本發(fā)明涉及一種電化學(xué)適體傳感器，特別涉及一種auncs@521-mof納米片復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由于在執(zhí)法和臨床診斷中迫切需求快速檢測出可卡因，所以可卡因常被用作為一種具有代表性的模型目標(biāo)來探索新的分析技術(shù)。因此，與可卡因相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)和社會心理問題仍然是公眾關(guān)注的焦點，而且其非法使用仍是警察主要的擔(dān)憂部分。目前已經(jīng)設(shè)計了幾種方法來實現(xiàn)可卡因的靈敏性檢測，包括表面增強(qiáng)拉曼散射(sers)光譜，高效液相色譜(hplc)，氣相色譜-質(zhì)譜(gc-ms)，酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)，熒光免疫測定⁵和滾環(huán)擴(kuò)增(rca).盡管這些常規(guī)方法能夠準(zhǔn)確并且靈敏地檢測出可卡因，但上述方法有幾個缺點，比如操作復(fù)雜，麻煩而且耗時，同時設(shè)備昂貴以致于難以使用于現(xiàn)場測試中。在這些測定方法中，電化學(xué)技術(shù)在該方面表現(xiàn)出很高的效用，主要是因為其電化學(xué)檢測器易于使用，成本低且尺寸小。例如，lu等人報道了一種基于二氧化錳納米片的電化學(xué)傳感平臺，它可用于敏感檢測可卡因，并且實現(xiàn)了對可卡因快速，簡便和劃算的分析。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種auncs@521-mof納米片復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

本發(fā)明一方面提供了一種auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物，包括：

復(fù)數(shù)個二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片形成的團(tuán)聚體；

以及，分布于所述團(tuán)聚體中的復(fù)數(shù)個au納米簇。

進(jìn)一步的，所述的auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物包括：

復(fù)數(shù)個二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片形成的團(tuán)聚體，

以及，嵌入所述二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片的復(fù)數(shù)個au納米簇；

優(yōu)選的，所述au納米簇分布于相鄰二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片之間；

優(yōu)選的，所述團(tuán)聚體為玫瑰狀納米花結(jié)構(gòu)，直徑為2.5μm～4.0μm；

優(yōu)選的，所述二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片的厚度為5nm～10nm，長度為500nm～800nm，寬度為500nm～800nm；

優(yōu)選的，所述au納米簇的直徑為1.5nm～2.0nm；

優(yōu)選的，所述二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片與au納米簇的質(zhì)量比例為1∶1～2∶1。

本發(fā)明一方面還提供了一種auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物的制備方法，包括：

將二氯氧化鋯水合物、三氟乙酸與n，n′-二乙基甲酰胺均勻混合形成鋯鹽溶液；

將4′，4″′，4″′″-次氮基三(1，1′-聯(lián)苯基-4-羧酸)與n，n′-二乙基甲酰胺均勻混合形成有機(jī)溶液；

將鋯鹽溶液、有機(jī)溶液、聚乙烯吡咯烷酮及乙醇混合，并在45-60℃下攪拌2-3天，之后分離出固形物、清洗，即為二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片；

將二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片均勻分散于dmf中，并加入金納米簇，在45-60℃下攪拌2-3天后，獲得所述auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物；

優(yōu)選的，所述氯氧化鋯水合物、三氟乙酸與n，n′-二乙基甲酰胺的質(zhì)量比為1∶13∶1～1∶26∶1.1。

進(jìn)一步的，所述制備方法包括：在劇烈攪拌的情況下，將牛血清白蛋白溶液加入haucl4水溶液，之后加入naoh溶液，32-42℃下劇烈攪拌反應(yīng)6-12h，獲得所述金納米簇。

優(yōu)選的，其中牛血清白蛋白、haucl4與naoh的質(zhì)量比為(10-13)∶(1-3)∶(1-3)。

本發(fā)明另一方面提供了一種可卡因電化學(xué)傳感器，包括：

所述的auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物；

以及，修飾于auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物上的可卡因適體鏈。

進(jìn)一步的，所述可卡因電化學(xué)傳感器還包括電極基體，所述auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物固定在所述電極基體上；

優(yōu)選的，所述可卡因適體鏈的核酸序列為5′-agacaaggaaaatccttcaatgaagtgggtcg-3′；

優(yōu)選的，所述電極基體包括金電極。

本發(fā)明又一方面提供了一種可卡因電化學(xué)傳感器的制備方法，包括：

采用所述auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物的制備方法制備auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物；

將所述auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物分散于溶劑中形成均勻分散液，之后將所述均勻分散液施加于電極基體上并干燥；

以可卡因適體鏈的溶液浸潤固定于所述電極基體的auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物，使可卡因適體鏈修飾于auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物上，形成所述電化學(xué)傳感器。

本發(fā)明又一方面還提供了一種可卡因檢測方法，包括：

提供所述的可卡因電化學(xué)傳感器；

將所述可卡因電化學(xué)傳感器于可能含有可卡因的待測液體樣品中浸漬，之后以所述可卡因電化學(xué)傳感器作為工作電極進(jìn)行電化學(xué)測試，實現(xiàn)對待測液體樣品中可卡因的檢測。

進(jìn)一步的，所述電化學(xué)測試的方式包括循環(huán)伏安法、示差脈沖伏安法或電化學(xué)阻抗譜法。

進(jìn)一步的，所述檢測方法包括：采用電化學(xué)阻抗譜法的最低檢測限為1.29pm；和/或，采用差示脈沖伏安法的最低檢測限為2.22pm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點包括：

本發(fā)明提供的2dauncs@521-mof納米片復(fù)合物不僅具有高比表面積，良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性和電化學(xué)活性，而且對生物分子的磷酸酯基團(tuán)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的生物親和力；

本發(fā)明提供的電化學(xué)適體傳感器用于可卡因檢測簡單便利，而且還具有高選擇性，重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，操作簡單等優(yōu)點。這項工作將為生物傳感建立新的平臺，并擴(kuò)大mofs材料的應(yīng)用范圍。

附圖說明

圖1(a)是本發(fā)明實施例1中pxrd和auncs@521-mof的ft-ir光譜圖；

圖1(b)是本發(fā)明實施例1中521-mof和auncs@521-mof.的ft-ir光譜圖；

圖2a-d分別為本發(fā)明實施例1中c1s，n1s，zr3d和au4f的auncs@521-mof納米片的高分辨率xps光譜圖；

圖3為本發(fā)明實施例1中auncs@521-mof，apt/auncs@521-mof，cocaine/apt/auncs@521-mof的xps全譜圖；

圖4a-e分別為本發(fā)明實施例2中apt/auncs@521-mof和cocaine/apt/auncs@521-mof的c1s，o1s，zr3d，au4f和p2p的xps光譜圖；

圖5a-b分別為本發(fā)明實施例1中auncs@521-mof納米片sem圖；

圖5c-d分別為本發(fā)明實施例1中auncs@521-mof納米片hr-tem圖；

圖6a-b分別為本發(fā)明實施例1中2d521-mof的低倍sem圖和高倍sem圖；

圖6c-d為本發(fā)明實施例1中2d521-mof的hr-tem圖；

圖7a為本發(fā)明實施例3中空白ae的cv曲線圖；

圖7b為本發(fā)明實施例3中apt/auncs@521-mof/ae在含有0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-溶液中測試得到的可卡因檢測eis圖；

圖8是本發(fā)明實施例3中基于auncs@521-mof制備的電化學(xué)生物傳感器在含有0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-溶液中通過dpv測試曲線圖；

圖9a、9b分別是本發(fā)明實施例3中基于auncs@521-mof制備的電化學(xué)生物傳感器在含有0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-溶液中檢測可卡因的cv曲線和eis曲線；

圖10a和10b分別是本發(fā)明實施例3中apt/auncs@521-mof/ae在不同濃度(0,0.001,0.005,0.01，0.05，0.1，0.5和1.0ng·ml^-1)的可卡因溶液中eis圖和δrct增加值相對應(yīng)的對數(shù)值與可卡因濃度的線形圖；

圖11a和11b分別是本發(fā)明實施例3中apt/auncs@521-mof/ae在不同濃度(0,0.001,0.005,0.01，0.05，0.1，0.5和1.0ng·ml^-1)可卡因溶液中dpv圖和δi增加值相對應(yīng)的對數(shù)值與可卡因濃度的線形圖；

圖12是本發(fā)明實施例3中auncs@521-mof基電化學(xué)生物傳感器檢測可卡因(0.01ng·ml^-1)以及干擾物(aa，atp，igg，ua，bsa和lysozyme濃度為0.1ng·ml^-1)的δrct圖；

圖13是本發(fā)明實施例3中所提供的傳感器在15天內(nèi)可卡因檢測的穩(wěn)定性圖；

圖14a是本發(fā)明實施例3中提供的五個電極生物傳感器的δrct；

圖14b是本發(fā)明實施例3中通過eis測試開發(fā)的生物傳感器可卡因的重復(fù)性檢測圖。

具體實施方式

鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本案發(fā)明人經(jīng)長期研究和大量實踐，得以提出本發(fā)明的技術(shù)方案。如下將對該技術(shù)方案、其實施過程及原理等作進(jìn)一步的解釋說明。

本發(fā)明實施例一方面提供了一種auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物，包括：

復(fù)數(shù)個二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片形成的團(tuán)聚體；

以及，分布于所述團(tuán)聚體中的復(fù)數(shù)個au納米簇。

進(jìn)一步的，所述的auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物包括：

復(fù)數(shù)個二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片形成的團(tuán)聚體，

以及，嵌入所述二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片的復(fù)數(shù)個au納米簇；

優(yōu)選的，所述au納米簇分布于相鄰二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片之間；

優(yōu)選的，所述團(tuán)聚體為玫瑰狀納米花結(jié)構(gòu)，直徑為2.5μm～4.0μm；

優(yōu)選的，所述二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片的厚度為5nm～10nm，長度為500nm～800nm，寬度為500nm～800nm；

優(yōu)選的，所述au納米簇的直徑為1.5nm～2.0nm；

優(yōu)選的，所述二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片與au納米簇的質(zhì)量比例為1∶1～2∶1。

本發(fā)明一方面還提供了一種auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物的制備方法，包括：

將二氯氧化鋯水合物、三氟乙酸與n，n′-二乙基甲酰胺均勻混合形成鋯鹽溶液；

將4′，4″′，4″′″-次氮基三(1，1′-聯(lián)苯基-4-羧酸)與n，n′-二乙基甲酰胺均勻混合形成有機(jī)溶液；

將鋯鹽溶液、有機(jī)溶液、聚乙烯吡咯烷酮及乙醇混合，并在45-60℃下攪拌2-3天，之后分離出固形物、清洗，即為二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片；

將二維鋯基金屬-有機(jī)骨架納米片均勻分散于dmf中，并加入金納米簇，在45-60℃下攪拌2-3天后，獲得所述auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物；

優(yōu)選的，所述氯氧化鋯水合物、三氟乙酸與n，n′-二乙基甲酰胺的質(zhì)量比為1∶13∶1～1∶26∶1.1。

進(jìn)一步的，所述制備方法包括：在劇烈攪拌的情況下，將牛血清白蛋白溶液加入haucl4水溶液，之后加入naoh溶液，32-42℃下劇烈攪拌反應(yīng)6-12h，獲得所述金納米簇；

優(yōu)選的，其中牛血清白蛋白、haucl4與naoh的質(zhì)量比為(10-13)∶(1-3)∶(1-3)。

本發(fā)明另一方面提供了一種可卡因電化學(xué)傳感器，包括：

所述的auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物；

以及，修飾于auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物上的可卡因適體鏈。

進(jìn)一步的，所述可卡因電化學(xué)傳感器還包括電極基體，所述auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物固定在所述電極基體上；

優(yōu)選的，所述可卡因適體鏈的核酸序列為5′-agacaaggaaaatccttcaatgaagtgggtcg-3′；

優(yōu)選的，所述電極基體包括金電極。

本發(fā)明又一方面提供了一種可卡因電化學(xué)傳感器的制備方法，包括：

采用所述auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物的制備方法制備auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物；

將所述auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物分散于溶劑中形成均勻分散液，之后將所述均勻分散液施加于電極基體上并干燥；

以可卡因適體鏈的溶液浸潤固定于所述電極基體的auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物，使可卡因適體鏈修飾于auncs@二維zr-mof納米片復(fù)合物上，形成所述電化學(xué)傳感器。

本發(fā)明又一方面還提供了一種可卡因檢測方法，包括：

提供所述的可卡因電化學(xué)傳感器；

將所述可卡因電化學(xué)傳感器于可能含有可卡因的待測液體樣品中浸漬，之后以所述可卡因電化學(xué)傳感器作為工作電極進(jìn)行電化學(xué)測試，實現(xiàn)對待測液體樣品中可卡因的檢測。

進(jìn)一步的，所述電化學(xué)測試的方式包括循環(huán)伏安法、示差脈沖伏安法或電化學(xué)阻抗譜法。

進(jìn)一步的，所述檢測方法包括：采用電化學(xué)阻抗譜法的最低檢測限為1.29pm；

進(jìn)一步的，采用差示脈沖伏安法的最低檢測限為2.22pm。

本發(fā)明提供的電化學(xué)適體傳感器用于可卡因檢測簡單便利，而且還具有高選擇性，重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，操作簡單等優(yōu)點。這項工作將為生物傳感建立新的平臺，并擴(kuò)大mofs材料的應(yīng)用范圍。

本發(fā)明實施例提供了嵌入auncs的納米結(jié)構(gòu)二維zr-mof納米片，并將其應(yīng)用于電化學(xué)適應(yīng)傳感器來檢測可卡因。其中，zr基mofs通過在mof和磷酸鹽的zr-o結(jié)點之間形成zr-o-p，從而表現(xiàn)出優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性以及對磷酸鹽的高親和力；基于zr的mofs被用作連接含有大量磷酸基團(tuán)的寡核苷酸的平臺，作為新型生物傳感器用于檢測目標(biāo)分析物；2dzr-mof納米片具有的強(qiáng)生物親和力及高比表面積和auncs的良好的電化學(xué)活性，嵌入auncs的2dzr-mof納米片(auncs@521-mof)可以作為適體鏈平臺用于固定和進(jìn)一步檢測可卡因。尤其是，尺寸為10nm的2dmof表現(xiàn)出良好的導(dǎo)電性，如圖7a和圖7b所示。

在本發(fā)明的一些實施方案中，一類可卡因傳感器的制備方法可以基于如下過程實現(xiàn)：

步驟1：由于au原子或au⁺與有機(jī)配體中的coo-基團(tuán)或n原子之間的配位相互作用，小尺寸auncs(約1.5-2.0nm)嵌入在2d521-mof內(nèi)，進(jìn)而形成了均勻復(fù)合物auncs@521-mof納米片；

步驟2：2d521-mof中的zr-o結(jié)構(gòu)顯示出對無機(jī)磷酸鹽的高親和力，故可緊密吸附寡核苷酸分子(包括dna或適體鏈；

步驟3：目標(biāo)分子可卡因可以通過特異性地識別與2d平臺上固定的適配體結(jié)合，進(jìn)一步導(dǎo)致適體的構(gòu)象改變；

進(jìn)一步的，可卡因檢測的每個步驟都是基于開發(fā)的auncs@521-mof通過電化學(xué)技術(shù)測量。本發(fā)明的可卡因傳感器具有低檢測限，良好的重復(fù)性，穩(wěn)定性和適用性等特點。

以下結(jié)合若干實施例及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的解釋說明。在如下實施例中，可以使用rigaku型ultimaiv衍射儀與rigakud/tex超高速位置敏感檢測器和cu-kαx射線(40kv，40ma)獲得粉末x射線衍射(pxrd)圖，粉末樣品可以通過粉碎單晶得到，以掃描速率為5°/min，步長為0.02°的逐步掃描模式收集相應(yīng)的強(qiáng)度數(shù)據(jù)；傅里葉變換紅外光譜(ft-ir)光譜通過使用在4000-400cm^-1范圍內(nèi)的brukertensor27opusft-ir光譜儀(kbr沉淀)來表征，使用液氮(77k)維持實驗溫度，使用200kv的場發(fā)射高分辨率透射電子顯微鏡(tem，jeoljem-2100)測定表面形態(tài)，可以使用配有a1陽極(al-kα1486.6ev)的thermofisherescalab250xi光譜儀進(jìn)行x射線光電子能譜(xps)分析。

實施例1

制備pvp穩(wěn)定化二維521-mof

將二氯化氧化鋯水合物(zrocl2·8h2o)(0.10mmol，35.0mg)溶解到裝有n，n′-二乙基甲酰胺(def)(1.5ml)和三氟乙酸(tfa)(0.6ml)的10.0ml螺旋蓋的小瓶中，并將混合物超聲溶解10分鐘。然后，將40.0mg4′，4″′，4″′″-次氮基三(1，1′-聯(lián)苯基-4-羧酸)(h3nbb)(0.05mmol)的溶液在def(1.5ml)中超聲溶解10分鐘；將鋯鹽溶液加入到有機(jī)溶液中獲得混合溶液，然后將得到的混合溶液中加入到384.0mg聚乙烯吡咯烷酮(pvp)(mw≈24,000)的混合物中并在3.0ml乙醇中超聲處理10分鐘。將上述混合物超聲處理30分鐘，然后在45-60℃下攪拌2-3天。以10000rpm的速度將所得黃色懸浮液離心3分鐘以使其沉淀。最后用dmf清洗該樣品以除去過量的前驅(qū)體，并以10000rpm的速度離心3分鐘，制得pvp穩(wěn)定化二維521-mof。

制備auncs：將所有玻璃器皿用王水(hcl∶hno3體積比＝3∶1)洗滌，并用乙醇和超純水沖洗。實驗過程是在劇烈攪拌的情況下，將牛血清白蛋白(bsa)溶液(5.0ml，50.0mg·ml^-1，37℃)中加入haucl4水溶液(5.0ml，10.0mm，37℃)，2分鐘后加入naoh溶液(0.5ml，1.0m)，37℃下劇烈攪拌，反應(yīng)進(jìn)行12小時；將所得的10.0mgauncs加入到上述制備的2d521-mof混合溶液中，然后在50℃下磁力攪拌三天；最后，通過以10,000rpm離心3分鐘分離得到的黃色產(chǎn)物，并用dmf進(jìn)一步純化至少三次。

521-mof和auncs@521-mof樣品的pxrd圖相似(如圖1a)，其中位于2θ＝6.5°，8.0°，8.7°，10.4°，17.6°和22.5°的特征峰證實了521-mof的成功合成，圖1b是了521-mof和auncs@521-mofs復(fù)合材料的ft-ir光譜圖；羥基峰在3350-3650cm^-1，而苯環(huán)和pvp的芳香族及脂肪族v(c-h)的吸收峰位于3100-2850cm^-1范圍內(nèi)，苯環(huán)(1410cm^-1)中的c＝o(1645cm^-1)和c＝c的伸縮振動吸收峰十分明顯。zr-o2的吸附峰位于600-800cm^-1之間。此外，兩個樣品之間沒有觀察到差異。

auncs@521-mof從0到1300.0ev的xps測量掃描譜圖如圖2所示，在xps全譜(圖3)中，確定了c1s，o1s，n1s，f1s，zr3p，zr3d和au4f的特征結(jié)合能，在688.9ev觀察到f1s是因為tfa的殘留，在c1sxps光譜中(圖2a)，與c-c/c-h、c-n、c＝o、coo^-和c-f3對應(yīng)的結(jié)合能是284.6、285.7、287.7、288.7和292.6ev；c-f3鍵來源于制備auncs@521-mof時保留的tfa。此外，c＝o，coo^-基團(tuán)的源自mofs框架中zr原子和o原子之間的不同配位類型，在o1sxps光譜中有結(jié)合能為529.94和531.45ev兩個主峰，分別對應(yīng)于zr-o-zr和c＝o基團(tuán)。兩個峰均來自zr-mof結(jié)構(gòu)，之所以出現(xiàn)大量zr3d峰并被擬合成兩個成分(181.8和184.2ev)，是因為zr3d5/2和zr3d3/2處于核心水平(圖2c)，au4f(圖2d)的高分辨率光譜可以分成四個峰，其結(jié)合能分別為83.9、87.6、84.8和88.5ev，它們分別對應(yīng)于au⁰和au¹⁺的雙重峰，這些結(jié)果表明auncs和zr-mof納米片的結(jié)合。

請參閱圖5a-5dauncs@521-mof納米復(fù)合材料的sem和tem表征圖，由sem圖像可以看出樣品由分層納米花組成，它們通過大量隨機(jī)納米片組裝而成(圖5a)，玫瑰狀納米花由許多片材組成，其直徑約為2.5-4.0μm，圖5b表明納米花是通過厚度約350nm的納米片自組裝形成的，對于純521-mof(圖6a和6b)，其所制備的樣品由大量寬度為幾個微米的聚集片組成。

顯然，aunc的存在可以促進(jìn)521-mof納米片堆疊在一起，從而導(dǎo)致厚板的聚集和納米花的形成。

將521-mof和aunc@521-mof分散在超純水中后，將分散體滴加到銅模上進(jìn)行tem測試；圖5c是auncs@521-mof的tem圖像，樣品是由幾層附聚片組成，如圖5d所示，大量ncs嵌入在2d納米片中，晶格為2.03nm的部分對應(yīng)的是zro2的(220)晶面，從圖5d中的高分辨率tem圖像可以看出521-mof中的auncs的尺寸約為2.0nm，而晶格的晶面間距約為0.23nm，這與auncs的(111)晶格間距一致；相對于auncs@521-mof的圖像，在tem圖像(圖6c和圖6d)中能夠觀察到光滑的表面。此外，晶格為2.03nm的部分對應(yīng)的是zro2的(220)晶面。

實施例2

使用直徑為3mm的au電極(ae)(可以購買于艾達(dá)恒晟科技有限公司(中國天津))，并在使用前對其進(jìn)行清洗。首先，使用0.05mm氧化鋁漿料和p1金拋光機(jī)拋光ae，并用超純水(≥18.2ω.cm)沖洗五次，然后用食人魚洗液(h2so4∶h2o2體積比＝7∶3；警告：食人魚洗液與有機(jī)溶劑劇烈反應(yīng))清洗ae15分鐘，之后再用超純水徹底洗滌并在氮氣下干燥；最后，在0.5mh2so4溶液中以及在-0.2和1.6v之間的電勢循環(huán)條件下對ae進(jìn)行電化學(xué)洗滌，直到觀察到可再現(xiàn)的循環(huán)伏安圖，然后用超純水清洗活化過的電極，并在氮氣下干燥。

在活化過的ae表面上滴加5.0μlauncs@521-mof納米片(實施例1制備)水懸浮液(0.1mg·ml^-1)，然后用超純n2對其進(jìn)行干燥；然后，將修飾的ae浸入0.1m磷酸鹽緩沖液(pbs，ph＝7.4)中以除去弱結(jié)合的納米材料，得到納米片改性電極(稱作auncs@521-mof/ae)；隨后，將auncs@521-mof/ae浸泡在可卡因核酸適體溶液中；核酸適體鏈的序列為無標(biāo)記的5′-agacaaggaaaatccttcaatgaagtgggtcg-3′，(可以在賽百盛基因技術(shù)有限公司(中國北京)訂購)；最后，用pbs沖洗固定了核酸適體aes(稱作apt/auncs@521-mof/ae)，并在溫和的氮氣流下干燥，得到生物傳感器并用于下一步的電化學(xué)測試；

生物傳感器在不使用時可以儲存在4℃冰箱中。

如表1所示，xps表征了適體鏈和可卡因檢測過程中化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)的變化，得到了每個元素即c1s，o1s，n1s，zr3d，au4f和p2p的原子百分比，而圖3表示的是所有樣品的xps測量掃描譜圖；apt/auncs@521-mof和cocaine/apt/auncs@521-mof樣品中n1s含量分別從5.32增加到12.42和8.38％，該結(jié)果可以用適配子分子的固定來解釋，其中與寡核苷酸主鏈有關(guān)的一些氮相關(guān)基團(tuán)增加了n1s的含量。同時，由于適配子鏈結(jié)合，zr3d的含量降低，zr和au原子百分比降低為0.14和0.19，是由于適體鏈與au@zr-mof結(jié)構(gòu)結(jié)合的阻礙效應(yīng)所造成的。此外，p2p信號的出現(xiàn)可以證明上述討論，apt/auncs@521-mof和cocaine/apt/auncs@521-mof的c1s，o1s，zr3d和au4f的xps光譜如圖4所示。由圖4a可知，結(jié)合能為284.6、285.7和287.7ev處的三個主峰分別為c-c/c-h、c-n/c-o和n-c＝o/coo-的吸收峰；假設(shè)峰面積與所有峰面積之和的比值可以表示官能團(tuán)的相對含量，則能夠觀察到apt/auncs@521-mof中n-c＝o/coo-的比例高于auncs@521-mof復(fù)合材料中n-c＝o/coo-的比例；apt/auncs@521-mof和cocaine/apt/auncs@521-mof的高分辨率o1xps光譜如(圖4b)所示，在結(jié)合能為535.35、532.91和531.82ev處獲得了三個另外的峰，其分別屬于n-c＝o，p-oh和zr-o-p/p＝o/zr-o-h/c-o基團(tuán)的吸收峰。這些基團(tuán)的出現(xiàn)表明在zr-o節(jié)點和適體骨架之間形成了共價鍵，從zr3d和au4f高分辨率光譜模擬的相同的峰顯示在圖4c和4d中，但強(qiáng)度較弱。

表1auncs@521-mof，apt/auncs@521-mof，和cocaine/apt/auncs@521-mof樣品中的原子率

本實施例在用pvp制備2dzr-mof納米片期間嵌入auncs。auncs@521-mof納米片中的auncs具有高化學(xué)穩(wěn)定性，低毒性和優(yōu)異的生物相容性，而且au原子和-nh2基團(tuán)之間的強(qiáng)相互作用增強(qiáng)了其與適體鏈的結(jié)合力；此外，具有高比表面積的二維zr-mof網(wǎng)絡(luò)的平面結(jié)構(gòu)和特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)可以形成強(qiáng)π-π堆疊并在與適體鏈結(jié)合時形成zr-o-p共價鍵。因此，該生物傳感界面可以改善電化學(xué)適體傳感器的性能特征。固定可卡因適配體鏈(無標(biāo)記的5′-agacaaggaaaatccttcaatgaagtgggtcg-3′)后，可卡因與適體的選擇性結(jié)合將誘導(dǎo)適體折疊成三維結(jié)構(gòu)，從而進(jìn)一步導(dǎo)致電化學(xué)反應(yīng)期間在氧化還原探針[fe(cn)6]^3-/^4-存在下的電極的電子轉(zhuǎn)移電阻變化。因此，整個檢測過程可以通過電化學(xué)技術(shù)，如cv，eis和dpv來確定，詳見下文。

實施例3

取實施例2制備的生物傳感器作為工作電極，在具有三電極系統(tǒng)的chi660e電化學(xué)站上進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜(eis)，循環(huán)伏安法(cv)和差示脈沖伏安法(dpv)測試。該系統(tǒng)包括ae或auncs@521-mof/ae，ag/agcl電極和pt線，分別用作工作電極、參考電極和對電極。測試在含有5.0mmk3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6](1∶1)，0.14mnacl和0.1mkcl的0.10mpbs(ph＝7.4)中進(jìn)行；記錄與ag/agcl相對應(yīng)的-0.2和0.8v之間的cv曲線，掃描速率為100mv·s^-1；在0.01hz至100khz的頻率范圍內(nèi)進(jìn)行eis測量，其直流電勢為0.22v作為偏置電位，交流電位為5.0mv，使用zview2軟件對響應(yīng)值進(jìn)行分析，dpv是在-0.2v至0.8v的電位范圍內(nèi)測試的，振幅為50mv，脈沖寬度為0.2s，樣品寬度為0.0167s；在電化學(xué)測量過程中，將apt/auncs@521-mof/ae生物傳感器浸入不同濃度的可卡因溶液(稱作cocaine/apt/auncs@521-mof/ae)中2小時，以確定傳感器對分析物的檢測極限(在對分析物檢測的每個步驟之后，用pbs沖洗電極以除去弱結(jié)合的分子)。值得注意的是，每次進(jìn)行三次平行實驗，取其平均值用于本次工作中。

在室溫下，通過將生物傳感器在免疫球蛋白g(igg)，尿酸(ua)，抗壞血酸(aa)，牛血清蛋白(bsa)，三磷酸腺苷(atp)和溶菌酶(lysozyme)溶液中下浸泡2小時來測定其選擇性，同時使用五種新制備的生物傳感器來評估此分析方法的精密度；為了檢測穩(wěn)定性，將生物傳感器在4℃的冰箱中儲存15天，且每天通過eis測試。制備的生物傳感器的再生性可以通過在0.01mpbs中浸泡1小時，然后用超純水洗滌來測試。

為了研究不同測試技術(shù)之間的一致性，對制備的傳感器表面以及可卡因檢測進(jìn)行了cv，dpv和eis測試；如圖7a所示，空白ae的cv曲線顯示了明確定義的[fe(cn)6]^3-/4-氧化還原峰，峰-峰分離(δep)為246.3mv，而aunps@521-mof/ae的-氧化還原峰值明顯降低，峰值降低可能是2daunps@521-mof納米片引起的表觀擴(kuò)散系數(shù)的降低引起的，因為復(fù)合物521-mof中的有機(jī)相阻止電解質(zhì)溶液與工作電極之間的電子表面轉(zhuǎn)移，在核酸適體固定在2daunps@521-mof納米片的表面上后，cv響應(yīng)值持續(xù)下降，δep值增加到371.5mv，這種結(jié)果是由[fe(cn)6]^3-/4-的負(fù)電荷與適體鏈中的磷酸基團(tuán)的帶負(fù)電荷之間的排斥相互作用產(chǎn)生的，進(jìn)一步導(dǎo)致電子很難從電極表面轉(zhuǎn)移到電解質(zhì)液中，將生物傳感器浸入可卡因溶液中2h(0.001ng·ml^-1)，可卡因與電極表面附著的核酸適體鏈之間的結(jié)合，導(dǎo)致部分吸附層吸附在電極表面，還通過dpv的方法驗證了aunps@521-mof生物傳感器檢測可卡因，結(jié)果與cv測試的結(jié)果非常一致(如圖8)。

圖.8是基于auncs@521-mof制備的電化學(xué)生物傳感器在含有0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-溶液中通過dpv測試曲線檢測可卡因，電極被設(shè)計為：(i)ae，(ii)auncs@521-mof/ae，(iii)apt/auncs@521-mof/ae，和(iv)cocaine/apt/auncs@521-mof/ae。

eis是一種方便的技術(shù)，用于研究電極逐步修飾過程中界面性質(zhì)的變化。通過使用5mm[fe(cn)6]^3-/4-來獲得不同電極的典型奈奎斯特圖，其溶液包含0.14mnacl和0.1mkcl作為探針(圖7b)。由溶液電阻(rs)，電荷轉(zhuǎn)移電阻(rct)，恒定相元件(cpe)和warburg阻抗(w)(圖7b的插圖)組成的randles等效電路來模擬譜圖。ae(曲線i)在高頻下顯示出電子轉(zhuǎn)移電阻(rct)約為0.09kω的小半圓，而2daunc@521-mof/ae(曲線ii)，rct值從0.09增加到0.34kω，這可能是由于附著在電極表面的納米片電化學(xué)活性相對較弱，由于連接核苷酸鏈導(dǎo)電性差，并且[fe(cn)6]^3-/4-與核苷酸鏈之間相同電荷引起的排斥力，使apt/auncs@521-mof/ae(曲線iii)的rct增加到0.81kω，隨后，當(dāng)制備得生物傳感器用于檢測可卡因(曲線iv)時，rct值進(jìn)一步增加到1.24kω，導(dǎo)致檢測前后rct差值為0.43kω(δrct＝rct可卡因-rct核酸適體)。差異表現(xiàn)在譜圖的半圓形部分的外觀增加，說明可卡因阻礙電荷轉(zhuǎn)移。圖9a-b是基于auncs@521-mof制備的電化學(xué)生物傳感器在含有0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-溶液中檢測可卡因(a)cv曲線(b)eis曲線，電極被設(shè)計為：(i)ae，(ii)auncs@521-mof/ae，(iii)apt/auncs@521-mof/ae和(iv)cocaine/apt/auncs@521-mof/ae。

通過使用包括eis和dpv在內(nèi)的三種電化學(xué)測試技術(shù)，根據(jù)δrct對不同濃度可卡因的依賴性，得到auncs@521-mof生物傳感器對可卡因的敏感性檢測。電化學(xué)測試使用不同濃度的可卡因(如圖10a)，特別地，δrct增加值相對應(yīng)的對數(shù)值在可卡因濃度(concocaine)為0.001至1.0ng·ml^-1的范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系(圖10b)，回歸方程式是δrct(kω)＝2.444+0.686logconcocaine(ng·ml^-1)，相關(guān)系數(shù)r²＝0.983。lod由回歸曲線的參數(shù)計算所得，在信噪比(s/n)比為3時lod值約為0.44pg·ml^-1(1.29pm)。此外，所制備得到的電化學(xué)傳感器通過dpv測試得到的lod，是根據(jù)δi對不同濃度的依賴計算所得(如圖11)，得到方程式δi(μa)＝24.623+3.981logconcocaine(ng·ml^-1)，其相關(guān)系數(shù)r²為0.978。lod計算為0.75pg·ml^-1(2.22pm)。與其他工作相比，基于auncs@521-mof納米片所合成的生物傳感器對可卡因檢測顯示出高靈敏性。

將干擾共存的igg，aa，ua，bsa，atp和lysozyme用于對照實驗以證明該檢測平臺的選擇性。圖12顯示的是目標(biāo)干擾物和非目標(biāo)干擾物相對應(yīng)的δrct值，可以觀察到我們所提出的傳感器對其他干擾物種檢測得到的δrct值很小，而在檢測可卡因時得到δrct值較大，結(jié)果表明，我們所制備的生物傳感器對檢測可卡因具有良好的選擇性；此外，應(yīng)在臨床診斷和生物監(jiān)測的可能應(yīng)用領(lǐng)域中評估此生物傳感器的可重用性，當(dāng)auncs@521-mof構(gòu)建的生物傳感器在4℃下儲存15天，然后在[fe(cn)6]^3-/4-溶液中進(jìn)行eis測試，與初始測試相比，rct值僅變化1.7％，表明該生物傳感器具有較好的穩(wěn)定性(如圖13)。

生物傳感器的再現(xiàn)性通過五個平行制備的傳感器檢測可卡因來研究，如圖14(a)所示，得到的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)為1.9％，這表明auncs@521-mof-基構(gòu)建的生物傳感器用于檢測可卡因具有高重現(xiàn)性。通過eis測試研究所制備的生物傳感器的再生性，經(jīng)過7次再生后，δrct值幾乎恢復(fù)到初始值(圖14b)，這表明我們所制備的生物傳感器具有良好的再生性。因此，2dauncs@521-mof-基生物傳感器對可卡因檢測具有高靈敏性，良好的選擇性，可重用性，穩(wěn)定性和再生性，這是因為核酸適體鏈與aunc@521-mof之間的相互作用以及核酸適體鏈和靶向分子可卡因之間的特殊性生物識別。

實施例4

可卡因生物傳感器在生物測試中的應(yīng)用

參照實施例3，使用三種生物液體(包括人血清，人體尿液和人體唾液)，以證實適實施例2制備的生物傳感器的適用性。人血清可以購自北京索萊寶科技有限公司，尿液和唾液樣品可以由健康成人提供。在每次測量之前，將所有樣品用0.01mpbs溶液(ph7.4)稀釋1000倍。

通過檢測三種實際樣品，人血清，尿液和唾液中的可卡因，評估所提出的傳感平臺-auncs@521-mof-基生物傳感器的廣泛適用性。將不同濃度的可卡因分別加入人血清，尿液和唾液中，然后使用測定可卡因濃度；首先將auncs@521-mof/ae分別浸泡在含有可卡因的三種溶液中2小時，然后用0.01mpbs徹底洗滌以最大程度地去除非特異性結(jié)合，隨后，根據(jù)上述方法進(jìn)行eis測試，分析的結(jié)果總結(jié)在表2中。在添加不同濃度的可卡因前后，我們得到三個樣品中δrct值非常接近于相應(yīng)的具有相同濃度的純可卡因溶液中的δrct值。人血清，尿液和唾液的回收率分別為101.9％至112.7％，103.6％至107.2％，99.2％至100.2％。值得注意的是，所有rsd值均小于4.0％。因此，所有這些值暗示了我們所制備的生物傳感器在不同的實際樣品測試中對可卡因檢測表現(xiàn)出高準(zhǔn)確性以及在藥物檢測應(yīng)用領(lǐng)域具有良好的前景。

表2實際樣品中可卡因的檢測及其回收率(n＝3)。

藉由前述實施例可以看到，本發(fā)明構(gòu)建了一種基于2dauncs@521-mof納米片用于檢測可卡因的新型電化學(xué)傳感器。然后通過寡核苷酸與auncs@521-mof的框架之間的強(qiáng)π-π堆疊和共價鍵相互作用將可卡因適配體連接到納米復(fù)合物修飾的電極表面上。因為適體傳感器具有高比表面積，電化學(xué)活性和生物相容性的優(yōu)點，使用eis和dpv分別痕量檢測可卡因時，當(dāng)線性范圍是0.001至1.0ng·ml-1其lods低至1.29和2.22pm。適體傳感器還具有高選擇性，重復(fù)性，穩(wěn)定性，可再生性和良好的適用性。此外，該適體傳感器不僅可用于檢測可卡因，還可用于生物領(lǐng)域其他不同靶向分析物，擴(kuò)大生物傳感領(lǐng)域mof納米材料的應(yīng)用范圍。

應(yīng)當(dāng)理解，上述實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。