專利名稱：一種基于gc-ms技術(shù)診斷早期肝癌的模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于早期診斷肝癌的模型，為肝癌的早期診斷提供了實驗基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
肝癌(liver cancer)是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤，肝癌起病常隱匿，多在肝病隨訪中或體檢普查中應(yīng)用AFP及B型超檢查偶然發(fā)現(xiàn)肝癌。此時病人既無癥狀，體格檢查亦缺乏腫瘤本身的體征，此期稱之為亞臨床期。早期癥狀肝癌從第一個癌細(xì)胞形成發(fā)展到有自覺癥狀，大約需要2年時間，在此期間，病人可無任何癥狀或體征，少數(shù)病人會出現(xiàn)食欲減退，上腹悶脹、乏力等，有些病人可能輕度肝腫大。肝癌一旦出現(xiàn)癥狀，而來就診者其病程大多已進(jìn)入中晚期。中、晚期癥狀肝癌的典型癥狀和體征一般出現(xiàn)于中、晚期，主要有肝痛、乏力、消瘦、黃疸、腹水等。臨床上一般采取西醫(yī)的手術(shù)、放化療與中藥結(jié)合療法，但晚期患者因癌細(xì)胞擴(kuò)散而治愈率較低，因此做到肝癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療具有非常重要的意義。系統(tǒng)生物學(xué)包括基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等。后者是效仿前兩者的研究思想，對生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系的研究方式。其研究對象大都是相對分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。代謝組學(xué)的分析技術(shù)包括GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)、LC-MS (液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)、NMR (核磁共振)等。氣相色譜主要是讓混合物由氦氣流動相攜帶通過一根長長的內(nèi)壁涂有薄薄的一層液態(tài)固定相的毛細(xì)柱。由于混合物的不同組分與固定相的結(jié)合能力不同，因此在柱的末端混合物中的各個組分會逐個地被洗脫出來而達(dá)到分離的目的。然后進(jìn)入質(zhì)譜儀，質(zhì)譜是先將物質(zhì)離子化，變?yōu)闅鈶B(tài)離子混合物，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度而實現(xiàn)分析目的。具有較高的靈敏度和專屬性，可以實現(xiàn)對多個化合物的同時快速分析與鑒定。本發(fā)明利用代謝組學(xué)中GC-MS這一技術(shù)，建立了一種可用于早期診斷肝癌的模型，為肝癌的早期診斷提供了實驗基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用Agilent GC-MS系統(tǒng)，檢測早期肝癌患者和正常人血清的代謝物輪廓，利用軟件分析早期肝癌患者與正常人血清不同的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)新的早期肝癌相關(guān)性有機(jī)物，用于診斷早期肝癌。本發(fā)明將早期肝癌患者和健康人血清分別利用Agilent公司GC-MS上機(jī)檢測，得到原始數(shù)據(jù)，根據(jù)質(zhì)荷比m/z從OTST質(zhì)譜庫中找出相匹配的化合物。采用峰面積歸一化方法進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，數(shù)據(jù)校正后運用統(tǒng)計學(xué)的方法計算每種化合物在不同組樣品中差異的顯著性，以P值0. 05為閾值，判斷ρ值小于閾值的化合物為檢測含量有顯著性差異的化合物，篩選出在兩組中有顯著差異的Peak。然后進(jìn)行PCA分析，PCA是可以將分散在η維變量上的代謝指紋圖譜信息集中到某幾個綜合指標(biāo)(主成分)上的統(tǒng)計分析方法。通過這個分析可以初步判斷樣品之間的關(guān)系，并可以判斷是否有個別樣品的數(shù)據(jù)偏離較大而需要被剔除掉。最后確定出差異的標(biāo)志性代謝峰有3個，其質(zhì)荷比分別為m/Z246、m/Z278、m/Z549。利用這3種代謝物，將受檢人血清中相應(yīng)的物質(zhì)的濃度與本發(fā)明模型的平均濃度逐一進(jìn)行比對，可為早期肝癌的診斷提供指導(dǎo)。模型的檢測方法如下1.樣品采集分別采集早期肝癌患者和正常人對照外周靜脈血，靜置，離心后，取上清液置于-80°C保存?zhèn)溆谩?.色譜條件優(yōu)化包括色譜流動相的選擇，流動相梯度條件的優(yōu)化，以及色譜柱溫度和最佳流速的優(yōu)化，以達(dá)到最佳的分離效果。3.質(zhì)譜條件優(yōu)化包括離子源類型的選擇及其參數(shù)的設(shè)定，使得峰圖更加優(yōu)化。4.預(yù)實驗及上樣檢測取預(yù)處理后的血清樣品注入進(jìn)樣孔，進(jìn)行相關(guān)系數(shù)的設(shè)置。5.測試報告的分析獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)校正后，運用統(tǒng)計學(xué)方法找出含量明顯差異的物質(zhì)，運用PCA分析，將偏離較大的物質(zhì)剔除掉，最后得到標(biāo)志性差異代謝物。


圖1三個峰在各樣本中的峰高灰色直線左側(cè)為正常組，右側(cè)為早期肝癌組。Peak6. 653表示m/z246的代謝物，peak7. 358表示m/z278的代謝物，peak6. 764表示m/z549的代謝物。圖2發(fā)現(xiàn)的三個特征峰對正常組(normal)和早期肝癌組(cancer)的分類圖中圓圈為正常組，方形為早期肝癌組。
具體實施例方式1.材料1. 1樣品采集分別使用抗凝管采集正常組和早期肝癌組靜脈血2ml，在4°C冰箱中靜置30min后離心GOOOrpm，5min).取200ul上清液分裝于低吸附離心管中，_80°C冰箱中保存，備用。1. 2所需主要試劑與儀器乙腈、氯苯丙氨酸、甲醇、硅烷化衍生試劑等均購自上?；瘜W(xué)試劑公司。AgilentGC-MS系統(tǒng)購自Waters公司。2.方法2.1高豐度蛋白的去除樣品室溫下融化，加入IOOul的乙腈，渦旋混勻Imin后超聲波萃取^iiin。形成的懸浮液再離心14000rpm，IOmin, 10°C。最后取200ul上清液置于GC-MS進(jìn)樣瓶中，在氮氣下將溶液完全吹干。
2. 2樣品衍生化加入IOOul的硅烷化衍生試劑，90°C下反應(yīng)lh，冷卻至室溫。2. 3GC-MS 預(yù)實驗取Iul的樣品量進(jìn)行預(yù)實驗，調(diào)整相關(guān)系數(shù)，得到最佳的質(zhì)譜圖。2. 4正式實驗將樣品一個一個地注入GC-MS系統(tǒng)，打出圖譜，得到原始數(shù)據(jù)。2. 5數(shù)據(jù)分析對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，以0. 05的ρ值為閾值，運用統(tǒng)計學(xué)方法找出差異明顯的物質(zhì)，利用PCA分析，將偏差較大的物質(zhì)剔除掉，最后得到3種標(biāo)志性差異代謝物分別為m/z246、m/z278、m/z549。利用這3種物質(zhì)，將受檢人血清中相應(yīng)的物質(zhì)的濃度與本發(fā)明模型逐一進(jìn)行比對，可為肝癌的早期診斷提供輔助指導(dǎo)。實驗實例取受檢者血清，經(jīng)檢驗得到其代謝產(chǎn)物圖譜，得到質(zhì)荷比分別為m/Z246、m/Z278、m/z549的特異代謝物的含量，與本實驗中的對應(yīng)樣品的平均含量進(jìn)行比較，若含量近似為本模型平均含量的2倍，則為早期肝癌組，否則為正常組。以上是對本發(fā)明的描述而非限定，基于本發(fā)明思想的其它實施方式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
權(quán)利要求
1.用于早期肝癌診斷的模型，其特征在于由氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測的代謝物圖譜，經(jīng)過軟件統(tǒng)計分析得到早期肝癌患者多個特異代謝物的濃度，所說的特異代謝物的質(zhì)荷比分別為 m/z246、m/z278、m/z549。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于診斷早期肝癌的模型。本發(fā)明運用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，檢測正常人及早期肝癌患者的外周血清樣品，找出與早期肝癌患者差異顯著的特異代謝產(chǎn)物，根據(jù)各代謝產(chǎn)物的濃度與正常人含量的平均值，建立一個診斷模型。只要將檢測人血清中三種相應(yīng)的代謝產(chǎn)物的濃度與本發(fā)明的模型進(jìn)行比較分析，就可以初步用于早期肝癌診斷。
文檔編號G01N30/72GK102375039SQ20101025807
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者曾華宗 申請人:曾華宗