本發(fā)明屬于甘草素深加工的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物及組合物及制備方法及新用途。

背景技術(shù)：

運(yùn)動(dòng)性疲勞是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和運(yùn)動(dòng)生理學(xué)研究的永恒主題。關(guān)于運(yùn)動(dòng)性疲勞的形成機(jī)制，人們提出了各種假說，如能源物質(zhì)耗竭學(xué)說、自由基傷害學(xué)說、神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說、乳酸堆積學(xué)說及ca²⁺穩(wěn)態(tài)異常學(xué)說等。

能源物質(zhì)耗竭學(xué)說提出，能源物質(zhì)包括各種糖原、atp、磷酸肌酸等，機(jī)體在短時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，會(huì)大量的動(dòng)用糖原等能源物質(zhì)分解，以提供能量，如果其中的一些含量下降，又得不到及時(shí)的補(bǔ)充，從而會(huì)引發(fā)運(yùn)動(dòng)性疲勞。

甘草素(liquiritigenin)化學(xué)名：7,4’-二羥基二氫黃酮，是從甘草中提煉制成的黃酮類成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式為：

甘草中的黃酮類成分可分為水溶性黃酮和脂溶性黃酮，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗?jié)?、抗腫瘤、保護(hù)胃黏膜作用。近年來又發(fā)現(xiàn)甘草黃酮能夠抑制癌細(xì)胞的增殖。

甘草素具有消除自由基，抗氧化的藥理活性，但是在水中的溶解性較差，服用是吸收較差，所以需要解決甘草素溶解性差、人體吸收較差的問題。

關(guān)于甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的制備技術(shù)，及其包合物及組合物用于抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的研究，尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出了甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物。

本發(fā)明還提出了甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的制備方法。

本發(fā)明還提出了甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物藥物組合物。

本發(fā)明還提出了甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的新用途。

一種甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物，含有甘草素和環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，所述甘草素與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的分子摩爾比為1:1～1:100，所述環(huán)糊精衍生物選自β-環(huán)糊精、羥乙基-β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精、麥芽糖-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、磺乙基-β-環(huán)糊精、磺丙基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精的一種。

一種甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的制備方法，取環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，加水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入甘草素，加入的甘草素摩爾數(shù)與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的摩爾數(shù)的比例為1:1～1:100，繼續(xù)攪拌，使所述環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物和甘草素完全反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預(yù)冷凍4h，再用冷凍干燥機(jī)在-80℃干燥過夜得固體甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物；

所述環(huán)糊精衍生物選自β-環(huán)糊精、羥乙基-β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精、麥芽糖-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、磺乙基-β-環(huán)糊精、磺丙基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精的一種。

一種藥物組合物，包含一種甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物和制藥學(xué)上可接受的輔料，所述藥物組合物是以甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物為活性成分，所述輔料為藥劑上任意可以接受的賦形劑，所述甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物和輔料的重量比為10:90～90:10；

所述甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物含有甘草素和環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，所述甘草素與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的分子摩爾比為1:1～1:100；

所述環(huán)糊精衍生物選自β-環(huán)糊精、羥乙基-β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精、麥芽糖-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、磺乙基-β-環(huán)糊精、磺丙基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精的一種，所述環(huán)糊精選自β-環(huán)糊精。

甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物在制備治療和/或預(yù)防抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的包合行為，提高甘草素的水溶性，進(jìn)而提高人體對(duì)甘草素的吸收能力；

甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的制備方法還可以采用超聲法和研磨法：

超聲法：精密稱取甘草素和環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物加入水溶解，在環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物水溶液中加入甘草素后，立即超聲至溶解透明，加入的甘草素摩爾數(shù)與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的摩爾數(shù)的比例為1:1～1:100，超聲完成后，將上述溶液過微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預(yù)冷凍4h，再用冷凍干燥機(jī)在-80℃干燥過夜得固體甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物。

研磨法：精密稱取精密稱取環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，加入適量蒸餾水將環(huán)糊精研勻，在研磨條件下，緩慢分次加入甘草素，充分研磨，將獲得的糊狀物在-80℃冰箱預(yù)冷凍4h，再用冷凍干燥機(jī)在-80℃干燥過夜得固體甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物，加入的甘草素摩爾數(shù)與環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物的摩爾數(shù)的比例為1:1～1:100。

包含一種甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物和制藥學(xué)上可接受的輔料的藥物組合物，是以甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物為活性成分，所述輔料為藥劑上任意可以接受的賦形劑，賦形劑可以為蔗糖、乳糖、葡萄糖的一種或幾種任意組合而成的穩(wěn)定劑。在具體實(shí)施例中，所述甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物和輔料的重量比可以為10:90、20:80、25:85、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、60:60、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10。

上述甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物作為制備改善或治療抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物中的應(yīng)用及藥物組合物是發(fā)明人在研究甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的過程中，經(jīng)過建立動(dòng)物模型，檢測(cè)試驗(yàn)小鼠樣本中的肝糖原、血乳酸、尿素氮的變化水平，證實(shí)了甘草素具有抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用，并制備出了抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物組合物。

附圖說明

圖1為甘草素、甘草素-β-環(huán)糊精包合物以及甘草素和β-環(huán)糊精混合物的紅外圖譜。

圖2為甘草素、甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物以及甘草素和羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的紅外圖譜。

具體實(shí)施方式

以下為甘草素-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物的制備方法實(shí)施例

實(shí)施例一：甘草素-β-環(huán)糊精包合物的制備方法

取1mmolβ-環(huán)糊精，加60g水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入1mmol甘草素，繼續(xù)攪拌，使所述β-環(huán)糊精和甘草素完全反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預(yù)冷凍4h，再用冷凍干燥機(jī)在-80℃干燥過夜得固體甘草素-β-環(huán)糊精包合物。

實(shí)施例二：甘草素-β-環(huán)糊精包合物的制備方法

取10mmolβ-環(huán)糊精，加600g水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入1mmol甘草素，繼續(xù)攪拌，使所述β-環(huán)糊精和甘草素完全反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預(yù)冷凍4h，再用冷凍干燥機(jī)在-80℃干燥過夜得固體甘草素-β-環(huán)糊精包合物。

實(shí)施例三：甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備方法

取1mmol羥丙基-β-環(huán)糊精，加10g水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入1mmol甘草素，繼續(xù)攪拌，使所述羥丙基-β-環(huán)糊精和甘草素完全反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預(yù)冷凍4h，再用冷凍干燥機(jī)在-80℃干燥過夜得固體甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物。

實(shí)施例四：甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備方法

取10mmol羥丙基-β-環(huán)糊精，加100g水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入1mmol甘草素，繼續(xù)攪拌，使所述羥丙基-β-環(huán)糊精和甘草素完全反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預(yù)冷凍4h，再用冷凍干燥機(jī)在-80℃干燥過夜得固體甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物。

實(shí)施例五：甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備方法

取100mmol羥丙基-β-環(huán)糊精，加500g水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入1mmol甘草素，繼續(xù)攪拌，使所述羥丙基-β-環(huán)糊精和甘草素完全反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預(yù)冷凍4h，再用冷凍干燥機(jī)在-80℃干燥過夜得固體甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物。

實(shí)施例六：甘草素-羧甲基-β-環(huán)糊精包合物的制備方法

取1mmol羧甲基-β-環(huán)糊精，加10g水溶解，在室溫下邊攪拌邊加入1mmol甘草素，繼續(xù)攪拌，使所述羧甲基-β-環(huán)糊精和甘草素完全反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，得到溶液，將上述溶液用微孔濾膜過濾，濾液在-80℃冰箱預(yù)冷凍4h，再用冷凍干燥機(jī)在-80℃干燥過夜得固體甘草素-羧甲基-β-環(huán)糊精包合物。

對(duì)上述實(shí)施例一、實(shí)施例三制得的甘草素-β-環(huán)糊精包合物、甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，進(jìn)而驗(yàn)證是否生成包合物。

紅外測(cè)定方法為：各取微量甘草素、甘草素-β-環(huán)糊精包合物、甘草素和β-環(huán)糊精混合物、甘草素-hp-β-環(huán)糊精包合物以及甘草素和hp-β-環(huán)糊精混合物，加入適量固體kbr，充分研磨均勻并壓片，分辨率為2cm^-1，3500～500cm^-1全譜掃描。對(duì)甘草素、甘草素-β-環(huán)糊精包合物、甘草素和β-環(huán)糊精混合物、甘草素-hp-β-環(huán)糊精包合物以及甘草素和hp-β-環(huán)糊精混合物分別進(jìn)行紅外測(cè)定，結(jié)果如圖1、圖2所示。

由圖1可見，甘草素與β-環(huán)糊精各有自身的紅外特征吸收峰。混合物的光譜圖具有加和性，表現(xiàn)為兩組分的疊加；包合物則表現(xiàn)不同，包合物有部分峰發(fā)生紫移，部分峰發(fā)生紅移,部分峰消失。包合物與環(huán)糊精的圖譜比較，包合物以環(huán)糊精的圖譜為主，而甘草素的光譜特征部分消失。這可以說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論預(yù)期幾乎一致，環(huán)糊精空腔孔徑與客體分子相匹配，甘草素分子包埋于β-環(huán)糊精的空腔內(nèi)，其分子振動(dòng)受到限制而不能完全顯現(xiàn)其原有的紅外特性。甘草素與β-環(huán)糊精之間形成了超分子包合物。

由圖2可見，甘草素與hp-β-環(huán)糊精各有自身的紅外特征吸收峰。混合物的光譜圖具有加和性，表現(xiàn)為兩組分的疊加；包合物則表現(xiàn)不同，包合物有部分峰發(fā)生紫移，部分峰發(fā)生紅移,部分峰消失。包合物與環(huán)糊精的圖譜比較，包合物以環(huán)糊精的圖譜為主，而甘草素的光譜特征部分消失。這可以說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論預(yù)期幾乎一致，環(huán)糊精空腔孔徑與客體分子相匹配，甘草素分子包埋于hp-β-環(huán)糊精的空腔內(nèi)，其分子振動(dòng)受到限制而不能完全顯現(xiàn)其原有的紅外特性。甘草素與hp-β-環(huán)糊精之間形成了超分子包合物。

以下為甘草素-β-環(huán)糊精包合物及甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的藥理實(shí)驗(yàn)：

本發(fā)明中，發(fā)明人經(jīng)過建立動(dòng)物模型，檢測(cè)試驗(yàn)小鼠樣本中的肝糖原、血乳酸、尿素氮的變化水平，證實(shí)了甘草素-β-環(huán)糊精包合物，及甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物具有抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用，并制備出了抗運(yùn)動(dòng)性疲勞藥物組合物。

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)小鼠購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雄性、四周齡、體重(22±2g)、spf級(jí)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):syxk(寧)。喂養(yǎng)條件包括標(biāo)準(zhǔn)飼料，自來水，室溫保持在(24士2)℃，濕度50-60％，每日光照與黑暗時(shí)間各12h。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備前，將動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)3天。

二、實(shí)驗(yàn)藥品及儀器

藥品：采用上述方法制備得到的甘草素-β-環(huán)糊精包合物，甘草素-羥丙基β-環(huán)糊精包合物，三氯醋酸(ar，麥克林試劑公司)，葡萄糖(ar，阿拉丁試劑公司)，羧甲基纖維素鈉(ar，麥克林試劑公司)，蒽酮(ar，阿拉丁試劑公司)，硫脲(ar，阿拉丁試劑公司)，氟化鈉(ar，阿拉丁試劑公司)，鎢酸鈉(ar，麥克林試劑公司)，三氯乙酸(ar，麥克林試劑公司)，硫酸銅(ar，阿拉丁試劑公司)，對(duì)羥基聯(lián)苯(ar，阿拉丁試劑公司)，乳酸鈣(ar，阿拉丁試劑公司)，濃硫酸(寧夏美信生物試劑公司)，乙醇(寧夏美信生物試劑公司)，naoh(寧夏美信生物試劑公司)。

儀器：sps202f型分析天平(中州電子衡器有限公司)，model1510型超聲波清洗器(沃瓏儀器設(shè)備)，l-530型低溫離心機(jī)(塞維亞科技發(fā)展公司)，uv-2901型紫外可見分光光度計(jì)(hitachi公司)，bs-220型邁瑞全自動(dòng)生化分析儀(武漢盛世達(dá)設(shè)備)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.試驗(yàn)用藥的配制：甘草素-β-環(huán)糊精包合物溶液、甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物溶液。

每隔三天按照試驗(yàn)小鼠的實(shí)際重量按10mg·kg^-1的藥量分別配制甘草素-β-環(huán)糊精包合物溶液和甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物溶液儲(chǔ)存于4℃的冰箱中備用；

所述甘草素-β-環(huán)糊精包合物溶液配制的操作為：每1ml0.5％羧甲基纖維素鈉中加入含1mg甘草素的甘草素-β-環(huán)糊精包合物，用于對(duì)以下c組實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃使用；

所述甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物溶液配制的操作為：每1ml0.5％羧甲基纖維素鈉中加入含1mg甘草素的甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，用于對(duì)以下d組實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃使用。

2.實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)小鼠80只、雄性、四周齡、體重(22±2g)、spf級(jí)、正常飼養(yǎng)以及每天適應(yīng)性游泳20分鐘，三天后，按體重隨機(jī)分為四組：

a(安靜對(duì)照組)、b(耐力訓(xùn)練組)、c(耐力訓(xùn)練+甘草素-β-環(huán)糊精包合物組)、d(耐力訓(xùn)練+甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物組)每組20只。

每組實(shí)驗(yàn)小鼠每日下午1：00給藥，給藥的量為為按照小鼠的體重每千克灌10mg·kg^-1，10mg·kg^-1為小鼠每公斤體重灌的甘草素-β-環(huán)糊精包合物溶液中甘草素的量為10mg，10mg·kg^-1為小鼠每千克體重灌的甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物溶液中甘草素的量為10mg，a組和b組小鼠用等體積0.5％羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，連續(xù)6周，室溫為25±2℃。每日更換清潔墊料，每日更換清潔飲水瓶.每天稱小鼠體重一次并記錄。

3.小鼠耐力訓(xùn)練

a組只灌胃不進(jìn)行游泳訓(xùn)練，b、c、d組小鼠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳池中分別進(jìn)行每日遞進(jìn)式游泳鍛煉，水深為40～50cm，水溫為25士2℃。每周進(jìn)行5天訓(xùn)練，每天上午和下午各1次，上午9:00am開始訓(xùn)練，下午3：00pm開始訓(xùn)練，訓(xùn)練量如下表1：

表1耐力訓(xùn)練時(shí)間表

4.小鼠力竭游泳運(yùn)動(dòng)

按上述時(shí)刻表每天對(duì)各b、c、d組小鼠進(jìn)行兩次游泳訓(xùn)練，在訓(xùn)練第六周后進(jìn)行力竭游泳運(yùn)動(dòng)并記錄小鼠力竭游泳的時(shí)間，如下表2：

表2為試驗(yàn)小鼠力竭游泳時(shí)間

注：δ組與b組比較p＜0.01。

由表2中可得出，c組、d組試驗(yàn)小鼠的力竭游泳時(shí)間比其他組都長(zhǎng)，可見，甘草素-β-環(huán)糊精包合物溶液、及甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物能夠明顯延長(zhǎng)小鼠力竭游泳的時(shí)間，而游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以直接反映小鼠疲勞的程度，因此，說明甘草素能夠改善耐力訓(xùn)練小鼠的疲勞癥狀，提高小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生，具有抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的效果。

5.小鼠取材

宰殺小鼠前對(duì)使用器械進(jìn)行消毒滅菌。每組小鼠隨機(jī)取出10只小鼠不進(jìn)行游泳，直接取眼球血，立即預(yù)留80μl全血，剩余離血清。

再將小鼠處死，即刻用75％酒精為小鼠皮膚消毒，取肝臟，用4℃的生理鹽水清洗血液，用濾紙吸干生理鹽水，再稱重，將其迅速放于液氮中速凍。

每組小鼠中剩下10只小鼠進(jìn)行游泳訓(xùn)練100min，訓(xùn)練后取眼球血，每一只小鼠取血以后，預(yù)留80μl的全血，剩下的全血必須立即在3000rpm/min條件下，用低溫離心機(jī)(4℃)，離心15min，小心吸取血清保存于-80℃的冰箱。

6.檢測(cè)指標(biāo)

本實(shí)施例主要檢測(cè)甘草素-環(huán)糊精包合物對(duì)耐力訓(xùn)練小鼠的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的有關(guān)指標(biāo)。其中檢測(cè)指標(biāo)主要包括：肝糖原、血乳酸(bla)、尿素氮(bun)。

(1)酮一硫酸法測(cè)定小鼠肝糖原

試劑配制：

配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.01g的葡萄糖，溶解于10ml蒸餾水中。

配制5％三氯醋酸(tca)：準(zhǔn)確稱取5.0g三氯醋酸，溶解于100ml蒸餾水中。

配制蒽酮試劑：先配制72％的濃硫酸溶液，72％的濃硫酸溶液配制時(shí)，先在燒杯中加入140ml蒸餾水，邊攪邊緩緩加入比重為1.84的濃硫酸360ml，等到h2so4的溫度降到80-90℃時(shí)加入0.25g的蒽酮和5g的硫脲，搖勻，待冷卻后儲(chǔ)存于冰箱。

檢測(cè)步驟：以c組為例

對(duì)c組試驗(yàn)小鼠的肝糖原的提取計(jì)算：精確稱取c組的不游泳的10只小鼠的肝臟組織各100mg，分別加入8mltca，然后勻漿1min，以3000轉(zhuǎn)/min的速度離心15min，轉(zhuǎn)移上清液至另一支試管內(nèi)；取上清液1ml于10ml的離心管中，每管加入4ml95％乙醇，充分混勻，蓋緊離心管，保持豎立，常溫下過夜，以3000轉(zhuǎn)/min的速度離心15min；小心棄去上清液，倒立離心管10min至管內(nèi)無液滴存在；加入2ml蒸餾水，確保洗下管壁糖原，振蕩離心管使糖原完全溶解；向各管加入10ml蒽酮試劑，充分混合，待溫度降至涼水溫度后，再浸于沸水中加熱15min，轉(zhuǎn)移到冷水浴冷卻，在620nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度，得到第一組吸光度值。

為了數(shù)據(jù)更加精確，做三組平行實(shí)驗(yàn)，即，第二組平行試驗(yàn)為：繼續(xù)精確稱取c組的不游泳的10只小鼠的剩余肝臟組織各100mg，重復(fù)上述步驟，測(cè)定吸光度，得到第二組吸光度值；第三組平行試驗(yàn)為：再次精確稱取c組的不游泳的10只小鼠的剩余肝臟組織各100mg，重復(fù)上述步驟，測(cè)定吸光度，得到第三組吸光度值；

將上述三組平行試驗(yàn)的三組吸光度值分別代入肝糖原公式計(jì)算，得到c組的三組肝糖原數(shù)，再將三組肝糖原數(shù)求均值得到c組的肝糖原數(shù)。

作為對(duì)比試驗(yàn)方案，也可以分別配制空白管、標(biāo)準(zhǔn)管：

空白管：取2ml蒸餾水于干凈的試管中。

標(biāo)準(zhǔn)管：取葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5ml和蒸餾水1.5ml于標(biāo)準(zhǔn)管中，混勻。

然后在空白管和標(biāo)準(zhǔn)管中分別加入10ml蒽酮試劑，充分混合，待溫度降至涼水溫度后，再浸于沸水中加熱15min，轉(zhuǎn)移到冷水浴冷卻，在620nm波長(zhǎng)下，分別測(cè)定空白管吸光度和標(biāo)準(zhǔn)管吸光度。

同理，對(duì)a組、b組的試驗(yàn)小鼠的肝糖原的提取計(jì)算方法同于c組的方法，也對(duì)不游泳的10只小鼠的肝臟組織采用同于c組的方法提取計(jì)算肝糖原。如下表4。

肝糖原公式為：

每100克肝(肌)組織中糖原的毫克數(shù)＝du/ds×0.5×提取液體積/肝組織克數(shù)×100×0.9，式中，

ds：標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；

du：樣品管吸光度；

提取液體積為8ml；

肝組織克數(shù)為0.1g；

0.9為將葡萄糖換算成糖原的系數(shù)；

0.5為0.5ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液中葡萄糖的含量。

(2)用自配試劑方法測(cè)定小鼠血乳酸含量

試劑配制：

10％鎢酸鈉：稱取10g鎢酸鈉溶解于100ml蒸餾水中。

1/3mol/l硫酸：量取濃硫酸0.8ml于50ml容量瓶，用蒸餾水定容。

1％naf溶液：準(zhǔn)確稱取1.125gnaf溶解于100ml蒸餾水中。

10％的三氯醋酸：準(zhǔn)確量取三氯醋酸9.9ml，溶解于100ml蒸餾水中。

cuso4溶液：準(zhǔn)確稱取0.42gcuso4，溶于10ml蒸餾水中。

蛋白沉淀劑：將1/3mol/l的硫酸、10％的鎢酸鈉、蒸餾水按照體積比為1:1:1的比例混合。

蛋白沉淀劑-naf混合液：按體積分別取10ml1％naf和30ml蛋白沉淀劑混合。

1.5％對(duì)羥基聯(lián)苯溶液：稱取對(duì)羥基聯(lián)苯1.5g溶解于100ml熱的0.5％的naoh中。

乳酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1g/l)：稱取0.171g乳酸鈣，加入10％三氯醋酸中定容至100ml。

乳酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(0.01g/l)：吸取1.0ml乳酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，溶解于100ml容量瓶，用蒸餾水定容。

對(duì)c組試驗(yàn)小鼠的血乳酸的檢測(cè)步驟：

吸取0.48ml1％naf溶液于5ml離心管中，加入c組游泳的小鼠的全血20μl?；靹蚝?，加入1.5ml蛋白沉淀劑，用力振蕩混勻，在3000轉(zhuǎn)/min條件下，離心10min，取上清液，30℃水浴中加熱30min，再置于沸水浴中90s，待冷卻后，在560nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度值，即c組的吸光度值a樣品管，然后依據(jù)血乳酸含量計(jì)算公式計(jì)算得到c組血乳酸含量。

作為對(duì)比試驗(yàn)方案，也可以分別配制空白管、標(biāo)準(zhǔn)管，如下表3

表3血乳酸測(cè)定試驗(yàn)方案配制

將標(biāo)準(zhǔn)管至于30℃水浴中加熱30min，再置于沸水浴中90s，待冷卻后，在560nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度值，即c組的吸光度值a標(biāo)準(zhǔn)管，用于計(jì)算每一組的血乳酸含量。

同理，對(duì)a、b組試驗(yàn)小鼠的血乳酸的檢測(cè)步驟同于c組的檢測(cè)步驟，測(cè)定a、b組吸光度值，即a組的a樣品管、b組的a樣品管，計(jì)算得到a、b組血乳酸含量。如下表4。

血乳酸含量計(jì)算公式為：

血乳酸(mg/l)＝a樣品管/a標(biāo)準(zhǔn)管×100×10

(3)生化指標(biāo)測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)中，用全自動(dòng)生化分析儀分別對(duì)a、b、c組、d組中游泳的試驗(yàn)小鼠的血清進(jìn)行分析測(cè)定，進(jìn)而對(duì)各組試驗(yàn)小鼠的尿素氮(bun)的含量進(jìn)行測(cè)定。如表4。

7.試驗(yàn)結(jié)果

表4肝糖原、尿素氮和血乳酸

注：#與b組肝糖原比較p＜0.01；▼與b組尿素氮比較p＜0.01；■與b組血乳酸比較p＜0.01。

由表4可知，c組和d組的肝糖原含量高于a組、b組的肝糖原含量，可見，從能量代謝的角度可推斷甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物、甘草素-β-環(huán)糊精包合物能減小肝糖原的分解，或者能促進(jìn)肝糖原的合成，進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)耐力，有良好的抗運(yùn)動(dòng)疲勞效果。

c組、d組的血乳酸含量低于b組的血乳酸含量，可見，從乳酸堆積學(xué)說角度來推斷，甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物、甘草素-β-環(huán)糊精包合物能抑制或降低血乳酸的產(chǎn)生，或能夠分解血乳酸，進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)耐力，有良好的抗運(yùn)動(dòng)疲勞效果。

c組、d組的尿素氮含量低于b組的尿素氮含量，可見，從數(shù)據(jù)可推斷，甘草素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物、甘草素-β-環(huán)糊精包合物能抑制或降低尿素氮的產(chǎn)生，或能夠分解尿素氮，進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)耐力，有良好的抗運(yùn)動(dòng)疲勞效果。

以上所揭露的僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例而已，當(dāng)然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解實(shí)現(xiàn)上述實(shí)施例的全部或部分流程，并依本發(fā)明權(quán)利要求所作的等同變化，仍屬于發(fā)明所涵蓋的范圍。