本發(fā)明屬于海洋動(dòng)物功能基因和免疫活性蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種重組的長(zhǎng)牡蠣cgc1qdc-3蛋白的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

含有與補(bǔ)體c1q分子類似的c1q球狀結(jié)構(gòu)域的蛋白，統(tǒng)稱為c1qdc蛋白(c1qdomaincontainingprotein)，c1qdc蛋白在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。在脊椎動(dòng)物中，c1qdc蛋白主要通過參與補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑的激活而發(fā)揮免疫作用。在無脊椎動(dòng)物中，c1qdc蛋白的功能趨于多樣化。目前發(fā)現(xiàn)無脊椎動(dòng)物c1qdc具有凝集微生物的活性，存在凝集素進(jìn)化的痕跡；部分c1qdc能與熱聚合的人igg分子相互作用，為補(bǔ)體經(jīng)典途徑的進(jìn)化提供了有力證據(jù)。但是目前的研究顯示，c1qdc蛋白在無脊椎動(dòng)物中主要作為模式識(shí)別受體(patternrecognitionreceptors，prrs)，能識(shí)別多種的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，pamps)，調(diào)理病原菌引發(fā)吞噬作用，從而達(dá)到清除病原體的目的。

目前發(fā)現(xiàn)c1qdc蛋白廣泛存在于哺乳動(dòng)物、低等脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物，廣譜性或特異性識(shí)別pamps，介導(dǎo)下游的病原菌和凋亡細(xì)胞的清除、促進(jìn)細(xì)胞吞噬、細(xì)胞趨化、細(xì)胞黏附、炎癥及氧化應(yīng)激等重要的免疫反應(yīng)過程。但是對(duì)c1qdc蛋白的pamps結(jié)合特異性、結(jié)合強(qiáng)度及不同c1qdc蛋白的功能差異的研究相對(duì)匱乏。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種重組的長(zhǎng)牡蠣cgc1qdc-3蛋白的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種重組的長(zhǎng)牡蠣cgc1qdc-3蛋白的應(yīng)用，重組cgc1qdc-3蛋白在制備高親和力特異識(shí)別脂多糖lps的藥物中的應(yīng)用。

所述重組的長(zhǎng)牡蠣cgc1qdc-3蛋白的獲得：

1)以長(zhǎng)牡蠣cdna為模板，采用p1和p2為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，待用；

2)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與pmd19-t載體連接，而后將連接產(chǎn)物與原核表達(dá)載體經(jīng)ecori，bamhi雙酶切后經(jīng)過t4連接酶連接；

3)將上述構(gòu)建載體轉(zhuǎn)入菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，而后純化、透析、凍干，即得到重組cgc1qdc-3蛋白；

所述引物p1和p2分別為：

p1：5’-cgcggatccattccaataaacaccatctcc-3’；

p2：5’-ccggaattcttaggatagtttgaagccggag-3’。

所述步驟2)原核表達(dá)載體為pet-30a(+)；菌株為大腸桿菌transetta(de3)。

所述步驟3)經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后采用鎳柱純化獲得可溶性重組蛋白，而后透析除鹽、凍干。

所述采用鎳柱純化過程：采用鎳瓊脂糖凝膠ff裝柱將經(jīng)破碎后誘導(dǎo)培養(yǎng)物上柱，在以2mlmin^-1流速用tbs緩沖液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)平衡清洗2-5個(gè)床體積，再以流速為2mlmin^-1流速用含10mm的咪唑的tbs緩沖液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)進(jìn)行漂洗，收集洗脫峰流出液，最后以流速為1mlmin^-1流速用含250mm的咪唑的tbs緩沖液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰流出純化蛋白。

所述重組蛋白氨基酸序列如seqidn0.1所示。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明以長(zhǎng)牡蠣為研究對(duì)象，利用分子生物學(xué)、免疫學(xué)等手段，獲得長(zhǎng)牡蠣c1qdc重組蛋白，所得重組蛋白可作為prrs特異性識(shí)別lps,且結(jié)合力較強(qiáng)，在監(jiān)控革蘭氏陰性菌入侵的過程中發(fā)揮重要作用。對(duì)長(zhǎng)牡蠣c1qdc分子生物學(xué)功能的研究，本發(fā)明c1qdc重組蛋白的pamps結(jié)合活性、結(jié)合特異性與其病原識(shí)別功能的聯(lián)系，其可以特異的識(shí)別病原相關(guān)分子模式脂多糖lps，對(duì)lps結(jié)合親和力較強(qiáng)(平衡解離常數(shù)kd＝8.74×10^-7m)；并且其進(jìn)一步的揭示無脊椎動(dòng)物c1qdc分子在免疫系統(tǒng)中識(shí)別及清除病原的規(guī)律，最終為其應(yīng)用于病害防控、藥物研發(fā)提供理論指導(dǎo)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的表達(dá)和純化的長(zhǎng)牡蠣cgc1qdc-3重組蛋白電泳圖，其中，m：蛋白marker；lane1：加入iptg誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物；lane2：未加iptg誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物；lane3：純化的重組蛋白。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的spr分析重組蛋白對(duì)多種pamps的結(jié)合活性圖，其中，control，對(duì)照；lps，脂多糖；pgn，肽聚糖；glucan，葡聚糖；lta，脂磷壁酸；man，甘露糖；polyi:c，聚肌苷酸-聚胞苷酸。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的spr測(cè)定重組蛋白對(duì)lps的動(dòng)力學(xué)結(jié)合曲線圖，其中，ru，反應(yīng)單位。(cgc1qdc-3重組蛋白對(duì)lps結(jié)合的平衡解離常數(shù)為kd＝8.74×10^-7m。)

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不限于此。

實(shí)施例1長(zhǎng)牡蠣cgc1qdc-3重組蛋白的構(gòu)建：

1.重組載體的構(gòu)建：本發(fā)明中采用的重組載體為novagen公司的pet-30a(+)原核表達(dá)載體。通過pcr技術(shù)，模板為長(zhǎng)牡蠣cdna，使用3’和5’末端分別添加了ecori，bamhi特定酶切位點(diǎn)的基因特異性引物p1(5’-cgcggatccattccaataaacaccatctcc-3’)和p2(5’-ccggaattcttaggatagtttgaagccggag-3’)擴(kuò)增長(zhǎng)牡蠣cgc1qdc-3蛋白基因編碼區(qū)。反應(yīng)條件為：首先94℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)：94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。將pcr產(chǎn)物純化回收，與pmd19-t載體連接。轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆利用載體引物進(jìn)行菌落pcr篩選并測(cè)序，驗(yàn)證測(cè)序正確后用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性克隆質(zhì)粒(大連寶生物工程有限公司)，待用；使用ecori，bamhi雙酶切陽性克隆質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)對(duì)酶切產(chǎn)物純化回收；純化片段與經(jīng)ecori，bamhi雙酶切的表達(dá)載體pet-30a(+)連接，完成載體的構(gòu)建。

所述引物p1和p2分別為：

p1：5’-cgcggatccattccaataaacaccatctcc-3’；

p2：5’-ccggaattcttaggatagtttgaagccggag-3’。

2.重組蛋白的表達(dá)：以transseta(de3)為重組表達(dá)菌株，將上述構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證讀碼框正確。挑取陽性單克隆，接種于6mllb液體培養(yǎng)基中，37℃在搖床中劇烈震蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，然后以1：100的比例接種于400mllb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至od600＝0.4-0.8。加入iptg，使終濃度達(dá)到1mm/ml，16℃，120rpm繼續(xù)過夜培養(yǎng)20h。4℃，8000rpm，離心10min，收集菌體，于-80℃凍存?zhèn)溆?。?ml菌液離心，棄去上清后，加入80μltbs緩沖液和20μl5×蛋白上樣緩沖液(常規(guī)通用試劑)，100℃沸水煮沸10分鐘，sds-page檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物。

3.重組蛋白的純化與濃縮：將上述所得誘導(dǎo)蛋白采用鎳瓊脂糖凝膠ff純化獲得了可溶重組蛋白，透析到tbs緩沖液除鹽和咪唑，即獲得seqidno.1所示的重組蛋白。

所述蛋白純化方法具體操作步驟如下：

鎳瓊脂糖凝膠ff色譜分離帶his標(biāo)簽的重組蛋白：

(1)鎳瓊脂糖凝膠ff裝柱，1.6×20cm，柱床體積為10ml；

(2)用tbs緩沖液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)；平衡2-5個(gè)床體積，流速為2mlmin^-1；

(3)將20ml含細(xì)菌破碎物的tbs緩沖液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，上樣，流速為1mlmin^-1；

(4)用tbs緩沖液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)再洗2-5個(gè)床體積，流速為2mlmin^-1；

(5)用含10mm的咪唑的tbs緩沖液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)進(jìn)行漂洗，流速為2mlmin^-1，收集洗脫峰流出液；

(6)用含250mm的咪唑的tbs緩沖液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)進(jìn)行洗脫，流速為1mlmin^-1，收集洗脫峰流出液，用sds-page檢測(cè)流出液所含蛋白。表達(dá)和純化結(jié)果如圖1：m：蛋白marker；lane1：加入iptg誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物；lane2：未加iptg誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物；lane3；純化的重組蛋白；

(7)用30％異丙醇流洗5個(gè)柱床體積，再用20％的乙醇保存柱子。

seqidno.1

ipintiskhktlvydrvetnagkgydarsgqftapesglyvfhtsttaqdkshstievvkngevkdmswadamehidravastmtilsltkgdivsvrvgityggnllesdqytrmsfsgfkls

(a)序列特征：

●長(zhǎng)度：124個(gè)氨基酸

●類型：蛋白

●鏈型：?jiǎn)捂?/p>

(b)分子類型：雙鏈dna

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來源：長(zhǎng)牡蠣

(f)特異性名稱：無

結(jié)構(gòu)特征：為一個(gè)只含單巨球頭狀c1q結(jié)構(gòu)域的蛋白。

實(shí)施例2cgc1qdc-3重組蛋白pamps結(jié)合活性分析：

用表面等離子共振技術(shù)(biacoret200sprinstrument，gehealthcare)檢測(cè)實(shí)施例1所得cgc1qdc-3重組蛋白對(duì)病原相關(guān)分子模式pamps的結(jié)合。

hbs-ep緩沖液(gehealthcare)(ph＝7.5)作為實(shí)驗(yàn)運(yùn)行的工作液(含10mmhepes、150mmnacl、3mmedta和0.005％(v/v)表面活性劑p20)，10mm的甘氨酸-鹽酸鹽(ph＝1.5)作為洗滌液。首先，根據(jù)aminecouplingkit(gehealthcare)的指示將抗his標(biāo)簽抗體共價(jià)固定在cm5芯片表面。pamps包括lps，lta，glu，polyi：c和man，用工作液配備為400μg/ml。根據(jù)實(shí)驗(yàn)程序配備定量的配體cgc1qdc-3重組蛋白和樣品pamps加入對(duì)應(yīng)的孔槽，本實(shí)施例用到cgc1qdc-3重組蛋白(100μg/ml)體積284μl，lps，lta，glu，polyi：c和man體積均58μl，58μl工作液(對(duì)照)，420μl洗滌液加入相應(yīng)的儀器孔槽。捕獲配體cgc1qdc-3重組蛋白時(shí)，液流系統(tǒng)流速為10μl/min，反應(yīng)時(shí)間為90s；pamps上樣時(shí)，液流系統(tǒng)流速為10μl/min，反應(yīng)時(shí)間為120s；洗滌時(shí)，液流系統(tǒng)流速為30μl/min，反應(yīng)時(shí)間為35s(參見圖2)。

結(jié)合反應(yīng)結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示cgc1qdc-3重組蛋白特異性結(jié)合lps，其反應(yīng)單位超過180ru，而不結(jié)合其他pamps(lta，glu，polyi：c和man)。

實(shí)施例3cgc1qdc-3重組蛋白對(duì)lps的結(jié)合力分析：

在biacoret200spr儀上開啟動(dòng)力學(xué)檢測(cè)程序測(cè)定上述獲得cgc1qdc-3重組蛋白對(duì)lps結(jié)合的動(dòng)力學(xué)曲線。cgc1qdc-3重組蛋白(100μg/ml)383μl，濃度為0，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml的lps各88μl，實(shí)施例2工作液88μl，洗滌液537μl加入對(duì)應(yīng)孔槽，運(yùn)行實(shí)驗(yàn)程序，得到cgc1qdc-3重組蛋白對(duì)lps結(jié)合的動(dòng)力學(xué)曲線如圖3所示。利用分析軟件biacoresoftware的1:1langmuirbinding模型對(duì)動(dòng)力學(xué)曲線擬合，得出cgc1qdc-3重組蛋白對(duì)lps結(jié)合的平衡解離常數(shù)為kd＝8.74×10^-7m，結(jié)合力較強(qiáng)。

sequencelisting

<110>中國(guó)科學(xué)院海洋研究所

<120>一種重組的長(zhǎng)牡蠣cgc1qdc-3蛋白的應(yīng)用

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>124

<212>prt

<213>長(zhǎng)牡蠣

<220>

<221>propep

<222>(1)..(124)

<223>

<400>1

ileproileasnthrileserlyshislysthrleuvaltyrasparg

151015

valgluthrasnalaglylysglytyraspalaargserglyglnphe

202530

thralaprogluserglyleutyrvalphehisthrserthrthrala

354045

glnasplysserhisserthrilegluvalvallysasnglygluval

505560

lysaspmetsertrpalaaspalametgluhisileaspargalaval

65707580

alaserthrmetthrileleuserleuthrlysglyaspilevalser

859095

valargvalglyilethrtyrglyglyasnleuleugluseraspgln

100105110

tyrthrargmetserpheserglyphelysleuser

115120