin分子。超聲波照射之前的圖像代表結(jié)合的和血液中流動(dòng)的微氣泡以及組織信號(hào)。超聲波照射之后的圖像對(duì)應(yīng)著仍然存在于循環(huán)中的微氣泡和殘留的組織回聲，但與過程無關(guān)。超聲波照射前后信號(hào)強(qiáng)度相減就是結(jié)合狀態(tài)微氣泡的強(qiáng)度。靶向endoglin的微氣泡的差異性靶向增強(qiáng)信號(hào)(thedifferentialtargetedenhancement,dte)顯著強(qiáng)于isotype。

裸鼠肝臟和移植肝癌中endoglin的表達(dá)

用免疫組化,qrt-pcr，westernblot對(duì)裸鼠的肝臟組織和移植的肝癌組織進(jìn)行分析。肝癌組織微血管內(nèi)皮上檢測(cè)到endoglin表達(dá),但在正常肝組織和血管中未檢測(cè)到。qrt-pcr結(jié)果表明，endoglinmrna表達(dá)量顯著高于正常肝組織(n＝4,p<0.001)。westernblot在肝癌提取蛋白中檢測(cè)到了endoglin表達(dá)，在肝組織中卻沒檢測(cè)到。

hepg2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)huvecs中endoglin表達(dá)的影響

當(dāng)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞處于增殖和活化階段時(shí)，能檢測(cè)到endoglin高表達(dá)。為了模擬腫瘤血管的微環(huán)境，收集hepg2細(xì)胞的培養(yǎng)上清后處理huvecs。12小時(shí)后，huvecs中endoglin的mrna水平顯著上調(diào)(p<0.001)。并且westernblot結(jié)果表明，用hepg2培養(yǎng)液上清處理后還顯著上調(diào)了huvecs中endoglin的蛋白表達(dá)。

以上所述僅為本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。