專(zhuān)利名稱：一種p28^GANK單克隆抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種p28eAffi單克隆抗體及其用于制備肝癌的預(yù)后評(píng)估制劑或肝癌治療藥物的用途。
背景技術(shù)：
p28GANK是存在于人肝細(xì)胞中的一種蛋白，通常在正常細(xì)胞中含量較少，但在肝癌細(xì)胞中含量很高。它的編碼框包含2 個(gè)氨基酸，分子量為25kDa，含有6個(gè)重復(fù)ankyrin 序列，GeneID :5716。本發(fā)明人曾制備了兔抗人p28eANK多克隆抗體用于肝癌鑒別診斷并申請(qǐng)了專(zhuān)利(詳見(jiàn)《肝癌鑒別診斷用P^抗體及其制備》，專(zhuān)利號(hào)ZL 03116825. 6)。近來(lái)有報(bào)道p28GAffi主要是通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)、NF-κ B、P53及Rb 信號(hào)通路發(fā)揮其促癌作用。？觀—直接結(jié)合徹認(rèn)/順-^加速順-^出核；P^ganK結(jié)合泛素蛋白連接酶MDM2介導(dǎo)p53的泛素化降解；p^GANK結(jié)合腫瘤抑制蛋白R(shí)b并驅(qū)動(dòng)Rb的核內(nèi)磷酸化失活及核轉(zhuǎn)錄因子E2F-1釋放，加速細(xì)胞周期(Gastroenterology 2005 ；128 2029-2041 ；CellResearch 2009Nov ； 19 (11) :1243-57. ；2007Dec ；17 (12) :1020-9)。曾有報(bào)道影響肝癌預(yù)后的因素主要是腫瘤大小和血管侵犯，并通常伴隨腫瘤多發(fā)性。目前，越來(lái)越多的研究表明預(yù)判肝癌的復(fù)發(fā)尚需發(fā)掘其他更為有效的預(yù)后因素。以往研究提示p28eAffi在肝癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用，但是它如何調(diào)控肝癌進(jìn)程尚不明確，至今未見(jiàn)PZSmm的表達(dá)水平可直接作為肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)后判斷因素，以及用于肝癌個(gè)性化治療的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種P^mnk單克隆抗體，并將其用于制備肝癌預(yù)后檢測(cè)試劑或用于制備治療肝癌的藥物。本發(fā)明人根據(jù)肝癌中MSgam蛋白的高表達(dá)現(xiàn)象，研究了 MSgank對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛋白P^gank可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，即P^gmk能夠通過(guò)調(diào)控 PI3K-AKT-HIF1 α通路促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移，并且p28eAffi蛋白的表達(dá)強(qiáng)弱與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。如果用它的單克隆抗體特異識(shí)別反映出肝病患者組織樣本中p28eANK的本底表達(dá)水平，就能對(duì)患者的預(yù)后作出預(yù)判分析；進(jìn)而設(shè)想，如果用相應(yīng)單克隆抗體抑制p28eAffi功能， 阻斷p28eMK的促癌作用，就有可能對(duì)那些自身肝臟中P^mnk本底表達(dá)水平較高的患者起到個(gè)性化的治療效果。所以P^mnk的單克隆抗體可以用于肝癌的預(yù)后判別以及個(gè)性化治療。 本發(fā)明制備了 P^mm的單克隆抗體，并提供了新用途。本發(fā)明的鼠抗人p28eAffi單克隆抗體的制備方法如下1.針對(duì)p28eANK的編碼框氨基酸全序列設(shè)計(jì)并合成3個(gè)多肽，序列分別為多肽1:131-145，NPDAKDHYEATAMHRC多肽2 180-194，CDEERVEEAKLLVSQ多肽3 199-214，YIENKEEKTPLQVAKGC ；
2.將上述多肽分別與鑰孔慽血蘭蛋白(keyholelimpet hemocyanin，KLH)耦聯(lián)， 作為免疫原免疫小鼠；3.取免疫鼠的脾細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合；4.經(jīng)多輪篩選出合成多肽反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞克隆，作為抗人PZSmm蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；5.通過(guò)在小鼠體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)腹水抗體，將腹水進(jìn)行純化，得到抗人 p28GAffi的單克隆抗體。本發(fā)明提供了抗人p28eMK的單克隆抗體，該單克隆抗體識(shí)別分別位于p28eAffi氨基酸序列 NPDAKDHYEATAMHRC、CDEERVEEAKLLVSQ 和 YIENKEEKTPLQVAKGC 的抗原表位。本發(fā)明中的多肽可用多肽合成儀合成。多肽片段可用戊二醛連接法等與KLH等載體蛋白耦聯(lián)，作為免疫原免疫小鼠，并用于單克隆抗體篩選?？谷藀28eANK的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株可采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的方法制備。比如，取經(jīng)免疫的小鼠的脾細(xì)胞，與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞如SP2/0細(xì)胞融合，經(jīng)篩選后即可獲得雜交瘤細(xì)胞。單克隆抗體的獲得可采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的方法，即通過(guò)在小鼠體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞并產(chǎn)生腹水抗體，取出腹水經(jīng)純化而得到。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株，也稱雜交瘤細(xì)胞系160CT8531和161CT7112，所制備的單克隆抗體是一種免疫球蛋白，可特異性結(jié)合人p28eMK蛋白。經(jīng)鑒定，所制備的免疫球蛋白是 IgG型的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了上述抗人p28eAffi的單克隆抗體在檢測(cè)肝病患者預(yù)后判別中的應(yīng)用，其中的檢測(cè)是指Western Blot和免疫組化檢測(cè)。本發(fā)明為P^mnk的臨床個(gè)性化治療應(yīng)用提供了新的思路。


圖1.是單克隆抗體Western Blot檢測(cè)人p28GAffi蛋白的掃描圖。其中，泳道1，3，5是肝癌細(xì)胞SMMC-7721裂解液，泳道2，4，6是含有外轉(zhuǎn) myc-p28GANK的細(xì)胞系SMMC_7721-p^GANK裂解液。一標(biāo)識(shí)的是外源性p28GAffi。圖2.是單克隆抗體p28GAffi免疫組化檢測(cè)人P^gank蛋白的組織切片圖，其中，A為單克隆抗體160CT8531免疫組化檢測(cè)的肝癌組織Q00X)；B為單克隆抗體161CT7112免疫組化檢測(cè)的肝癌組織Q00X)。圖3.是單克隆抗體P^gank免疫組化檢測(cè)200例人肝癌樣本中P^gank表達(dá)水平后統(tǒng)計(jì)分析對(duì)患者預(yù)后(無(wú)瘤生存率Disease-Free Survival和總生存率Overall Survival)的曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。實(shí)施例1.抗人p28eAffi的單克隆抗體的制備和純化1.抗原的合成和耦聯(lián)抗原多肽合成設(shè)計(jì)參考GenBank，GeneID :5716，具體序列% NPDAKDHYEATAMHRC (SEQ ID NO 1) , CDEERVEEAKLLVSQ (SEQ ID NO :2)， YIENKEEKTPLQVAKGC(SEQ ID NO :3)，由百奇生物科技(上海)有限公司通過(guò)多肽自動(dòng)合成儀用固相多肽合成法合成。多肽與鑰孔慽血蘭蛋白(KLH)的耦聯(lián)采用《分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》第2版，薩姆布魯克著，金冬雁譯，科學(xué)出版社，北京，1999，第865頁(yè)描述的戊二醛連接法。2.單克隆抗體的制備和純化將上述1中純化的多肽KLH偶聯(lián)物100 μ g以PBS稀釋后與等體積完全弗氏佐劑 (CFA)混勻乳化，免疫5-6周齡的雌性BALB/c小鼠5只，雙肩周?chē)钠つw下進(jìn)行皮下注射和后雙腿進(jìn)行肌肉注射，每個(gè)區(qū)域大約用1/8的免疫原，將剩余免疫原的1/2進(jìn)行腹腔注射。 1周后加強(qiáng)免疫50 μ g，完全弗氏佐劑，腹腔注射。2周后加強(qiáng)免疫50 μ g，不完全弗氏佐劑 (IFA)，腹腔注射。3周及以后，每周直接腹腔注射50 μ g加強(qiáng)免疫。第5周起，每周尾靜脈采血，ELISA測(cè)定效價(jià)，應(yīng)用多肽KLH偶聯(lián)物抗原1. 25 μ g/ml包被，10% FCS封閉，將血清稀釋后加入，應(yīng)用羊抗小鼠IgG標(biāo)記HRP作為二抗，OPD顯色，使用酶標(biāo)儀(Bio-Rad550型) 在492nm讀數(shù)。第4次采血的ELISA結(jié)果OD值均大于0. 75。取傳染了人p28GAM蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系SMMC-7721/p28GANK 1 X IO6個(gè)，用細(xì)胞裂解液裂解后，常規(guī)flfestern Blot檢測(cè)。在免疫小鼠的同時(shí)準(zhǔn)備小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)。最后一次加強(qiáng)免疫3天后，取Wfestern Blot和免疫組化檢測(cè)效果最好的小鼠的脾細(xì)胞，與SP2/0細(xì)胞比例5 1，在PEG1500的作用下進(jìn)行融合反應(yīng)，植入96孔板，37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)14天后，鏡下檢測(cè)生長(zhǎng)出克隆細(xì)孔為融合陽(yáng)性孔，計(jì)算總?cè)诤下?gt;95%。盡量選擇單克隆細(xì)胞孔的上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。ELISA陽(yáng)性的克隆用Western Blot和免疫組化檢測(cè) SMMC-7721/p28GANK細(xì)胞，篩選出來(lái)的克隆亞克隆兩次，每次flfestern Blot和免疫組化檢測(cè)效果最好的克隆。篩選得到3個(gè)克隆。6-8周齡的雌性BALB/c小鼠用石蠟油腹腔注射10天后，取雜交瘤細(xì)胞以2X106 個(gè)細(xì)胞/只進(jìn)行腹腔注射。7-14天后從小鼠腹腔抽出富含抗體的腹水進(jìn)行檢測(cè)和純化。純化采用ftOteinG親和層析法。ftOteinG親和層析柱用PBS平衡柱子后取腹水過(guò)柱，然后用PBS洗柱至OD值接近零，以50nmol/L的甘氨酸鹽酸溶液洗脫，收集洗脫液，測(cè)定各收集管的OD值，保留峰值區(qū)的洗脫液，透析純化。實(shí)施例2.抗人p28eAffi的單克隆抗體的鑒定和檢測(cè)應(yīng)用1.單克隆抗體的Wfestern Blot檢測(cè)應(yīng)用變性的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳；通過(guò)電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Schleicher&Schell 公司)；含 5% BSA 的 TBST 封閉 lh，TBST 洗一次，5min ；含 4% BSA 的TBST稀釋抗p28GAM單克隆抗體一抗(1 μ g/ml)，孵育濁，TBST洗三次，每次5min ；含4% BSA的TBST稀釋IR-800標(biāo)記的抗小鼠二抗，孵育lh，TBST洗四次，每次5min ；用紅外線激光掃描儀Odyssey掃描。結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明該單克隆抗體能較為特異地識(shí)別人p28eMK 分子。2.單克隆抗體的免疫組化檢測(cè)應(yīng)用切片置于60°C恒溫箱中烘烤20分鐘并脫蠟；3% H2O2 (80%甲醇)室溫10分鐘滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS洗3次各5分鐘。0. OlM枸櫞酸鈉緩沖液(pH6. 0)高壓修復(fù)抗原，PBS洗3次各5分鐘；山羊血清封閉，室溫20分鐘，甩去多余液體；滴加以抗體稀釋液稀釋的抗p28GAM單克隆抗體一抗(10 μ g/ml)，室溫孵育池，PBS洗3次各5分鐘；滴加HRP標(biāo)記的二抗50 μ 1，室溫孵育lh，PBS洗3次各5分鐘；DAB顯色5_10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS洗3次各5分鐘；蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗10-15分鐘； 脫水、透明、封片、拍照。結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，該單克隆抗體能較為特異地識(shí)別人PZSmm分子。3.抗人p28eANK單克隆抗體針對(duì)肝癌患者的預(yù)后判斷應(yīng)用①運(yùn)用肝癌組織芯片(其中包含隨機(jī)選取2001年-2006年在上海東方肝膽外科醫(yī)院行肝癌根治術(shù)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者標(biāo)本200例)，相應(yīng)標(biāo)本具有完善病史及隨訪資料記錄入選患者的性別、年齡，腫塊大小、腫塊象限、具體病理亞型、免疫組化結(jié)果、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、門(mén)脈癌栓、肝內(nèi)血管侵犯等情況。記錄術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間(Disease-Free Survival, DFS)、總生存時(shí)間(Overall Survival, OS)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。②p28GAffi表達(dá)檢測(cè)及評(píng)估利用免疫組化方法檢測(cè)組織芯片中P^gam的表達(dá)情況，計(jì)算出每張照片中p28eAffi的表達(dá)強(qiáng)度，并通過(guò)計(jì)算得出每位患者癌及癌旁組織中p28eMK 的平均表達(dá)強(qiáng)度。利用統(tǒng)計(jì)軟件分析p28eMK的表達(dá)與肝癌患者各種臨床特征及預(yù)后參數(shù) (總生存率、無(wú)瘤生存率、總生存時(shí)間、無(wú)瘤生存時(shí)間等)的關(guān)系，制成曲線圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。 結(jié)果表明，該抗體檢測(cè)到的樣本本底p28eAffi的表達(dá)強(qiáng)弱與患者預(yù)后密切相關(guān)。
權(quán)利要求
1.一種抗人p28eANKm單克隆抗體的制備方法，步驟如下a)合成作為半抗原的多肽，其序列如SEQID NO :1_3所示；b)將上述多肽與匙孔慽血藍(lán)蛋白KLH偶聯(lián)，作為免疫原免疫小鼠；c)取免疫鼠的脾細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合；d)經(jīng)多輪篩選出與合成多肽反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞克隆，作為抗人p28eAffi單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株保藏號(hào)為；e)通過(guò)在小鼠體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生腹水抗體，將腹水進(jìn)行純化，得到抗人p28eMK 的單克隆抗體；或者通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)，分離純化，得到抗人p28eANK的單克隆抗體。
2.權(quán)利要求1所述方法制備的抗人p28eAffi的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述的抗人p28GANK的單克隆抗體在制備肝癌患者預(yù)后評(píng)估分析Western Blot和免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的抗人p28eMK單克隆抗體在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種p28GANK單克隆抗體及其用于制備肝癌的預(yù)后評(píng)估制劑或肝癌治療藥物的用途。p28GANK蛋白在肝癌細(xì)胞中表達(dá)異常升高，并且其表達(dá)強(qiáng)弱與患者預(yù)后密切相關(guān)，因此p28GANK在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用已被日益重視。本發(fā)明提供了抗人p28GANK的單克隆抗體，還提供了該抗人p28GANK的單克隆抗體在檢測(cè)判別肝癌患者預(yù)后分析和個(gè)性化治療中的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明為p28GANK的臨床個(gè)性化治療應(yīng)用提供了新的思路。
文檔編號(hào)C12N5/18GK102532313SQ201010585000
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者付靜, 王紅陽(yáng), 羅韜, 胡棟平, 董立巍, 陳瑤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)