本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種cd44-shrna/peg-mzf-nps復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的腫瘤之一，惡性程度很高，死亡率占婦科腫瘤的首位。由于卵巢癌在早期癥狀往往不明顯，不易早期發(fā)現(xiàn)，超過70％的患者就診時(shí)已為中晚期，5年生存率僅為25％。目前對(duì)卵巢癌的早期診斷尚缺乏特異有效的方法或手段。卵巢癌的治療目前主要以手術(shù)治療后輔以化療，但是常規(guī)化療副作用較大，且手術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高。因此，探索卵巢癌新型高效的早期診斷手段和治療方法意義重大。將多種手段有機(jī)結(jié)合對(duì)卵巢癌進(jìn)行聯(lián)合靶向診療已成為重要的研究方向?；蛑委熞殉蔀槔^腫瘤傳統(tǒng)手術(shù)、放療、化療后又一種新的治療手段，在腫瘤治療領(lǐng)域顯示了較好的應(yīng)用前景。腫瘤熱療是通過熱能殺死腫瘤細(xì)胞，不僅可以獨(dú)立應(yīng)用，還可以增強(qiáng)放化療的敏感性。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，將納米技術(shù)應(yīng)用于腫瘤的治療也日益受到關(guān)注。若能以磁性納米材料為載體，將基因治療與熱療有機(jī)結(jié)合，互補(bǔ)協(xié)同，有可能形成一種新的腫瘤聯(lián)合治療方法。

粘附分子cd44是細(xì)胞膜表面的一種跨膜糖蛋白，作為一種重要的透明質(zhì)酸受體(ha)，與細(xì)胞粘附、增殖、分化和遷移有關(guān)。cd44的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的評(píng)估中扮演著重要角色，尤其是卵巢癌組織，cd44表達(dá)率高達(dá)96.92％。研究表明：cd44表達(dá)高的卵巢癌患者，其臨床表現(xiàn)較重且tnm分期亦較高。高水平的cd44表達(dá)與卵巢癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。cd44可作為卵巢癌患者病理診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的有效指標(biāo)。因此，cd44有可能成為治療卵巢癌的新靶點(diǎn)。

基因治療是將外源性基因或者基因片段轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞中，對(duì)靶基因進(jìn)行干預(yù)的治療方法。目前基因治療方法被相繼運(yùn)用于多種腫瘤治療研究中，其中rnai(rnainterferencerna干擾)技術(shù)在腫瘤治療領(lǐng)域顯示了較好的應(yīng)用前景，該技術(shù)是利用雙鏈rna在細(xì)胞內(nèi)dicer內(nèi)切酶的識(shí)別、結(jié)合、酶切下產(chǎn)生有活性的長(zhǎng)度為21-23bp的小干擾rna(sirna)高效特異性地降解細(xì)胞內(nèi)同源mrna，阻斷目標(biāo)基因，從而產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)，抑制目標(biāo)基因活性。采用rnai進(jìn)行卵巢癌靶向治療，獲得了較好的治療效果。

高效、穩(wěn)定地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移是進(jìn)行基因治療的關(guān)鍵。伴隨著納米技術(shù)的發(fā)展，以納米顆粒為基因轉(zhuǎn)移載體得到廣泛研究。納米顆粒較易被修飾，具有良好的生物相容性和較少的免疫應(yīng)答，很容易進(jìn)入組織與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，或者被靶細(xì)胞吞噬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)運(yùn)，并在細(xì)胞內(nèi)釋放，具有較高的基因轉(zhuǎn)移效率。因此，納米載體成為極具應(yīng)用前景的新型載體系統(tǒng)。

磁性納米顆粒作為納米材料的一種，除了具有一般納米載體的功能外，由于其具有特殊的磁學(xué)性質(zhì)，可被應(yīng)用于磁共振成像。磁性納米材料在外加磁場(chǎng)的作用下產(chǎn)生和周圍組織不同的磁場(chǎng)敏感性，使t1和t2磁共振成像的弛豫時(shí)間發(fā)生變化。磁性納米顆粒在交變磁場(chǎng)的作用下能夠產(chǎn)生熱效應(yīng)，熱能不僅能增加化療藥物的功能，還可以對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向熱療。其中金屬氧化物顆粒fe3o4是應(yīng)用較多的磁性納米粒子。在納米氧化鐵結(jié)構(gòu)中加入錳、鋅等金屬元素可以制備成各種鐵氧體，其中mn0.6zn0.4fe2o4不僅具有載體、熱療的功能，還具有自動(dòng)控溫和恒溫的特征。

基于卵巢癌cd44基因高表達(dá)的特性，以及磁性納米粒靶向基因治療、單純磁流體熱療在腫瘤治療研究方面都顯示了良好的效果，前景廣泛，但作用仍顯單一，在腫瘤聯(lián)合治療原則的指導(dǎo)下，本研究設(shè)想：以mn0.6zn0.4fe2o4納米粒作為基因轉(zhuǎn)移載體，利用其優(yōu)良的磁響應(yīng)性和有效升溫控溫的效果，將cd44-shrna基因治療磁流體熱療有機(jī)結(jié)合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，有可能形成一種聯(lián)合靶向診療卵巢癌的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有基因治療存在的問題，本發(fā)明提供一種以peg修飾的mn0.6zn0.4fe2o4納米粒(peg-mzf-nps)為載體的攜載cd44-shrna抗腫瘤基因的復(fù)合物及其制備方法，該復(fù)合物在外加磁場(chǎng)作用下，可以將cd44-shrna基因治療與磁流體熱療有機(jī)結(jié)合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，對(duì)腫瘤進(jìn)行靶向治療，有效解決了現(xiàn)有技術(shù)的問題。

一種cd44-shrna/peg-mzf-nps復(fù)合物,是以peg-mzf-nps納米磁粒為載體，負(fù)載質(zhì)粒cd44-shrna。

本發(fā)明還公開了所述cd44-shrna/peg-mzf-nps復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

分別用無血清培養(yǎng)基稀釋peg-mzf-nps與cd44-shrna質(zhì)粒，室溫放置5分鐘以上，然后將二者混合混勻，室溫放置30分鐘以上，反應(yīng)物即為cd44-shrna/peg-mzf-nps復(fù)合物。

進(jìn)一步地，peg-mzf-nps與cd44-shrna質(zhì)粒質(zhì)量比優(yōu)選40:1。

本發(fā)明中為探討能否用peg-mzf-nps作為cd44-shrna基因轉(zhuǎn)移載體，將cd44-shrna轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)了peg-mzf-nps與cd44-shrna結(jié)合的生物學(xué)特性。瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示：當(dāng)納米磁粒(peg-mzf-nps)與cd44-shrna質(zhì)粒的質(zhì)量比為40:1時(shí)，peg-mzf-nps可以結(jié)合體系中的所有質(zhì)粒，該比例為最佳結(jié)合比，為后面的基因轉(zhuǎn)染時(shí)載體與質(zhì)粒量的配比提供了依據(jù)。

細(xì)胞外的核酸酶和細(xì)胞內(nèi)溶酶能夠降解外源性dna。安全、高效、可控的基因轉(zhuǎn)移方法是進(jìn)行基因治療的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用dnase-i消化實(shí)驗(yàn)來觀察磁性納米基因復(fù)合體的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：時(shí)間在1-60min內(nèi)的peg-mzf-nps與cd44-shrna質(zhì)粒復(fù)合物，其電泳圖譜中的條帶亮度沒有明顯改變，保持穩(wěn)定，裸露的cd44-shrna質(zhì)粒加入dnase-i消化后，約1min后幾乎完全消化，表明復(fù)合物穩(wěn)定性較好，peg-mzf-nps可以保護(hù)cd44-shrna免受核酸酶的消化。

基因治療中，基因轉(zhuǎn)移載體的選擇至關(guān)重要，作為基因載體，不僅要具有較好的組織相容性，在運(yùn)輸過程中能夠保護(hù)基因片段不被降解，到達(dá)靶細(xì)胞后還能夠有效地釋放。在本次納米磁粒(peg-mzf-nps)與cd44-shrna質(zhì)粒復(fù)合物的體外釋放實(shí)驗(yàn)中顯示，在1h、4h、8h、12h、24h、2d內(nèi)，dna釋放量增多，第3、第4天無明顯區(qū)別，表明peg-mzf-nps不僅能夠保護(hù)質(zhì)粒免于降解，在適當(dāng)?shù)臈l件下還能有效地釋放dna。

以peg-mzf-nps為載體將cd44-shrna質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞后，cd44基因表達(dá)明顯下降，其轉(zhuǎn)染效率為55.46±4.50％，提示peg-mzf-nps可以作為基因轉(zhuǎn)移載體應(yīng)用于基因治療。

本次實(shí)驗(yàn)用不同方法對(duì)卵巢癌ho8910細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)分為三組,分別為：陰性對(duì)照組；mfh組；cd44-shrna/mfh組，分別計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示cd44-shrna/mfh組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均明顯高于mfh組。表明磁熱療和cd44-shrna基因治療二者聯(lián)合能夠有效地抑制卵巢癌細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)其凋亡，效果明顯優(yōu)于單一磁流體熱療。

本發(fā)明采用的peg-mzf-nps(mn0.6zn0.4fe2o4)磁性納米材料體外磁感應(yīng)升溫實(shí)驗(yàn)中，在外加235khz、4kw、35a的高頻交變磁場(chǎng)條件下，不同濃度的peg-mzf-nps均能迅速升溫，0～20min升溫急劇，20～60min內(nèi)升溫平緩，并保持一定的恒溫，說明該材料有良好的升溫恒溫能力。其中濃度為60μg/ml的peg-mzf-nps在20min內(nèi)達(dá)到42℃～43℃，該溫度為腫瘤熱療的理想溫度，提示peg-mzf-nps可用于腫瘤的熱療研究；體外磁共振掃描顯示其具有作為磁共振t2弛豫造影劑的應(yīng)用潛能，有可能實(shí)現(xiàn)靶向診斷與治療一體化的目標(biāo)。

peg-mzf-nps與cd44-shrna結(jié)合，具有良好的生物學(xué)特性，peg-mzf-nps可以保護(hù)dna免受核酸酶的消化，并能在恰當(dāng)?shù)臈l件下有效地釋放dna。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)，peg-mzf-nps將cd44-shrna成功轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞，并有效地抑制了cd44基因的表達(dá)，顯示了peg-mzf-nps可作為基因轉(zhuǎn)移載體的可行性。

在外加交變磁場(chǎng)作用下，cd44-shrna/peg-mzf-nps復(fù)合物對(duì)卵巢癌細(xì)胞有較好的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，效果明顯優(yōu)于單一的磁流體熱療。

附圖說明

圖1為peg-mzf-nps在交變磁場(chǎng)中升溫曲線圖

圖2peg-mzf-nps的體外mri成像

圖3不同濃度的peg-mzf-nps的t2橫向弛豫時(shí)間r2

圖4為不同質(zhì)量比的peg-mzf-nps與cd44-shrna質(zhì)粒結(jié)合后的電泳圖譜；

泳道1：0:1(即100ng質(zhì)粒dna，未加peg-mzf-nps)；泳道2：5:1；泳道3：10:1；泳道4：20:1；泳道5：40:1；泳道6：80:1；marker：(takara，dl5000，從上至下標(biāo)準(zhǔn)帶依次為5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

圖5為peg-mzf-nps與cd44-shrna質(zhì)粒復(fù)合物的消化保護(hù)實(shí)驗(yàn)電泳圖譜

泳道1：100ng原始質(zhì)粒dnalane；泳道2：1小時(shí)；泳道3：4小時(shí)；泳道4：8小時(shí)；泳道5：12小時(shí)；泳道6：24小時(shí)；泳道7：48小時(shí)；泳道8：72小時(shí)；泳道8：96小時(shí)mark：dnamarker(takara，dl5000，從上至下標(biāo)準(zhǔn)帶依次為5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)

圖6為peg-mzf-nps磁性納米材料與cd44-shrna質(zhì)粒復(fù)合物的釋放實(shí)驗(yàn)電泳圖譜

lane1：100ng原始質(zhì)粒dna、lane2：復(fù)合物1分鐘、lane3：復(fù)合物10分鐘、lane4：復(fù)合物30分鐘、lane5：復(fù)合物45分鐘、lane6：復(fù)合物1小時(shí)

圖7卵巢癌8910細(xì)胞轉(zhuǎn)染cd44-shrna質(zhì)粒后cd44基因mrna的表達(dá)

圖8卵巢癌8910細(xì)胞轉(zhuǎn)染cd44-shrna質(zhì)粒后cd44蛋白的表達(dá)

具體實(shí)施方式

為了理好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖、具體材料對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的具體限定。本發(fā)明中所采用的材料如下：

cd44-shrna購于碧云天生物

cd44-shrna-egfp購于碧云天生物

納米材料：peg-mzf-nps購于南京東納生物科技有限公司。

實(shí)施例：

1.1peg-mzf-nps在交變磁場(chǎng)中的升溫實(shí)驗(yàn)

配制濃度為20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的peg-mzf-nps磁流體，分別取500μl置于平底試管中，將溫度計(jì)直接插入試管中(避免接觸到試管壁)，啟動(dòng)交變磁場(chǎng)，參數(shù)設(shè)置為235khz、4kw、35a，磁感應(yīng)線圈直徑為3cm，試管底部距磁感應(yīng)線圈約0.5cm，每隔5min記錄一次溫度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，溫度為縱坐標(biāo)，繪制peg-mzf-nps磁性納米材料的升溫曲線。peg-mzf-nps在交變磁場(chǎng)中的升溫特性見圖1，60μg/ml的磁流體在20min內(nèi)能升溫至43℃左右，并保持穩(wěn)定，可用于腫瘤的熱療。

1.2peg-mzf-nps的體外磁共振成像(mri)研究

將濃度為0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28μg/ml的peg-mzf-nps置于含1％瓊脂糖的ependoff管中，對(duì)照組為加入去離子水的瓊脂糖。采用7.0tmicro-mr掃描儀，內(nèi)徑3.0cm的體線圈，set2w1序列，參數(shù)設(shè)置如下：重復(fù)時(shí)間tr2500ms，回波時(shí)間te36ms，層厚1.0mm，fov4cmx3.5cm，矩陣256×256。讀取各樣本相應(yīng)的t2值，之后在origin下作r2曲線(r2＝1/t2)，由此得出各濃度樣品的r2弛豫率。

從磁共振成像(圖2)上可以觀察到，隨著peg-mzf-nps濃度增加，其t2w1信號(hào)明顯降低，測(cè)量出各濃度材料的t2值，由此得出peg-mzf-nps材料的弛豫率r2＝6.06(μg/ml^-1s^-1)，見圖3,提示peg-mzf-nps具有作為磁共振t2弛豫造影劑的應(yīng)用潛能。

1.3peg-mzf-nps與cd44-shrna質(zhì)粒結(jié)合實(shí)驗(yàn)

將peg-mzf-nps與cd44-shrna質(zhì)粒按照質(zhì)量比0:1、5:1、10:1、20:1、40:1、80:1進(jìn)行混合(質(zhì)粒dna的終濃度為20ng/μl，用超純水補(bǔ)足總體積20μl)，室溫放置30分鐘，以充分反應(yīng)形成復(fù)合物。分別取5μl復(fù)合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(即100ng/泳道)，查看結(jié)合情況，并篩選出納米磁粒與質(zhì)粒dna的最佳結(jié)合比例。

納米磁粒(peg-mzf-nps)與cd44-shrna質(zhì)粒結(jié)合實(shí)驗(yàn)的瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示，按0:1、5:1、10:1、20:1、40:1加入質(zhì)粒，泳道可見清晰的條帶；從電泳圖可見，當(dāng)納米磁粒與cd44-shrna的質(zhì)量比為40:1時(shí)，基本可以結(jié)合體系中所有的質(zhì)粒，提示質(zhì)量比為40:1是納米磁粒與cd44-shrna結(jié)合的最佳比例，見圖4。

1.4peg-mzf-nps對(duì)cd44-shrna質(zhì)粒的dnase-i消化保護(hù)實(shí)驗(yàn)

將peg-mzf-nps與質(zhì)粒cd44-shrna按照質(zhì)量比40:1混合形成復(fù)合物，加入tangobuffer(thermo)及dnase-i酶，37℃水浴，分別消化1分鐘、10分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)，迅速用等體積的100mmol/l的edta溶液終止反應(yīng)。用sds將復(fù)合物中的質(zhì)粒洗脫下來，苯酚、氯仿抽提、無水乙醇沉淀、75％的乙醇洗滌干燥后，溶于適量的超純水中，取等體積的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。裸露的質(zhì)粒dna同樣方法處理，作為對(duì)照。

經(jīng)dnase-i酶消化1-60min的peg-mzf-nps與cd44-shrna復(fù)合物，其電泳圖譜中的條帶亮度沒有明顯改變，保持穩(wěn)定；裸露的cd44-shrna質(zhì)粒加入dnase-i酶消化后，約1min后幾乎完全消化，泳道上已經(jīng)看不到條帶，提示peg-mzf-nps可以有效保護(hù)該質(zhì)粒免受dnase-i酶的消化，見圖5。

1.5peg-mzf-nps/cd44-shrna的dna釋放實(shí)驗(yàn)

將磁性納米材料peg-mzf-nps與cd44-shrna質(zhì)粒按照質(zhì)量比40:1混合形成復(fù)合物，質(zhì)粒的量(10μg)用te溶液混至500ul，至37℃恒溫?fù)u床200rpm振蕩。分別于1小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)取樣8μl，最終各5μl/孔進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

結(jié)果顯示，在1h、4h、8h、12h、24h、2d內(nèi)，dna釋放量增多，第3天、第4天無明顯區(qū)別，peg-mzf-nps不僅能夠保護(hù)質(zhì)粒免于降解，而且在適當(dāng)?shù)臈l件下能有效地釋放dna，見圖6。

1.6cd44-shrna質(zhì)粒經(jīng)peg-mzf-nps轉(zhuǎn)染卵巢癌ho8910細(xì)胞后cd44基因表達(dá)的檢測(cè)

1.6.1peg-mzf-nps轉(zhuǎn)染法將cd44-shrna-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ho8910細(xì)胞。

peg-mzf-nps轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞用含10％fbs無抗生素的培養(yǎng)液，按照(1-4)×10⁵/孔密度接種于孔板中，以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)80％左右；轉(zhuǎn)染時(shí)，將同樣量的表達(dá)質(zhì)粒(cd44-shrna)和空載psilencer3.1-h1neo質(zhì)粒稀釋于100μl無抗生素?zé)o血清的培養(yǎng)液中；將peg-mzf-nps稀釋于100μl無抗生素?zé)o血清的培養(yǎng)液中，室溫靜置20min；將稀釋后的cd44-shrna-egfp和peg-mzf-nps混合(peg-mzf-nps和dna質(zhì)量比為40:1)，室溫靜置30min，使之形成cd44-shrna-egfp/peg-mzf-nps復(fù)合物。其間，將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)液換成新鮮的含10％fbs無抗生素培養(yǎng)液，400μl/孔；每孔加入cd44-shrna-egfp/peg-mzf-nps復(fù)合物200μl；充分混勻后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)6h之后，棄上清，用pbs洗細(xì)胞1次，加入新鮮含10％fbs的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)peg-mzf-nps的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，peg-mzf-nps轉(zhuǎn)染法將cd44-shrna-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為(55.46±4.50)％，證實(shí)了peg-mzf-nps作為基因轉(zhuǎn)移載體的可行性

1.6.2cd44-shrna干預(yù)ho8910細(xì)胞后cd44基因表達(dá)檢測(cè)

卵巢癌ho8910細(xì)胞中經(jīng)peg-mzf-nps轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和cd44-shrna質(zhì)粒24h后，real-timepcr方法檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染cd44-shrna質(zhì)粒后，能有效抑制ho8910細(xì)胞中cd44的mrna的表達(dá)水平(圖7)。westernblot方法檢測(cè)顯示cd44-shrna干預(yù)治療后，ho8910細(xì)胞中cd44的蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖8)，進(jìn)一步證實(shí)了peg-mzf-nps能將cd44-shrna轉(zhuǎn)移到卵巢癌細(xì)胞，并抑制cd44基因的表達(dá)。

2.peg-mzf-nps/cd44-shrna復(fù)合物的制備

分別用無血清培養(yǎng)基稀釋peg-mzf-nps與cd44-shrna質(zhì)粒，室溫放置5分鐘以上，然后將二者混合混勻(peg-mzf-nps與cd44-shrna質(zhì)粒質(zhì)量比40:1)，室溫放置30分鐘以上，反應(yīng)物即為cd44-shrna/peg-mzf-nps復(fù)合物。

2.1cd44-shrna/peg-mzf-nps納米脂質(zhì)體對(duì)ho8910細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用

將ho8910細(xì)胞接種于含10％胎牛血清的imem培養(yǎng)液中，置于37℃、飽和濕度、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：a組為陰性對(duì)照組；b組為mfh組；c組為cd44-shrna/mfh組。a組加入生理鹽水，b組加入peg-mzf-nps磁流體；c組加入peg-mzf-nps/cd44-shrna(質(zhì)量比40:1)復(fù)合物；mfh組(b、c組)細(xì)胞放入spg-10a-ii高頻磁感應(yīng)加熱儀平板線圈上加熱1h，陰性對(duì)照組(a組)室溫放置1h，然后將各組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，mtt方法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖的抑制率，細(xì)胞增殖抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組od值/對(duì)照組od值)×100，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

結(jié)果顯示，cd44-shrna/peg-mzf-nps復(fù)合物磁感應(yīng)加熱組(cd44-shrna/mfh組)細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均明顯高于單純的磁流體熱療組(見表1和表2)，顯示了cd44-shrna、磁熱聯(lián)合治療的明顯優(yōu)勢(shì)。

表1cd44-shrna/peg-mzf-nps復(fù)合物磁感應(yīng)加熱對(duì)卵巢癌細(xì)胞ho8910增殖抑制作用

^ap＜0.001與陰性對(duì)照組對(duì)比；^bmfh組對(duì)比；^ep＜0.001與cd44-shrna/mfh組對(duì)比

表2cd44-shrna/peg-mzf-nps復(fù)合物磁感應(yīng)加熱對(duì)卵巢癌細(xì)胞ho8910的凋亡誘導(dǎo)作用

。