納米復合材料的甲胎蛋白的電致化學發(fā)光免疫傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及電致化學發(fā)光免疫傳感器技術領域，特別是涉及一種基于Au-g-C3N4納米復合材料的甲胎蛋白的電致化學發(fā)光免疫傳感器的制備方法及應用。具體涉及一種g-C3N4納米片(g-C3N4NSs)作為發(fā)光材料，以Au作為抗體捕獲基底同時兼具導電和催化作用的電致化學發(fā)光免疫傳感器的制備及應用。
【背景技術】
[0002]甲胎蛋白(AFP)是一種肝癌標志物，在正常人血清中AFP的含量不高于20 μ g/L，然而當肝細胞發(fā)生癌變時，其在血清中的含量就會急劇增加，因此發(fā)展一種簡便、快速、高靈敏的檢測AFP的方法對肝癌的早期診斷和鑒別具有重要意義。
[0003]目前測定AFP的免疫方法有很多，如酶聯(lián)免疫分析，熒光免疫分析，放射免疫分析等。其中酶聯(lián)免疫分析和熒光免疫分析成本較高，并且存在試劑盒難以保存的問題，而放射性免疫分析的重現(xiàn)性較差。電致化學發(fā)光免疫傳感器具有設備簡單，操作簡便，靈敏度高，選擇性好，抗干擾能力強，成本低等優(yōu)點。因此本發(fā)明制備了一種基于(Au-g-C3N4納米復合材料)Au-g-C3N4 NHs的甲胎蛋白的電致化學發(fā)光免疫傳感器，將免疫學方法與電致化學發(fā)光檢測方法相結(jié)合，通過抗原抗體之間高度的特異性結(jié)合實現(xiàn)對AFP的檢測。
[0004]本發(fā)明利用滴涂法將Au-g_C3N4 NHs修飾到玻碳電極表面，由于g_C3N4 NSs良好的成膜性，因此無需對電極及修飾材料進行其他處理。在此，復合物中的g_C3N4 NSs作為發(fā)光材料，Au作為抗體捕獲基底，同時還起到促進電子傳遞和催化作用有效的增強了電致化學發(fā)光強度。該方法在檢測過程中產(chǎn)生了良好的電致化學發(fā)光強度，可以用于AFP的分析。在本發(fā)明中構(gòu)建的電致化學發(fā)光免疫傳感器具有成本低，穩(wěn)定性好，制備過程簡單，靈敏度高等優(yōu)點，有效克服了目前AFP檢測方法的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是以Au-g_C3N4 NHs為基底材料，構(gòu)建了一種簡單快速，穩(wěn)定性好，靈敏度高的電致化學發(fā)光免疫傳感器。
[0006]本發(fā)明的目的之二是將該電致化學發(fā)光免疫傳感器用于AFP的檢測。
[0007]本發(fā)明的技術方案為:
1.一種基于Au-g_C3N4納米復合材料的甲胎蛋白的電致化學發(fā)光免疫傳感器的制備方法
(1)用1.0 μπι、0.3 μπι,Ο.05 μπι的Al2O3拋光粉依次打磨直徑為4 mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗3 min，氮氣吹干，取6~10 μ L Au-g_C3N4 NHs分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干成膜，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗以除去未鍵合的Au-g-C3N4 NHs 得到 Au-g-C3N4 NHs/GCE ；
(2)取50μ L 1.0-2.5 yg/mL的甲胎蛋白抗體(ant1-AFP)標準溶液滴涂到電極表面，在4 °C冰箱中孵育12 h，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗除去物理吸附得到ant1-AFP/Au-g-C3N4 NHs/GCE ；
(3)取50μ L質(zhì)量分數(shù)為1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到電極表面，在37°C下孵育I h，以封閉非特異性結(jié)合位點，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到BSA/ant1-AFP/Au-g-C3N4 NHs/GCE ；
(4)滴加50μ L濃度為0.001-5 ng/mL的一系列不同濃度的甲胎蛋白抗原標準溶液用于與抗體特異性識別，在37 °C下孵育60 11^11，用？83(?!1 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于Au-g-C3N4 NHs的甲胎蛋白的電致化學發(fā)光免疫傳感器(AFP/BSA/ant1-AFP/Au-g-C3N4 NHs/GCE)。
[0008]2.上述的Au-g_C3N4NHs分散液的制備
(1)g-C3N4NSs的制備
稱取10 g尿素于坩禍中在馬弗爐中以50 °C/min程序升溫至550 °C，恒溫煅燒2.5 h得淡黃色粉末g-C3N4。稱取制得的g_C3N4 100 mg于錐形瓶中，加入100 mL超純水，然后超聲16 h，所得溶液在6000 r/s下離心，除去未分散的g_C3N4，收取上清液，在60 °C下旋蒸得到乳白色的g_C3N4 NSs分散液；
(2)金納米溶液Au的制備
量取97 mL的超純水于錐形瓶，在攪拌下加入I mL 0.01 mol/L的HAuCljPl mL的0.03 mol/L檸檬酸二鈉，之后逐滴滴加I mL 0.047 mol/L的硼氫化鈉至溶液變?yōu)榱辆萍t色，再攪拌15 min的金納米溶液Au ；
(3)Au-g-C3N4NHs分散液的制備
移取5 mL的金納米溶液Au在攪拌條件加入到5 mL得g_C3N4 NSs分散液中，強力攪拌60 min，離心洗滌后再用I mL超純水水稀釋即得Au-g_C3N4 NHs分散液。
[0009]3.AFP 的檢測
(1)以所制備的免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極；使用MP1-B型多參數(shù)化學發(fā)光分析測試系統(tǒng)進行測試，將光電倍增管的高壓設置為600 V，掃描區(qū)間為-1.1~0 V，掃描速度為100 mV/s ；
(2)在含有0.1 mol/L過硫酸鉀的10 mL PBS(pH 7.4)緩沖溶液的電解池中，通過MP1-B型多參數(shù)化學發(fā)光分析測試系統(tǒng)檢測0.001-5 ng/mL 一系列不同濃度AFP標準溶液及未特異性結(jié)合AFP的電極的電致化學發(fā)光強度，繪制工作曲線；
(3)將待測樣品溶液代替AFP標準溶液進行檢測。
[0010]本發(fā)明的有益成果
(1)本發(fā)明以g_C3N4NSs為發(fā)光材料，利用其優(yōu)異的光學性質(zhì)構(gòu)建的電致化學發(fā)光免疫傳感器具有更高的發(fā)光信號；
(2)本發(fā)明不需要引入任何鏈接劑，以Au作為抗體捕獲基底，一方面可以與抗體結(jié)合，將抗體固定在電極表面，另一方促進電子傳遞和催化過硫酸鉀產(chǎn)生更多的電子空穴，有效的增強了電致化學發(fā)光強度；
(3)本發(fā)明所用基底材料Au-g-C3N4NHs具有良好的成膜性，無需做特殊處理，極大的簡化了電極制備過程；
(4)本發(fā)明制備的電致化學發(fā)光免疫傳感器用于AFP的檢測，操作簡單，線性范圍寬，檢出限低，可以實現(xiàn)對AFP的簡單、快速、高靈敏檢測。線性范圍為0.001~5 ng/mL，檢出限為 0.0005 ng/mL。
[0011]【附圖說明】:
圖1為不同濃度AFP的電致化學發(fā)光強度圖；
圖2為不同濃度AFP的相對電致化學發(fā)光強度與Igc的線性擬合圖。
[0012]其中，圖1中由a至Ij i的電致化學發(fā)光強度圖分別代表AFP的濃度為0，0.001，
0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5 ng/mL。
[0013]【具體實施方式】:
為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細說明本發(fā)明的技術方案，但是本發(fā)明并不局限于此。
[0014]實施例1 一種基于Au-g_C3N4 NHs的甲胎蛋白的電致化學發(fā)光免疫傳感器的制備方法
(1)用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的Al2O3拋光粉依次打磨直徑為4 mm的GCE，分別在乙醇和超純水中超聲清洗3 min,氮氣吹干，取6 μ L Au-g_C3N4 NHs分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干成膜，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗以除去未鍵合的Au-g-C3N4 NHs得到Au-g-C3N4 NHs/GCE ；
(2)取50yL I μ g/mL的ant1-AFP標準溶液滴涂到電極表面，在4 °C冰箱中孵育12h，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗除去物理吸附得到ant1-AFP/Au-g-C3N4 NHs/GCE ;
(3)取50μ L質(zhì)量分數(shù)為1%的BSA溶液滴涂到電極表面，在37 °C下孵育I h，以封閉非特異性結(jié)合位點，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到BSA/ant1-AFP/Au-g-C3N4NHs/GCE ；
(4)滴加50yL濃度為0.001~5 ng/mL的一系列不同濃度的甲胎蛋白抗原標準溶液用于與抗體特異性識別，在37 °C下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于Au-g-C3N4 NHs的AFP的電致化學發(fā)光免疫傳感器(AFP/BSA/ant1-AFP/Au-g-C3N4 NHs/GCE)。
[0015]實施例2 —種基于Au-g_C3N4 NHs的甲胎蛋白的電致化學發(fā)光免疫傳感器的制備方法
(1)用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的Al2O3拋光粉依次打磨直徑為4 mm的GCE極，分別在乙醇和超純水中超聲清洗3 min，氮氣吹干，取8 yL Au-g_C3N4 NHs分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干成膜，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗以除去未鍵合的Au-g-C3N4 NHs得到Au-g-C3N4 NHs/GCE ；
(2)取50μ L 2.0 μ g/mL的ant1-AFP標準溶液滴涂到電極表面，在4 °C冰箱中