本發(fā)明涉及生物技術(shù)多肽制備領(lǐng)域，尤其涉及一種具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生物活性肽作為促進(jìn)健康的生物活性成分，具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用，是當(dāng)前國(guó)際食品界熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子。各種活性肽常作為功能食品添加成分用于食品或藥品的實(shí)踐生產(chǎn)，特別是在乳飲料、食品添加劑、保健食品的應(yīng)用方面已經(jīng)取得良好效果。

近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)生率正呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。其中，2型糖尿病是糖尿病的主要形式，主要癥狀是餐后血糖含量較高。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，為了控制糖尿病的進(jìn)一步惡化，也主要以控制餐后血糖含量為主。α-糖苷酶是位于小腸用于將碳化合物分解為葡萄糖的酶，因此使得血糖含量升高。通過(guò)抑制α-糖苷酶的活性，使得淀粉類分解為葡萄糖的速度減慢，從而減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低了餐后高血糖，以達(dá)到治療糖尿病的目的。目前在臨床上應(yīng)用的α-糖苷酶抑制劑類降糖藥主要有阿卡波糖和伏格列波糖，用于降低餐后血糖含量。但是，阿卡波糖和伏格列波糖都會(huì)引起一定程度的腹脹排氣等胃腸反應(yīng)，同時(shí)長(zhǎng)期服用的話會(huì)引起肝臟損傷。

絲膠蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，含量約占蠶絲的70％～80％。隨著醫(yī)學(xué)生物技術(shù)的發(fā)展，絲膠蛋白，尤其是絲膠蛋白或絲膠肽，已經(jīng)被廣泛的用于新型功能性材料。絲膠肽加到食品中，有顯著的抗氧化功效；同時(shí)，絲膠肽的降血脂、降血壓、降血糖、防止血栓和凝血及增強(qiáng)肌肉能量等功能已被廣泛報(bào)道。根據(jù)目前的研究進(jìn)展可以發(fā)現(xiàn)絲膠肽在抗氧化、降血糖、降血壓方面有極大的應(yīng)用價(jià)值，因此絲膠肽及其具有相同生物活性的衍生多肽大批量生產(chǎn)制備技術(shù)成為健食品和生物醫(yī)藥重點(diǎn)研發(fā)方向。

因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開(kāi)發(fā)一種具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽及其制備與應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽及其制備與應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽包括如下序列(seqidno:1)：sedssevdidlgn，即sergluaspsersergluvalaspileaspleuglyasn。

可選地，上述絲膠肽的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上、氨基端或羧基端進(jìn)行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙?；⒘姿峄?、酯化或糖基化修飾。

進(jìn)一步地，上述具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽來(lái)源為絲膠蛋白。

進(jìn)一步地，上述具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽來(lái)源于絲膠蛋白(protein:sericin1,organism:bombyxmori(silkmoth))，并且為絲膠蛋白(seqidno:2)第490～502位的氨基酸殘基。

進(jìn)一步地，上述具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽具有體外α-糖苷酶抑制活性。

進(jìn)一步地，上述具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽可以通過(guò)基因工程的方法和化學(xué)方法人工合成，也可以從蠶絲中通過(guò)分離純化、酶降解的方法獲得。

本發(fā)明的第二方面提供了上述絲膠肽的制備方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該制備方法的步驟如下：

(1)稱取n當(dāng)量的氨基樹(shù)脂放入反應(yīng)器，加入二氯甲烷(dcm)溶脹，然后抽掉dcm，以活化待用；

(2)連接第一個(gè)氨基酸：加入序列中2n當(dāng)量的第一個(gè)氨基酸，加入dcm，二甲基甲酰胺(dmf)以及2n當(dāng)量的二異丙基乙胺(diea)，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)。然后加入甲醇，反應(yīng)30min，抽掉反應(yīng)液，用dmf和甲醇洗凈；

(3)縮合反應(yīng)：往反應(yīng)器中加入序列中2n當(dāng)量的第二個(gè)氨基酸，2n當(dāng)量的苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)及diea，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)后洗掉液體，茚三酮檢測(cè)；

(4)封閉反應(yīng)：加入吡啶和乙酸酐進(jìn)行封端，洗凈；

(5)脫fmoc保護(hù)基：加入脫帽液，脫帽液為含20％六氫吡啶的dfm溶液)，脫帽反應(yīng)后脫去fmoc保護(hù)基團(tuán)，然后洗凈，茚三酮檢測(cè)；

(6)依步驟(3)、(4)和(5)依次加入序列中不同的氨基酸并進(jìn)行磷酸化修飾；

(7)加入切割液裂解多肽，震蕩后濾掉樹(shù)脂；

(8)向?yàn)V液中加入乙醚，析出粗產(chǎn)物，離心清洗后得到序列的粗產(chǎn)物；

(9)用高效液相色譜技術(shù)將粗產(chǎn)品提純；

(10)當(dāng)肽純度達(dá)到99％以上后，進(jìn)行二次制備純化，在水和乙腈中分別加入千分之一的磷酸，用以去除合成過(guò)程中殘留的三氟乙酸等雜質(zhì)，在磷酸鹽體系中有效提高了合成肽的生物活性，從柱子中洗脫出多肽后凍干。

優(yōu)選地，步驟(1)中氨基樹(shù)脂采用dcm溶脹活化，溶脹時(shí)間為30min。

優(yōu)選地，步驟(2)中dcm和dmf加入量，以使樹(shù)脂可以充分鼓動(dòng)起來(lái)為宜。

優(yōu)選地，步驟(2)中鼓泡反應(yīng)時(shí)間為60min。

優(yōu)選地，步驟(5)中脫帽反應(yīng)時(shí)間為30min。

優(yōu)選地，步驟(6)中依次加入序列中不同的氨基酸后可以進(jìn)行多種形式的修飾，從而改變合成的絲膠肽的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，進(jìn)而改變其生物學(xué)活性。

優(yōu)選地，步驟(7)中所述切割液的組分體積比為三氟乙酸(tfa)：乙二硫醇：三異丙基硅烷(tis)：h2o＝95:2:2:1；所述的切割時(shí)間為1-4h。

優(yōu)選地，步驟9)中高效液相技術(shù)采用kromasil100-5c18柱；流動(dòng)相a、b分別為0.1％tfa水溶液和0.1％tfa的乙腈溶液；進(jìn)樣量為10μl；進(jìn)行

15％-48％b相得梯度洗脫。

本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了上述絲膠肽的應(yīng)用。

上述應(yīng)用為在制備α-糖苷酶活性或降餐后血糖的食品、保健品及藥品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了一種抑制α-糖苷酶活性的生物活性物質(zhì)，其包括如上所述的具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽。

該抑制α-糖苷酶活性的藥物可以是餐后降血糖藥物。

本發(fā)明提供的具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽具有良好的抑制α-糖苷酶活性，ic50能達(dá)到0.39mg/ml，可以達(dá)到降低餐后血糖的效果，對(duì)開(kāi)發(fā)具有治療2型糖尿病的食品、保健品和藥品具有十分重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。

以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說(shuō)明

圖1是合成多肽的hplc洗脫圖譜；

圖2是合成多肽的esi-ms圖譜；

圖3是合成多肽對(duì)α-糖苷酶抑制的相對(duì)活性。

具體實(shí)施方式

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下屬特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用于本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

實(shí)施例1

一種具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽制備：

其中，具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽具有如seqidno:1所示的氨基酸序列。其制備步驟如下：

(1)稱取n當(dāng)量樹(shù)脂放入反應(yīng)器，加入dcm溶脹半小時(shí)，然后抽掉dcm，加入序列中的第一個(gè)氨基酸2n當(dāng)量，加2n當(dāng)量的diea，適量的dmf,dcm(適量是指可使樹(shù)脂充分鼓動(dòng)起來(lái)為宜)，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)60min。然后加入約5n當(dāng)量的甲醇，反應(yīng)半小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，用dmf、meoh洗凈；

(2)往反應(yīng)器中加入序列中第二個(gè)氨基酸(也為2n當(dāng)量)，2n當(dāng)量hbtu及diea，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)半小時(shí)，洗掉液體，茚三酮檢測(cè)，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗凈，加入適量的含20％六氫吡啶的dfm溶液去除fmoc保護(hù)基，洗凈，茚三酮檢測(cè)；

(3)依步驟(2)的方式依次加入序列中不同的氨基酸；

(4)將樹(shù)脂用氮?dú)獯蹈珊髲姆磻?yīng)柱中取下，倒入燒瓶中，然后往燒瓶中加一定量的切割液(切割液和樹(shù)脂的比例大約以10ml/g的比例)，所述切割液的組分體積比為三氟乙酸(tfa)：乙二硫醇：三異丙基硅烷(tis)：h2o＝95:2:2:1；切割2h后震蕩，濾掉樹(shù)脂；

(5)得到濾液，然后向?yàn)V液中加入大量乙醚，析出粗產(chǎn)物，然后離心，清洗即可得到序列的粗產(chǎn)物；

(6)通過(guò)高效液相色譜的方法將粗產(chǎn)物提純至要求純度，并轉(zhuǎn)化為磷酸鹽體系，因?yàn)榱姿猁}加入去除了合成過(guò)程中殘留的三氟乙酸等雜質(zhì)，在磷酸鹽體系中有效提高了合成肽的生物活性。

實(shí)施例2

合成絲膠肽的洗脫及純度測(cè)定：

取少許合成完全的肽粗品，用含0.1％(v/v)tfa的10％乙腈溶液溶解樣品，溶解完成后，取10μl進(jìn)樣到kromasil100-5c18色譜柱中，采用流動(dòng)相a、b分別為0.1％tfa水溶液和0.1％tfa乙腈溶液的洗脫液進(jìn)行15％-48％b相的梯度洗脫。如圖1所示，本發(fā)明合成的絲膠肽分子大小為1379.36da的洗脫峰，其保留時(shí)間為7.752min。

取洗脫主峰樣品進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定，根據(jù)所需樣品分子量1379.36及主峰相對(duì)面積含量確定樣品純度，如圖2所示，本發(fā)明合成的絲膠肽通過(guò)純化得到合成的絲膠肽的純度可達(dá)到99.11％。

當(dāng)肽純度達(dá)到99％以上后，進(jìn)行二次制備純化，在水和乙腈溶液中各加入0.1％磷酸，從柱子中洗脫出多肽，然后凍干得到不含三氟乙酸的合成肽純品。

實(shí)施例3

合成絲膠肽抑制α-糖苷酶活性測(cè)定：

試劑：α-糖苷酶(ec3.2.1.20，19.3units/mg)來(lái)源于釀酒酵母購(gòu)于美國(guó)sigma–aldrich公司；pnpg(p-硝基苯-β-d-半乳吡喃糖苷)購(gòu)于美國(guó)sigma–aldrich公司；其他試劑均為分析純；實(shí)施例1中合成的生物活性多肽。

實(shí)驗(yàn)原理：α-葡萄糖苷酶催化pnpg產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚，在405nm處有特征吸收峰，因此我們利用紫外分光光度計(jì)的動(dòng)力學(xué)/時(shí)間軟件測(cè)定在405nm處的紫外吸收峰，從而通過(guò)數(shù)字顯示實(shí)施例1中合成的生物活性多肽抑制α-糖苷酶的效果。

在37℃下，ph6.8的磷酸鹽(0.05mol/l)緩沖體系中，200μlα-葡萄糖苷酶(0.175u/ml)和不同濃度100μl絲膠肽孵化30min，加200μlpnpg(10mmol/l)后，每隔60s在405nm處測(cè)定吸光值的變化，共測(cè)定20min，并通過(guò)下列公式對(duì)α-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行評(píng)估：

公式：相對(duì)活性(％)＝(r/r0)×100％。

其中r0為不加抑制劑時(shí)的吸光度變化的斜率，r為在含有不同濃度絲膠肽的體系中吸光度變化的斜率。

表1絲膠肽抑制α-糖苷酶活性結(jié)果

通過(guò)上述方法對(duì)合成絲膠肽抑制α-糖苷酶活性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其具有抑制活性，具體ic50(mg/ml)值見(jiàn)表1。

如圖3所示為α-糖苷酶相對(duì)活性與絲膠肽含量關(guān)系，隨著絲膠肽含量的升高，α-糖苷酶相對(duì)活性逐漸降低。表明絲膠肽具有較高的α-糖苷酶抑制能力，其ic50可以達(dá)到0.39mg/ml。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110>上海交通大學(xué)

<120>一種具有α-糖苷酶抑制活性的絲膠肽及其制備與應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>絲膠肽

<400>1

sergluaspsersergluvalaspileaspleuglyasn

1510

<210>2

<211>1186

<212>prt

<213>蠶蛾(bombyxmori)

<400>2

metargphevalleucyscysthrleuilealaleualaalaleuser

151015

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