金銀花中環(huán)烯醚萜苷類化合物及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及金銀花中環(huán)烯醚萜苷類化合物及其制備方法，本 發(fā)明還涉及該類新化合物在制備降糖藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 糖尿病源于人體內(nèi)胰島素分泌不足，由此引發(fā)以糖代謝混亂為主的全身性疾病， 并伴隨機(jī)體一系列的并發(fā)癥，很難治愈，對患者的生活造成嚴(yán)重影響。糖尿病是世界范圍的 最常見的流行性疾病之一，其死亡率在發(fā)達(dá)國家僅次于心血管疾病，惡性腫瘤，成為第三位 致死病因的疾病。α-糖苷酶抑制劑（例如阿卡波糖）臨床上常被用作抗糖尿病藥物，它們 能改善血管通透性和降低血糖水平。然而，長期使用一些α-糖苷酶抑制劑會對患者造成 過重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，最重要的是其副作用不良反應(yīng)較大，對人的其他機(jī)體功能造成嚴(yán)重?fù)p害， 例如腹瀉等腸道紊亂性疾病。因此有必要尋找新的、安全、有效的抗糖尿病的藥物。許多中 藥通過活血化瘀、消熱解毒、補(bǔ)益的作用來改善人的各項機(jī)能，達(dá)到防治糖尿病的目的。而 且中藥治療糖尿病的作用機(jī)制、途徑，具有多向性，多層面和多靶點的藥理特點，有著西藥 等化學(xué)合成藥物不可比擬的優(yōu)勢。因此，從中藥中尋找療效確切的降糖天然藥物，明確其藥 效物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)而開發(fā)出高效低毒的抗糖尿病新藥，已成為目前國內(nèi)外研究的熱點。
[0003] 金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica)的干燥花蕾或帶初開的花，為我 國常用中藥，具有3000多年的歷史。具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效，主治癰腫疔瘡、喉痹、 丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等癥。目前從金銀花中報道分離得到多種類型化合物， 其中環(huán)烯醚萜苷類化合物具有很好降糖效果。因此從金銀花中尋找降糖活性好的環(huán)烯醚萜 苷類化合物具有一定的價值。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的旨在從金銀花干燥的花蕾中尋找新的降糖前體藥物，提供該環(huán)烯醚 萜苷類化合物的提取、制備方法，并且研究它們的降糖活性和醫(yī)藥用途。本發(fā)明的另一個目 的在于提供該類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定方法。
[0005] 本發(fā)明所述3個新的具有降糖活性環(huán)稀醚砲苷類化合物L(fēng)oniceranan A、 Loniceranan B、Loniceranan C，其結(jié)構(gòu)如下所不：
[0007] 本發(fā)明所述新的環(huán)烯醚萜苷類化合物的提取、制備方法如下：
[0008] 取干燥的金銀花用水煎煮，合并提取液濃縮得浸膏，浸膏采用大孔吸附柱色譜，以 乙醇-水系統(tǒng)0:100~100:1逐漸洗脫，共收集10~15個餾分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識，合并 為Al~A4, A2 (大孔樹脂乙醇-水15:85~30:70下洗脫）通過聚酰胺柱色譜，以純水進(jìn) 行洗脫，洗脫液經(jīng)減壓蒸餾后得B，B經(jīng)快速減壓柱色譜以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇-水 系統(tǒng)50:1:0. 01~1:1:0. 01梯度洗脫，共得20~40個餾分，通過硅膠薄層板層析檢識，合 并為Cl~C5, Cl經(jīng)ODS柱色譜以甲醇-水系統(tǒng)10:90~100:0梯度洗脫得到20~30個 餾分，經(jīng)分析液相檢識，合并為Dl~D7,利用HPLC法以乙腈-水為流動相在D2-D5中制備 得到化合物1-3。其中，水煎煮提取2~5次，每次6~10小時。所述的乙腈-水的比例為 10:90-30:70。
[0009] 具體地，本發(fā)明中所述三個化合物的制備方法如下：
[0010] 取干燥的金銀花花蕾10-15kg用水煎煮提取2~5次，每次6~10小時，藥材與 水的比例為：1:3~1:5,合并提取液濃縮得浸膏，浸膏采用大孔吸附柱色譜，以乙醇-水系 統(tǒng)0:100~100:1逐漸洗脫，共收集10~15個餾分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識，合并為Al~ A4, A2 (300~500g)通過聚酰胺柱色譜，以純水進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)減壓蒸餾得B，B經(jīng)快速 減壓柱色譜以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇-水系統(tǒng)50:1:0. 01~1:1:0. 01梯度洗脫，共得 20~40個餾分，通過硅膠薄層板層析檢識，合并為Cl~C5, Cl經(jīng)ODS柱色譜以甲醇-水 系統(tǒng)10:90~100:0梯度洗脫得到20~30個餾分，經(jīng)分析液相檢識，合并為Dl~D7,利用 HPLC法以乙腈-水為流動相（10:90-30:70)在D2-D5中制備得到化合物1-3。本發(fā)明所述 新的環(huán)烯醚萜苷類化合物具有較好的降糖活性。
[0011] 活性試驗方法如下：
[0012] 1.實驗材料
[0013] 1. 1受試品：化合物
[0014] L 2實驗酶及來源α -糖苷酶
[0015] 2.實驗方法
[0016] 2. 1藥物處理
[0017] 稱取I. 5mg樣品至ImL EP管底部，加150 μ L PBS溶劑稀釋至10mg/mL的溶液，儲 存于-20°C。用時用相應(yīng)的培養(yǎng)液將其稀釋成10、5、2. 5、1. 25、0. 625mg/ml用。選取阿卡波 糖作為陽性對照藥，稱取lmg，加入10 μ L DMS0,再加入90 μ L PBS。配成約lmg/100 μ L的 溶劑。用時稀釋成l〇、5、2. 5、1.25mg/ml用。選取α-糖苷酶作為反應(yīng)酶，稱取Img酶，加 ImL PBS溶解，配成lmg/mL的溶液，取10 μ 1稀釋至I. 580mL。選取pNPG作為反應(yīng)底物，稱 取I. 51mg底物置IOmL EP管中，加 PBS至刻度，溶解，即為0. 5mM/L的底物溶液，避光保存。
[0018] 2. 2 MTT法的測定方法
[0019] 預(yù)先往96孔板孔里加入樣品溶液50 μ L (磷酸緩沖液分別稀釋成若干含量梯度）， 加入酶溶液（0. 1U) 100 μ L，37度孵育IOmin后，加入底物pNPG(0. 5mM) 50 μ L，孵育30min， 酶標(biāo)儀上405nm處測定吸光度。
[0020] 抑制率（％ ) = [1-(A 樣-A 空 V(A 對-A 空）]X100%
[0021] 2.3.統(tǒng)計方法
[0022] 全部資料采用SPSS (13. 0)統(tǒng)計軟件包進(jìn)行檢驗分析。各組數(shù)據(jù)用均值土標(biāo)準(zhǔn)誤 (Mean土 S. E.)表示，采用One-Way ANOVA評價整體性差異，并進(jìn)行Dunnett或Dunnett ' s T3檢驗進(jìn)行組間比較。
[0023] 3.實驗結(jié)果
[0024] 表1化合物對α -糖苷酶的ICsn (mM/L)
[0027] 由上述實驗結(jié)果可看本發(fā)明所涉3種化合物對α -糖苷酶具有一定抑制作用。其 中化合物2和3的作用明顯，和陽性對照藥阿卡波糖效果相當(dāng)?；衔?對α -糖苷酶的 作用較弱。
[0028] 本發(fā)明所涉環(huán)烯醚萜苷類新化合物，對α -糖苷酶有一定的抑制作用，可用于開 發(fā)抗糖尿病類藥物，尤其針對臨床化療階段藥物。
[0029] 本發(fā)明制備方法簡單，重現(xiàn)性好，提取純度高。獲得的化合物具有較好的降糖活性 作用。
【附圖說明】
[0030] 圖 1 為 1 的 1H-NMR
[0031] 圖 2 為 1 的 13C-NMR
[0032] 圖 3 為 1 的 HSQC
[0033] 圖 4 為 1 的 HMBC
[0034] 圖 5 為 1 的 NOESY
[0035] 圖 6 為 2 的 1H-NMR
[0036] 圖 7 為 2 的 13C-NMR
[0037] 圖 8 為 2 的 HSQC
[0038] 圖 9 為 2 的 HMBC
[0039] 圖 10 為 2 的 NOESY
[0040] 圖 11 為 3 的1H-NMR
[0041] 圖 12 為 3 的 13C-NMR
[0042] 圖 13 為 3 的 HMBC
[0043] 圖 14 為 3 的 NOESY
【具體實施方式】：
[0044] 制備實施例1
[0045] 取干燥的金銀花花蕾IOkg用水煎煮提取3次，每次6小時，藥材與水的比例為： 1:3,合并提取液濃縮得浸膏，浸膏采用大孔吸附柱色譜，以乙醇-水系統(tǒng)0:100、15:85、 30:70、50:50、IOO: O逐漸洗脫，共收集12個餾分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識，合并為A1~A4， A2(350g)通過聚酰胺柱色譜，以純水為流動相洗脫，洗脫液經(jīng)減壓蒸餾后得B，B經(jīng)快速 減壓柱色譜以二氯甲烷-甲醇-水系統(tǒng)50:1:0. 01、20:1:(λ 01、10:1:0. 01、5:1:(λ 01、 1: 1:0. 01梯度洗脫，共得35個餾分，通過硅膠薄層板層析檢識，合并為Cl~C5, Cl經(jīng)ODS 柱色譜以甲醇-水系統(tǒng)10:90、30:70、50:50、0:100、梯度洗脫得到24個餾分，經(jīng)分析液相檢 識，合并為Dl~D7。在D2(0DS甲醇水10:90洗脫）中以乙腈-水系統(tǒng)15:85在液相色譜 柱中制得化合物1和2,在D3(0DS甲醇水30:70洗脫）中以乙腈-水系統(tǒng)22:78在液相色 譜柱中制得化合物3。
[0046] 制備實施例2
[0047] 取干燥的金銀花花蕾12kg用水煎煮提取4次，每次10小時，藥材與水的比例為： 1:4,合并提取液濃縮得浸膏，浸膏采用大孔吸附柱色譜，以乙醇-水系統(tǒng)0:100、15:85、 30 :70、60:40、100:0逐漸洗脫，共收集10個餾分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識，合并為Al~ A4，A2(400g)通過聚酰胺柱色譜，以純水為流動相洗脫，洗脫液經(jīng)減壓蒸餾后得B，B經(jīng)快 速減壓柱色譜以二氯甲烷-甲醇-水系統(tǒng)50:1:0. 01、20:1:0· 01、15:1:0. 01、8:1:0. 01、 3:1:0. 01、1:1:0. 01梯度洗脫，共得25個餾分，通過硅膠薄層板層析檢識，合并為Cl~C5， Cl經(jīng)ODS柱色譜以甲醇-水系統(tǒng)10:90、35:65、50:50、0:100、梯度洗脫得到26個餾分，經(jīng)分 析液相檢識，合并為Dl~D7。在D3(0DS甲醇水35:65洗脫）中以乙腈-水系統(tǒng)15:85在 液相色譜柱中制得化合物1和2,在D4(0DS甲醇水35:65洗脫）中以乙腈-水系統(tǒng)20:80 在液相色譜柱中制得化合物3。
[0048] 制備實施例3
[0049] 取干燥的金銀花花蕾Ilkg用水煎煮提取2次，每次7小時，藥材與水的比例為： 1:3,合并提取液濃縮得浸膏，浸膏采用大孔吸附柱色譜，以乙醇-水系統(tǒng)0:100、15:85、 40 :60、70:30、100:0逐漸洗脫，共收集11個餾分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識，合并為Al~ A