本發(fā)明涉及腫瘤生物治療技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種重組人il-24蛋白的peg修飾方法。

背景技術(shù)：

人白細(xì)胞介素24(interleukin24,il-24)是1995年哥倫比亞大學(xué)paulfisher教授通過(guò)消減雜交在人黑色素瘤細(xì)胞ho-1中發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，屬于il-10超家族成員。近二十年的研究表明il-24是抗腫瘤的“明星”分子。首先，il-24在正常組織的內(nèi)源性表達(dá)具有高度的組織特異性，只在免疫系統(tǒng)相關(guān)組織(如脾、胸腺和外周血白細(xì)胞)和特定類型的細(xì)胞中表達(dá)；其次，il-24具有廣譜而特異的抗瘤活性，能夠抑制多種腫瘤(如肺癌、乳腺癌、宮頸癌等)的體內(nèi)外生長(zhǎng)，對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒(méi)有影響，與p53基因型的改變無(wú)關(guān)；同時(shí)，il-24具有刺激機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力，能夠誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞pbmc產(chǎn)生il-6、腫瘤壞死因子(tnf-α，ifn-γ)等；而且，il-24可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放化療敏感性，與腫瘤靶向藥物(如厄洛替尼等)、化療藥物(如順鉑等)或放療聯(lián)用可產(chǎn)生疊加或協(xié)同的抗瘤效果；最后，il-24在一些腫瘤組織(如黑色素瘤)的高水平表達(dá)與預(yù)后正相關(guān)，提示它可能是一個(gè)新的腫瘤預(yù)后標(biāo)志物。正是因?yàn)樯鲜鲞@些的特點(diǎn)，il-24被稱為腫瘤治療的“神奇子彈”，對(duì)il-24進(jìn)行深入研究不僅具有重要的理論意義，而且具有重大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

在將il-24應(yīng)用于臨床腫瘤的研究中，美國(guó)introgentherapeutics公司于2002年率先開(kāi)發(fā)了攜帶il-24基因的重組腺病毒--“ingn241”，ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌的治療效果良好。與腺病毒載體相比，基因工程蛋白藥物更為安全，同時(shí)還具有藥理活性高、副作用小、用量少、生物活性強(qiáng)、療效好等特點(diǎn)。當(dāng)然，在蛋白質(zhì)多肽類藥物的臨床使用過(guò)程中也存在一些問(wèn)題，如易被蛋白水解酶水解、較短的循環(huán)半衰期、需要頻繁注射、較短的保存有效期、易被機(jī)體快速清除和易于引起中和抗體的產(chǎn)生等。因此，需求一種方法可以提高其穩(wěn)定性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

重組人il-24蛋白在哺乳動(dòng)物體系中表達(dá)水平極低，但體內(nèi)外的抑瘤活性高，終濃度為ng/ml，而在大腸桿菌中表達(dá)水平高，但活性較低，終濃度為ug/ml，甚至沒(méi)有活性?？紤]到聚乙二醇(polyethyleneglycol，peg)沒(méi)有免疫原性，親水性強(qiáng)，在水溶液中有較大的水動(dòng)力學(xué)體積，與蛋白質(zhì)的某些氨基酸結(jié)合后，在修飾蛋白質(zhì)的周圍產(chǎn)生空間屏障，減少蛋白的酶解，避免在機(jī)體代謝中被快速清除，同時(shí)考慮到peg是經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的極少數(shù)能作為體內(nèi)注射用藥的合成聚合物之一，本發(fā)明的申請(qǐng)人提出一種重組人il-24蛋白的peg修飾方法，來(lái)提高大腸桿菌中表達(dá)的重組人il-24蛋白的活性，提高穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其半衰期。

本發(fā)明目的在于，克服大腸桿菌表達(dá)的重組人il-24蛋白由于缺乏糖基化修飾等原因?qū)е禄钚暂^低的缺陷。本發(fā)明在制備高純度重組人il-24蛋白的基礎(chǔ)上，利用聚乙二醇對(duì)大腸桿菌表達(dá)的重組人il-24蛋白進(jìn)行定點(diǎn)修飾，來(lái)提高抑瘤活性，提高穩(wěn)定性，延長(zhǎng)半衰期。

本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種重組人il-24蛋白的peg修飾方法，其特征在于，包括以下步驟：

a.構(gòu)建人il-24的重組原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)，得到包涵體；

b.選擇變性劑，對(duì)所述包涵體進(jìn)行變性，得到變性后的蛋白；

c.確定復(fù)性條件，對(duì)所述變性后的蛋白進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性后的蛋白；

d.對(duì)所述復(fù)性后的蛋白進(jìn)行凝膠過(guò)濾純化，得到純化后的目的蛋白；

e.對(duì)所述純化后的目的蛋白用peg修飾劑進(jìn)行定點(diǎn)修飾，得到終產(chǎn)品。

本發(fā)明所述的il-24重組蛋白的peg修飾方法的步驟，其中，

步驟a中，首先，選取模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到成熟蛋白基因序列，將成熟蛋白基因序列克隆至載體，得到人il-24的重組原核表達(dá)載體，然后，確認(rèn)誘導(dǎo)條件，優(yōu)化表達(dá)條件，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到包涵體。其中，所述確定誘導(dǎo)條件包括選擇宿主菌，確定起始菌濃度，確定誘導(dǎo)劑及誘導(dǎo)劑終濃度，確定誘導(dǎo)溫度以及誘導(dǎo)時(shí)間。

優(yōu)選地，所述模板為il-24-flag質(zhì)粒；所述載體為pet-28a載體。

優(yōu)選地，所述宿主菌為大腸桿菌bl21。

優(yōu)選地，所述起始菌濃度od600值的范圍為0.6～0.8。

優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)劑為iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)劑)。

優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)劑的終濃度范圍為0.5mm～1mm。

優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)時(shí)間范圍為4～5h。

更優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)菌起始濃度od600值為0.6，所述誘導(dǎo)劑終濃度為0.5mm，所述誘導(dǎo)溫度為37℃，所述誘導(dǎo)時(shí)間為5h。

步驟b，變性前，洗滌所述包涵體，超聲碎菌后加入洗滌液對(duì)包涵體進(jìn)行離心洗滌，提高包涵體的純度；選擇變性劑，按照比例加入包涵體和變性劑進(jìn)行變性，震蕩過(guò)夜，得到變性后的蛋白。

優(yōu)選地，所述洗滌液包括tritonx-100、nacl、蒸餾水以及脲。

優(yōu)選地，所述變性劑包括鹽酸胍和脲，高濃度的脲和鹽酸胍的水溶液能斷裂氫鍵，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的變性，同時(shí)，還可以通過(guò)增大疏水基酸性殘基在水相中的溶解度，降低疏水相互作用；更優(yōu)選地，所述變性劑為鹽酸胍，重組人il-24蛋白成熟蛋白疏水性極強(qiáng)，包涵體主要為疏水性聚集，鹽酸胍對(duì)于疏水性聚集的溶解更好。

優(yōu)選地，所述包涵體與變性劑比例范圍為1g：10ml～1g：30ml；更優(yōu)選地，所述包涵體與變性劑比例為1g：20ml。

優(yōu)選地，所述變性劑在β-疏基乙醇還原二硫鍵的存在下，配制變性緩沖溶液進(jìn)行變性。更優(yōu)選地，所述β-疏基乙醇含量為所述變性緩沖液的1％。

步驟c，首先分析重組人il-24蛋白等電點(diǎn)，進(jìn)行等電點(diǎn)的模擬確定復(fù)性條件：確定復(fù)性液ph、氧化還原對(duì)及氧化還原對(duì)比例、以及復(fù)性添加劑；然后對(duì)步驟b得到的所述變性后的蛋白進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性后的蛋白。

優(yōu)選地，在酸性條件下進(jìn)行復(fù)性，ph越低，復(fù)性效果越好；更優(yōu)選地，所述復(fù)性液ph值為5.5。

優(yōu)選地，所述氧化還原對(duì)為谷胱甘肽(gsh-gssg)；更優(yōu)選地，所述氧化還原對(duì)比例為1:1左右，二硫鍵正確配對(duì)率高。

優(yōu)選地，所述復(fù)性添加劑為精氨酸、脲、鹽酸胍和甘油；更優(yōu)選地，所述復(fù)性添加劑為脲，脲溶于水后不會(huì)電離出離子，助溶效果好。

優(yōu)選地，所述復(fù)性添加劑濃度范圍為0.5m～3m；更優(yōu)選地，所述復(fù)性添加劑為濃度為2m。

步驟d，在步驟c得到的所述復(fù)性后的蛋白中，添加表面活性劑，然后采用凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行一步凝膠過(guò)濾純化，得到純化后的目的蛋白，再脫鹽除去sds得到純度較高的復(fù)性蛋白。

優(yōu)選地，所述凝膠過(guò)濾柱為ge公司的生產(chǎn)的s200/75。

優(yōu)選地，所述表面活性劑為陰離子表面活性劑，更優(yōu)選地，所述表面活性劑為高級(jí)脂肪醇硫酸酯類，特別優(yōu)選地，sds(十二烷基硫酸鈉溶液)表面活性劑，重組人il-24蛋白具有疏水性極強(qiáng)，容易與純化所用的介質(zhì)相互作用以及對(duì)高鹽及其敏感。

步驟e中，所述定點(diǎn)修飾包括：確定peg修飾劑的修飾條件，選擇peg修飾劑，確定peg與蛋白質(zhì)摩爾數(shù)比例，對(duì)步驟d得到的所述純化后的目的蛋白進(jìn)行定點(diǎn)修飾，混勻，加入氰基硼氫化鈉，混勻靜置，得到終產(chǎn)品。

優(yōu)選地，所述peg修飾劑的修飾條件為酸性條件。

優(yōu)選地，所述peg修飾劑為醛基修飾劑，更優(yōu)選地，所述peg修飾劑為mpeg-ald(甲氧基聚乙二醇-丙醛)。

優(yōu)選地，優(yōu)選分子量為5、20和30kd的mpeg-ald進(jìn)行定點(diǎn)修飾，更優(yōu)選地，選擇分子量為5kd的mpeg-ald進(jìn)行定點(diǎn)修飾，經(jīng)過(guò)5kd修飾的蛋白可以過(guò)柱子把一些過(guò)量沒(méi)修飾的peg分離開(kāi)來(lái)。

優(yōu)選地，所述peg與蛋白質(zhì)摩爾數(shù)比為1:10。

優(yōu)選地，所述重組人il-24蛋白的peg修飾方法，包括，利用原核表達(dá)載體pet-28a在細(xì)菌中表達(dá)的重組人il-24蛋白經(jīng)過(guò)iptg誘導(dǎo)后存在于包涵體中，；重組人il-24蛋白經(jīng)變性劑6m鹽酸胍變性，復(fù)性劑透析過(guò)夜后，在1％sds存在的條件下，經(jīng)凝膠過(guò)濾純化得到高純度的單體重組人il-24蛋白；用mpeg-ald(單甲氧基聚乙二醇-丙醛)定點(diǎn)修飾；其中，所述iptg誘導(dǎo)條件：宿主菌bl21、誘導(dǎo)菌起始濃度od600為0.6，誘導(dǎo)劑iptg終濃度0.5mm，在37℃下誘導(dǎo)5h；所述復(fù)性劑：20mm乙酸-乙酸鈉，2m脲，1mmgssg，1mmgsh，ph5.5。

本發(fā)明的另一方面，還公開(kāi)一種上述方法在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

一種peg修飾的重組人il-24蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其中，所述腫瘤為黑色素瘤。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明重組人il-24蛋白的peg修飾方法的有益效果：

1)現(xiàn)有技術(shù)重組人il-24蛋白在大腸桿菌中表達(dá)水平高，但活性較低，甚至沒(méi)有活性。本發(fā)明peg修飾大腸桿菌中表達(dá)的重組人il-24蛋白，表達(dá)水平高、活性損失較少。

2)現(xiàn)有技術(shù)蛋白質(zhì)多肽類藥物易被蛋白水解酶水解，而聚乙二醇沒(méi)有免疫原性，親水性強(qiáng)，在水溶液中有較大的水動(dòng)力學(xué)體積，本發(fā)明采用聚乙二醇進(jìn)行修飾，與蛋白質(zhì)的某些氨基酸結(jié)合后，在修飾蛋白質(zhì)的周圍產(chǎn)生空間屏障，減少蛋白的酶解，避免在機(jī)體代謝中被快速清除，提高穩(wěn)定性。

3)經(jīng)過(guò)peg修飾后的重組人il-24蛋白半衰期進(jìn)一步延長(zhǎng)，且其體外抑瘤活性不受影響，在體內(nèi)存留時(shí)間延長(zhǎng)，藥物利用率增加，提高了穩(wěn)定性和生物學(xué)活性。

4)經(jīng)過(guò)peg修飾后的重組人il-24蛋白對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞a375有顯著的抑瘤活性。

附圖說(shuō)明

圖1a是構(gòu)建人il-24的重組原核表達(dá)載體時(shí)pcr擴(kuò)增il-24片段圖。其中，泳道1為dnamarkerdl2000；泳道2為陰性對(duì)照；泳道3為擴(kuò)增出的il-24m1片段。

圖1b是構(gòu)建人il-24的重組原核表達(dá)載體時(shí)雙酶切鑒定結(jié)果。其中，泳道1為dnamarkerdl15000；泳道2為未雙酶切重組質(zhì)粒；泳道3為雙酶切重組質(zhì)粒；泳道4為dnamarkerdl2000。

圖1c是重組人il-24蛋白在細(xì)菌bl21中的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，sds-page考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。其中，泳道1為marker；泳道2為未誘導(dǎo)菌裂解液；泳道3為誘導(dǎo)菌裂解液；泳道4為誘導(dǎo)菌裂解液上清；泳道5為誘導(dǎo)菌裂解液沉淀(包涵體)。

圖1d是重組人il-24蛋白在細(xì)菌bl21中的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)wb檢測(cè)結(jié)果。

圖2a是sds-page考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)不同洗滌劑對(duì)包涵體的清洗效果圖。其中，lane1為marker；lane2為對(duì)照即未洗包涵體；lane3和lane4為1％triton洗滌包涵體后的上清c和沉淀p；lane5和lane6為1mnacl洗滌包涵體后的上清c和沉淀p；lane7和8為2m脲洗滌包涵體的上清c和沉淀p。

圖2b是sds-page考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)不同變性劑鹽酸胍和脲變性重組人il-24蛋白包涵體的效果。其中，lane1為marker；lane2為對(duì)照；lane3和lane4為鹽酸胍變性后的上清c和沉淀p；lane5和lane6為脲變性后的上清c和沉淀p。

圖2c是sds-page考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)ph和氧化還原對(duì)比例對(duì)復(fù)性的影響。

圖2d是wb檢測(cè)ph和氧化還原對(duì)比例對(duì)復(fù)性的影響。

圖2e是sds-page考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)不同復(fù)性添加劑稀釋復(fù)性的效果。其中，lane1為marker；lane2為0.5m精氨酸；lane3和lane4為2m脲和3m脲；lane5和lane6為0.5m鹽酸胍和1m鹽酸胍；lane7、lane8和lane9為10％甘油、15％甘油和20％甘油。

圖2f是antheprot軟件模擬重組人il-24蛋白的等電點(diǎn)為ph8.8。

圖3a是il-24m1重組蛋白hpsec純化復(fù)性后的樣品。

圖3b是非還原性sds-page考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)純化后的樣品。其中，lane1為marker；lane2為未純化il-24重組蛋白；lane3為p1；lane4為p2；lane5為p3。

圖3c是還原性sds-page考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化后的樣品。其中，lane1為marker；lane2為未純化il-24重組蛋白；lane3為p1；lane4為p2；lane5為p3。

圖3d是westernblot檢測(cè)純化后的樣品。其中，lane1為未純化il-24重組蛋白；lane2為p1；lane3為p2；lane4為p3。

圖4a是細(xì)菌表達(dá)重組人il-24蛋白peg修飾后sds-page考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)結(jié)果。其中，lane1為marker；lane2為未修飾重組人il-24蛋白；lane3為mpeg-ald，5kd且peg與蛋白質(zhì)摩爾數(shù)比為1:5修飾樣品；lane4為mpeg-ald，5kd且peg與蛋白質(zhì)摩爾數(shù)比為1:10修飾樣品；lane5為mpeg-ald，20kd且peg與蛋白質(zhì)摩爾數(shù)比為1:5修飾樣品；lane6為mpeg-ald，20kd且peg與蛋白質(zhì)摩爾數(shù)比為1:10修飾樣品；lane7為mpeg-ald，30kd且peg與蛋白質(zhì)摩爾數(shù)比為1:5修飾樣品；lane8為mpeg-ald，30kd且peg與蛋白質(zhì)摩爾數(shù)比為1:10修飾樣品。

圖4b是細(xì)菌表達(dá)重組人il-24蛋白peg修飾后sds-page碘染檢測(cè)結(jié)果。其中，樣品上樣順序同圖4a。

圖4c是細(xì)菌表達(dá)重組人il-24蛋白peg修飾后wb檢測(cè)結(jié)果。其中，lane1為未修飾重組人il-24蛋白。

圖5a是以pbs對(duì)照組od值作為1，不同濃度buffer、il-24和peg-il-24測(cè)試細(xì)胞的存活率結(jié)果示意圖。

圖5b是以buffer對(duì)照組od值作為1，不同濃度il-24和peg-il-24測(cè)試細(xì)胞的存活率結(jié)果示意圖。

圖6是大鼠尾靜脈分別注射peg-rhil-24、rhil-24和bufferb，不同時(shí)間點(diǎn)所取血漿中il-24濃度變化的示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖與具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案。

本發(fā)明所述重組人il-24蛋白的peg修飾方法，利用原核表達(dá)載體pet-28a在細(xì)菌中表達(dá)的重組人il-24蛋白經(jīng)過(guò)iptg誘導(dǎo)，其中，宿主菌bl21、誘導(dǎo)菌起始濃度od600為0.6，誘導(dǎo)劑iptg終濃度0.5mm，37℃誘導(dǎo)5h，誘導(dǎo)后存在于包涵體中；重組人il-24蛋白經(jīng)變性劑6m鹽酸胍變性，復(fù)性劑20mm乙酸-乙酸鈉，2m脲，1mmgssg，1mmgsh，ph5.5的透析過(guò)夜后，在1％sds存在的條件下，經(jīng)凝膠過(guò)濾純化得到高純度的單體重組人il-24蛋白；熒光光譜顯示空間結(jié)構(gòu)正確；sds-page電泳后烤染和碘染，以及western-blot顯示重組人il-24蛋白能夠被單甲氧基聚乙二醇-丙醛20000(mpeg-ald20000)修飾；mtt實(shí)驗(yàn)表明，peg-rhil-24和rhil-24都具有抑瘤活性，藥代動(dòng)力學(xué)顯示peg修飾能夠顯著提高重組人il-24蛋白的穩(wěn)定性和半衰期。

具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

a.構(gòu)建人il-24的重組原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá),得到包涵體。

以il-24-flag質(zhì)粒為模板，利用設(shè)計(jì)的上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物il-24約450bp，pcr擴(kuò)增il-24片段如圖1a泳道3所示。pcr產(chǎn)物回收后，將il-24成熟蛋白基因序列克隆至pet-28a載體，用bamhⅰ和salⅰ雙酶切鑒定重組克隆(限制性內(nèi)切酶、t4dna連接酶、dnamarker購(gòu)自takara公司)，獲得約450bp大小目的片段如圖1b泳道3所示，將il-24表達(dá)重組載體命名為pet-28a-il-24。將重組表達(dá)載體pet28a-il-24轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌bl21中，確定起始菌濃度od600＝0.6，選擇iptg誘導(dǎo)劑，iptg終濃度為0.5mm，37℃條件下，誘導(dǎo)5h，12000rpm離心收集菌體。按1g菌體和10ml碎菌液的比例加入碎菌液20mmtris-hcl，1mmedta，ph8.5中攪拌均勻；離心收集上清和沉淀通過(guò)sds-page考馬斯亮藍(lán)染色和wb鑒定。

sds-page考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果如圖1c所示：在誘導(dǎo)菌全菌裂解液圖1c泳道3和裂解液沉淀圖1c泳道5的15--25kd之間可見(jiàn)到明顯的誘導(dǎo)帶，而誘導(dǎo)菌上清中圖1c泳道4未見(jiàn)到相應(yīng)的誘導(dǎo)帶。

wb檢測(cè)結(jié)果如圖1d所示，wb檢測(cè)顯示在細(xì)菌裂解液沉淀中出現(xiàn)重組蛋白的誘導(dǎo)帶，一抗分別為il-24抗體af1965(從rd公司購(gòu)得)和his單抗。wb檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)菌裂解液沉淀中重組蛋白的誘導(dǎo)帶可被il-24的抗體af1965和his-tag的抗體識(shí)別，重組人il-24蛋白在細(xì)菌中獲得正確表達(dá)，并含有his標(biāo)簽，但重組蛋白只在包涵體即裂解液的沉淀中表達(dá)，在上清中幾乎不表達(dá)。

b.選擇變性劑對(duì)所述包涵體進(jìn)行變性，得到變性后的蛋白。

變性前，洗滌所述包涵體：超聲碎菌后按1g包涵體和10ml洗滌液的比例，分別加入1％tritonx-100、1mnacl和2m脲各離心洗滌包涵體一次，4℃10000rpm離心40min，洗滌好的包涵體用蒸餾水重懸，離心，完全去除洗滌液。sds-page考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)不同洗滌劑對(duì)包涵體的清洗效果如圖2a所示，包涵體的純度得到提高。

用兩種變性劑脲和鹽酸胍分別對(duì)包涵體進(jìn)行變性檢測(cè)，高濃度的脲和鹽酸胍的水溶液能斷裂氫鍵，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的變性，同時(shí)，還可以通過(guò)增大疏水基酸性殘基在水相中的溶解度，降低疏水相互作用。按1g包涵體和20ml變性劑的比例加入變性buffer(變性緩沖液)。

變性bufferⅰ：20mm，tris-hcl緩沖液,6m鹽酸胍，1％β-巰基乙醇，ph8.5，對(duì)包涵體進(jìn)行變性，室溫震蕩過(guò)夜，4℃10000rpm離心20min取上清，沉淀用水重懸。

變性bufferⅱ：20mm，tris-hcl緩沖液,8m脲，1％β-巰基乙醇，ph8.5，對(duì)包涵體進(jìn)行變性，室溫震蕩過(guò)夜，4℃10000rpm離心20min取上清，沉淀用水重懸。

用bradford法測(cè)定兩種變性buffer下，包涵體上清中的蛋白濃度。sds-page考馬斯亮藍(lán)染色測(cè)試不同變性劑的變性效果如圖2b所示，采用鹽酸胍變性劑變性上清中的目的蛋白量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于采用脲變性劑的蛋白量；鹽酸胍變性后不溶物質(zhì)的量明顯少于脲變性的。由此確定6m鹽酸胍作為重組人il-24蛋白的變性劑更好，重組人il-24成熟蛋白疏水性極強(qiáng)，包涵體主要為疏水性聚集，鹽酸胍對(duì)于疏水性聚集的溶解更好。

c.確定復(fù)性條件，對(duì)所述變性后的蛋白進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性后的蛋白。

首先，利用antheprot軟件分析重組人il-24蛋白等電點(diǎn)，等電點(diǎn)約為8.8，如圖2f所示。將重組人il-24蛋白的氨基酸序列導(dǎo)入antheprot軟件中，進(jìn)行等電點(diǎn)的模擬；其次，根據(jù)對(duì)重組人il-24蛋白等電點(diǎn)的模擬結(jié)果，確定復(fù)性液ph和氧化還原對(duì)比例，

確定復(fù)性液ph：設(shè)置不同的復(fù)性液ph值分別為5.5、6.4、9.5和10，將變性后的蛋白用不同ph值的溶液稀釋至0.1mg/ml，4℃靜置20h，通過(guò)wb檢測(cè)復(fù)性效果，結(jié)果顯示復(fù)性液酸性條件下ph值為5.5時(shí)效果最好。

選擇氧化還原對(duì)為谷胱甘肽(gsh-gssg)。確定復(fù)性buffer中氧化還原對(duì)谷胱甘肽(gsh-gssg)比例：將變性后的蛋白用含有2m脲的20mmhac-naacph5.5溶液稀釋至蛋白濃度0.1mg/ml，均分為四份，分別加入摩爾濃度比例為10:1的gsh和gssg，摩爾濃度比例為5:1的gsh和gssg，摩爾濃度比例為1:1的gsh和gssg，摩爾濃度比例為1:2的gsh和gssg，均輕輕混勻后，4℃靜置過(guò)夜。12000rpm，4℃離心20min，取同樣體積上清，用bradford法測(cè)蛋白濃度。用sds-page考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)ph和氧化還原對(duì)比例對(duì)復(fù)性的影響如圖2c所示，用wb檢測(cè)ph和氧化還原對(duì)比例對(duì)復(fù)性的影響如圖2d所示。結(jié)果顯示在復(fù)性條件為ph5.5和gsh：gssg＝1:1時(shí)，復(fù)性后的上清中目的蛋白量最多，復(fù)性效果最好。

復(fù)性添加劑的篩選；將變性后的重組蛋白用復(fù)性buffer：20mmhac-naac，1mmgssg，1mmgsh，ph5.5稀釋至0.1mg/ml后，分成多份，分別加入復(fù)性添加劑，分別加入精氨酸、脲、鹽酸胍和甘油，使其終濃度分別為精氨酸0.5mm、脲2m和3m、鹽酸胍0.5m和1m、甘油10％、15％和20％；輕輕混勻后，4℃靜置過(guò)夜；將復(fù)性過(guò)夜的樣品12000rpm，4℃離心20min后取上清，用bradford法測(cè)不同變性添加劑上清中的蛋白濃度如表1所示：復(fù)性溶液中添加脲后，溶液中復(fù)性上清中蛋白濃度最高，2m脲和3m脲基本無(wú)區(qū)別；而添加精氨酸的蛋白濃度最低。用sds-page考馬斯亮藍(lán)染色分析不同復(fù)性添加劑稀釋復(fù)性的效果如圖2e所示，脲的助溶效果最好。

綜上，最終確定重組人il-24蛋白的復(fù)性條件為：20mm的hac-naac，2m的脲，1mm的gsh，1mm的gssg，ph5.5，4℃透析過(guò)夜。

表1不同復(fù)性添加劑處理變性的重組人il-24蛋白后總蛋白濃度比較

d.在對(duì)所述復(fù)性后的蛋白添加sds表面活性劑的條件下，用凝膠過(guò)濾柱一步凝膠過(guò)濾純化，脫鹽除去sds，得到純化后的目的蛋白；進(jìn)行高級(jí)法相表征。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)重組人il-24蛋白對(duì)于ph值、鹽濃度以及介質(zhì)極其敏感，該蛋白為強(qiáng)疏水性蛋白。重組人il-24蛋白在中性ph、堿性ph，以及在高濃度的鹽存在的情況下均會(huì)沉淀，而鎳柱親和層析在ph偏堿的條件下洗脫效率較好，陽(yáng)離子交換需要用高鹽洗脫，同時(shí)，重組人il-24蛋白包涵體純度比較高，因此最終選擇采用添加陰離子表面活性劑sds，乳化性很強(qiáng)，且較穩(wěn)定，可將疏水性聚集打開(kāi)，進(jìn)行一步凝膠過(guò)濾純化。具體步驟：將復(fù)性后的樣品加入sds使其終濃度為1％，用從ge公司購(gòu)得的s200/75凝膠過(guò)濾柱純化，buffer為20mm的hac-naac，1％sds，ph5.5，上樣量5mg，流速1ml/min收取約12ml處的蛋白峰如圖3a的hpsec純化復(fù)性后樣品所示，出現(xiàn)3個(gè)明顯的峰p1、p2和p3。用非還原性sds-page考馬斯亮藍(lán)染色如圖3b所示，結(jié)果顯示p1、p3在20kd處，p2在40kd處，表明p2為二硫鍵錯(cuò)配導(dǎo)致的二聚體。用還原性sds-page考馬斯亮藍(lán)染檢測(cè)純化后的樣品如圖3c所示，結(jié)果顯示p1、p2和p3出現(xiàn)在同一位置。用wb檢測(cè)結(jié)果如圖3d顯示：顯示p1、p3在20kd處，p2在40kd處，綜合以上結(jié)果，判斷p1峰為疏水性聚集，p2為二硫鍵錯(cuò)配導(dǎo)致的二聚體，p3為單體。收集p3峰，獲得純的重組人il-24蛋白。

高級(jí)法相表征：通過(guò)熒光光譜分析重組人il-24蛋白，分別將復(fù)性后的蛋白，凝膠純化的三個(gè)峰p1、p2、p3各1.5ml加入石英比色皿中，以變性蛋白作為對(duì)照，在激發(fā)波長(zhǎng)295nm下掃描300-450nm的吸光度。結(jié)果顯示，變性蛋白最大吸收峰在350nm，凝膠純化p1、p2、p3最大吸收峰分別為340nm、343nm和345nm。變性蛋白結(jié)構(gòu)松散，相對(duì)于復(fù)性蛋白發(fā)生紅移。結(jié)合凝膠純化結(jié)果，p1、p2和p3均為il-24的不同形式，p1為疏水性多聚體，藍(lán)移最明顯。p2為二硫鍵錯(cuò)配引起的二聚體，藍(lán)移較少。p3為單體，最大吸收峰介于p1、p2和變性蛋白之間，結(jié)果與電泳結(jié)果吻合。透析復(fù)性過(guò)夜的最大吸收峰在341nm處，說(shuō)明復(fù)性過(guò)夜的樣品主要以疏水性聚集的形式存在。

e.對(duì)所述純化后的目的蛋白進(jìn)行peg定點(diǎn)修飾，得到終產(chǎn)品。

由于復(fù)性后的重組人il-24蛋白對(duì)于ph極其敏感，只在酸性條件下穩(wěn)定且多以可溶性疏水聚集為主，因此在酸性條件下進(jìn)行peg定點(diǎn)修飾。

將復(fù)性的凝膠過(guò)濾純化的重組人il-24蛋白，按peg與蛋白質(zhì)摩爾數(shù)比a:b＝1:5和1：10。分別加入三種不同分子量5kd、20kd和30kd的甲氧基聚乙二醇丙醛(mpeg-ald)進(jìn)行定點(diǎn)修飾(mpeg-ald5kd、20kd和30kd購(gòu)自北京鍵凱科技有限公司)，即peg的用量分別為5mg，20mg，30mg，重組人il-24蛋白的用量為1mg，混勻；各加入10倍peg摩爾數(shù)比的氰基硼氫化鈉，輕輕混勻；室溫靜置反應(yīng)16h。sds-psge考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)peg修飾的效果如圖4a所示；碘染對(duì)peg修飾的效果如圖4b所示；wb對(duì)peg修飾的效果如圖4c所示。結(jié)果顯示三種不同的peg都能成功的修飾上重組人il-24蛋白，且在peg與蛋白質(zhì)摩爾數(shù)比a:b＝1:5和1：10兩種條件中，a:b＝1：10的效果要好一些。由于peg修飾對(duì)原蛋白重組人il-24蛋白影響挺大的，wb中蛋白帶會(huì)受到一些美觀的影響，修飾后的純化，因?yàn)榻?jīng)過(guò)5kd修飾的蛋白可以過(guò)柱子把一些過(guò)量沒(méi)修飾的peg分離開(kāi)來(lái)，所以選的分子量5kd的mpeg-ald。

檢測(cè)peg定點(diǎn)修飾對(duì)重組人il-24蛋白的體外抑瘤活性的影響：為了分析大腸桿菌表達(dá)的rhil-24和被peg-rhil-24在體外是否有抑瘤活性，將兩種蛋白的相同終濃度加入到a375細(xì)胞的培養(yǎng)液中進(jìn)行mtt檢測(cè)。用mtt測(cè)定大腸桿菌重組il-24蛋白抑制人黑色素瘤細(xì)胞a375體外增殖能力。加入不同濃度(0.1、1和10μg/ml)純化的rhil-24和peg-rhil-24孵箱中培養(yǎng)后用酶標(biāo)儀測(cè)定od490值；將對(duì)照組值作為1看其細(xì)胞的存活率，確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。圖5a所示以pbs對(duì)照組od值作為1測(cè)試結(jié)果；圖5b所示以buffer對(duì)照組od值作為1測(cè)試結(jié)果，結(jié)果表明，rhil-24和peg-rhil-24在(0.1、1和10μg/ml)下對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞a375都有顯著性的抑瘤活性，且抑瘤活性呈劑量依賴性。在相同的濃度下，peg-rhil-24和rhil-24的抑瘤活性差異不大，在蛋白濃度為10μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率分別為33.7％和35.2％，在蛋白濃度為1μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率分別為58.9％和58.4％，在蛋白濃度為0.1μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率分別為分別為80.2％和90.7％，peg-rhil-24對(duì)黑色素瘤細(xì)胞抑瘤活性微低于rhil-24。

peg定點(diǎn)修飾對(duì)重組人il-24蛋白半衰期的影響：進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，由于純化后和修飾后的蛋白緩沖液是buffera：含10mg/mlsds的ph5.5，20mm的naac-hac溶液，高劑量的sds會(huì)導(dǎo)致大鼠溶血作用從而導(dǎo)致死亡，所以選取了200μl含有sds不同濃度0.001，0.01，0.1，1和10mg/ml的ph5.5，20mmnaac-hac溶液尾靜脈注射大鼠，發(fā)現(xiàn)注射低于0.1mg/ml的sds大鼠的生理狀態(tài)和存活情況基本良好。于是我們將溶于buffera中peg-rhil-24和rhil-24通過(guò)透析置換到bufferb：含0.1mg/mlsds的ph5.5，20mm的naac-hac溶液中，置換后蛋白沒(méi)有發(fā)生沉降。再用bufferb將蛋白超濾至1.25mg/ml；然后按照1mg/kg劑量尾靜脈注射sd大鼠，9只雄鼠，隨機(jī)分三組，分別注射peg-rhil-24、rhil-24和對(duì)照組bufferb，注射后，在不同時(shí)間點(diǎn)0.5、1.5、3、6、12、24、48和72h斷尾采血各收集0.5ml血液，加入edta-na2抗凝劑，離心取血清，做elisa檢測(cè)，分別測(cè)出不同時(shí)間點(diǎn)的il-24蛋白濃度，如圖6所示。由于蛋白藥物在體內(nèi)分為吸收、消除和吸收并存、完全消除三個(gè)階段，選取消除期的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)6、12、24和48h，根據(jù)公式t1/2＝0.693/k，其中，k為消除常數(shù)，k＝(lntb-lnta)/(ta-tb))計(jì)算出il-24蛋白的半衰期。結(jié)果表明,peg-rhil-24和rhil-24兩種蛋白隨著時(shí)間延長(zhǎng)在體內(nèi)逐漸降解，而對(duì)照組注射bufferb大鼠血漿中il-24濃度極低，而且隨著時(shí)間延長(zhǎng)基本保持不變。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析t檢驗(yàn)顯示，除了0.5h外，其余時(shí)間兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿中的il-24濃度都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(p值分別為0.002、0.006、0.01、0.022、0.078和0.093)。濃度相差最大的時(shí)間點(diǎn)在12h，peg-rhil-24和rhil-24濃度分別為1369pg/ml和451pg/ml。根據(jù)公式，用消除期的il-24濃度計(jì)算出重組人il-24蛋白半衰期為12.62h，peg-rhil-24半衰期為18.44h，結(jié)果表明peg定點(diǎn)修飾后重組人il-24蛋白的半衰期明顯延長(zhǎng)，由此可以提高重組人il-24蛋白穩(wěn)定性。

綜上所述，本發(fā)明采用聚乙二醇對(duì)大腸桿菌表達(dá)的重組人il-24蛋白的進(jìn)行定點(diǎn)修飾，與蛋白質(zhì)的某些氨基酸結(jié)合后，在修飾蛋白質(zhì)的周圍產(chǎn)生空間屏障，減少蛋白的酶解，避免在機(jī)體代謝中被快速清除。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)菌中表達(dá)的重組人il-24蛋白表達(dá)水平高，以包涵體形式表達(dá)，復(fù)性蛋白主要以疏水性聚集存在，得到高純度的結(jié)構(gòu)正確的重組人il-24蛋白。peg修飾后il-24人重組蛋白的穩(wěn)定性提高，半衰期延長(zhǎng)，且抑瘤活性不受影響，尤其提高了對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞的抑瘤活性，為在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

以上對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行了描述，但本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方式，上述的具體實(shí)施方式僅僅是示意性的，并不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可以做出很多形式，這些均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。