本發(fā)明涉及水產(chǎn)食品過敏免疫調(diào)控領(lǐng)域，介紹了一種以新對蝦屬(metapenaeus)原肌球蛋白(mete1)為原型，通過針對性的比對，設(shè)計(jì)制備的一種可用于緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應(yīng)的改良蛋白mmete1制備方法，旨在為典型水產(chǎn)食品過敏的控制提供支撐。

背景技術(shù)：

食物過敏是一類典型的過敏反應(yīng)，是一種由ige介導(dǎo)的速發(fā)性免疫反應(yīng)，成為近年來關(guān)注的熱點(diǎn)。對蝦及其制品味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛，但卻因具有較高的致敏性，影響了過敏人群的食用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，對蝦等甲殼類動(dòng)物引發(fā)的過敏反應(yīng)廣泛存在于全球各個(gè)國家當(dāng)中，最高可占食物過敏總?cè)丝诘?0％以上，食物過敏的兒童中對蝦等甲殼類過敏的比例甚至高達(dá)60％以上。進(jìn)一步分析顯示，原肌球蛋白是引起人們甲殼類水產(chǎn)食品過敏反應(yīng)的主要原因之一，能夠引起過敏性皮炎、支氣管哮喘、過敏性腹瀉等癥狀，嚴(yán)重威脅到人們的健康，且不同對蝦品種以及其他甲殼類動(dòng)物的原肌球蛋白具有一定的同源性，能夠引起一定的交叉反應(yīng)，最終加大了這類人群的過敏反應(yīng)，因此如何緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應(yīng)引起了廣泛的關(guān)注。

目前緩解和控制對蝦等食品過敏普遍采用的方法包括物理法、化學(xué)法和生物法，均可以顯著降低過敏原的免疫活性。其中物理法包括加熱、輻照、微波以及超高壓等，化學(xué)法包括強(qiáng)酸水解、靶向美拉德反應(yīng)，生物法多采用酶解法，是目前新興的一種方法，具有一定的應(yīng)用前景。但是以上方法均不能從根本上緩解或者控制對蝦等食品過敏，一方面在消除對蝦等食品過敏原本身的同時(shí)，由于食品不同的基質(zhì)和自身的結(jié)構(gòu)差異，并不能很好的完全去除過敏原；另一方面改變了食品原有的結(jié)構(gòu)和感官性狀，進(jìn)而影響了作為商品的原有價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)所存在問題，本申請?zhí)峁┮环N用于緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應(yīng)的改良蛋白mmete1以及其制備方法。

一種用于緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應(yīng)的改良蛋白mmete1，其氨基酸序列如seqidno：6所示。

一種如權(quán)利要求1所述改良蛋白mmete1的制備方法，包括如下步驟：

(1)對照新對蝦屬原肌球蛋白mete1抗原特異性表位氨基酸序列與四種海洋魚類原肌球蛋白序列，進(jìn)行氨基酸序列分析，重新設(shè)計(jì)其抗原表位氨基酸殘基序列得到改良蛋白mmete1氨基酸序列；

(2)通過mmete1的氨基酸序列逆向轉(zhuǎn)錄翻譯得到改良蛋白mmete1的cdna序列并進(jìn)行合成；

(3)將所得cdna與載體質(zhì)粒通過限制性內(nèi)切酶處理并結(jié)合，獲得改良蛋白mmete1重組質(zhì)粒載體；

(4)將所得重組質(zhì)粒載體導(dǎo)入宿主菌，培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌，使其表達(dá)改良蛋白mmete1；

(5)經(jīng)純化柱純化所得的改良蛋白，得到改良蛋白mmete1標(biāo)準(zhǔn)品。

為了緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應(yīng)，本研究結(jié)合前期的實(shí)驗(yàn)，針對性的將新對蝦屬原肌球蛋白mete1(seqidno：1)與四種非致敏性海洋魚類原肌球蛋白氨基酸序列進(jìn)行對比設(shè)計(jì)，制備了一種可用于緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應(yīng)的改良蛋白mmete1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可以通過調(diào)節(jié)免疫耐受，從而降低過敏反應(yīng)。為從過敏人群角度從本質(zhì)上解決對蝦等食品過敏問題提供了依據(jù)。

本發(fā)明采用基因工程的方法，對照新對蝦屬原肌球蛋白mete1抗原表位，以四種非致敏性海洋魚類(大西洋鮭魚(seqidno：2)、點(diǎn)帶石斑魚(seqidno：3)、鱖魚(seqidno：4)以及金槍魚(seqidno：5))原肌球蛋白氨基酸序列為依據(jù)進(jìn)行氨基酸序列分析得到217個(gè)氨基酸序列的改良蛋白mmete1氨基酸序列(seqidno：6)，并通過逆向轉(zhuǎn)錄翻譯得到其cdna并合成重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)純化得到改良蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。本制備方法具有產(chǎn)量高，生產(chǎn)穩(wěn)定，成本低的特點(diǎn)。通過小鼠模型以及患者血清e(cuò)lisa試驗(yàn)證明改良蛋白mmete1對對蝦原肌球蛋白引起的過敏反應(yīng)有明顯的抑制效果，且不引起相關(guān)的交叉反應(yīng)。

步驟(2)中通過mega5.0對mmete1的氨基酸序列逆向轉(zhuǎn)錄翻譯得到改良蛋白mmete1的cdna序列并進(jìn)行合成，該過程送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

本發(fā)明獲得獲得全長cdna基因序列后，并在序列兩端引入限制性內(nèi)切酶ecorv及hindⅲ酶切位點(diǎn)，與pet30(a)+原核表達(dá)載體酶切、連接，使得插入片段的起始密碼子位于翻譯的起始密碼子位置，構(gòu)建重組質(zhì)粒；將構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)菌株，然后置于大腸桿菌表達(dá)培養(yǎng)基magicmedia上37℃下培養(yǎng)過夜；組氨酸標(biāo)記大腸桿菌bl21(de3)菌株表達(dá)出的mmete1，并通過純化柱hispurcobatspincolumn進(jìn)行純化。純化后的蛋白通過sds-page對蛋白進(jìn)行純度、分子量進(jìn)行檢測。

發(fā)明的改良肌球蛋白mmete1用于緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應(yīng)，患者血清及小鼠模型試驗(yàn)證明能夠有效地緩解對蝦原肌球蛋白引起的食品過敏反應(yīng)。

一種如所述改良蛋白mmete1在用于緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應(yīng)的藥物或保健品中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明由獲得改良過敏原基因的全長cdna出發(fā)，采用基因工程的方法，合成了經(jīng)改良的原肌球蛋白mmete1，所得改良蛋白純度高，經(jīng)患者血清及小鼠模型試驗(yàn)證明能夠有效地緩解對蝦原肌球蛋白引起的食品過敏反應(yīng)，本發(fā)明所建立的降低對蝦原肌球蛋白過敏反應(yīng)的改良及其制備方法，未見文獻(xiàn)報(bào)道，為快速、準(zhǔn)確的降低對蝦原肌球蛋白過敏提供新的手段。

附圖說明

圖1為改良蛋白mmete1的氨基酸序列。

圖2為改良mmete1對免疫反應(yīng)的抑制情況

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中所用處理手段均為本領(lǐng)域常規(guī)處理方法。

實(shí)施例1

1.改良蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)

mmete1改良蛋白序列設(shè)計(jì)：以新對蝦屬原肌球蛋白mete1氨基酸序列為基礎(chǔ)，以不具致敏性的幾類海洋魚類(大西洋鮭魚、點(diǎn)帶石斑魚、鱖魚以及金槍魚)原肌球蛋白為依據(jù)統(tǒng)計(jì)分析得出相應(yīng)改良原肌球蛋白mmete1序列(seqidno：6)。

新對蝦屬原肌球蛋白mete1、四種參考魚類以及改良蛋白mmete1的氨基酸序列對比如表1所示。

表1

2.cdna序列獲取及合成

對所得改良原肌球蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，并逆向轉(zhuǎn)錄翻譯得到相應(yīng)的cdna序列，并合成得到相應(yīng)的cdna。

該步驟送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

3.載體構(gòu)建及蛋白質(zhì)表達(dá)

獲得全長cdna基因序列，并在序列兩端引入限制性內(nèi)切酶ecorv及hindⅲ酶切位點(diǎn)，與pet30(a)+原核表達(dá)載體酶切、連接，使得插入片段的起始密碼子位于翻譯的起始密碼子位置，構(gòu)建重組質(zhì)粒，其酶切反應(yīng)體系與酶聯(lián)反應(yīng)體系如表2和表3所示。

表2酶切反應(yīng)體系

4.轉(zhuǎn)化培養(yǎng)

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒(5μl)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)菌株(100μl)，然后將所篩選得到的轉(zhuǎn)化菌株接種于大腸桿菌表達(dá)培養(yǎng)基magicmedia上37℃下培養(yǎng)過夜。

5.蛋白純化

組氨酸標(biāo)記大腸桿菌bl21(de3)菌株表達(dá)出的mmete1，并通過純化柱hispurcobatspincolumn進(jìn)行純化。純化后的蛋白通過sds-page對蛋白進(jìn)行純度、分子量進(jìn)行檢測，看到只有一條分子量大約為35kda的明顯單帶，經(jīng)檢測純度達(dá)95％以上，將純化后的蛋白凍干保存。

6.改良蛋白減低致敏效果的鑒定

將3-4周雌性balb/c小鼠分為mete1組與mmete1組(每組10只)，對mete1組使用原肌球蛋白mete1進(jìn)行口服灌胃處理、mmete1組使用原肌球蛋白mete1和改良蛋白mmete1進(jìn)行口服灌胃處理，而后將兩組小鼠進(jìn)行組內(nèi)均分每組5只試驗(yàn)小鼠，對組內(nèi)不同分組分別腹腔注射原肌球蛋白mete1和改良蛋白mmete1，30min后取小鼠血清對過敏反應(yīng)特異性抗體ige及igg含量進(jìn)行檢測，以判斷小鼠不同組蛋白處理對小鼠過敏反應(yīng)程度的影響，其結(jié)果如表4所示。

表4不同改良蛋白處理后小鼠(n＝5)血清中抗原等級(jí)

結(jié)果表明，預(yù)先經(jīng)原肌球蛋白mete1刺激小鼠在再次攝入原肌球蛋白mete1后會(huì)發(fā)生過敏反應(yīng)釋放過敏反應(yīng)特異性抗體ige，而經(jīng)改良蛋白mmete1處理后小鼠再攝入原肌球蛋白mete1能有效降低90％的抗原ige釋放，即mmete1能顯著減緩因原肌球蛋白mete1攝入而引起的食品過敏反應(yīng)。同時(shí)mmete組小鼠在攝入原肌球蛋白mete1或改良蛋白mmete1后不引起高水平ige釋放的同時(shí)能夠引起與mete1組小鼠攝入原肌球蛋白mete1后等值的抗體igg的釋放，抗體igg作為阻遏抗體能夠阻遏過敏反應(yīng)特異性抗體ige與抗原的接觸，從而進(jìn)一步的減緩過敏反應(yīng)癥狀。

實(shí)施例2

1.改良蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)

mmete1改良蛋白序列設(shè)計(jì)：以新對蝦屬原肌球蛋白mete1氨基酸序列為基礎(chǔ)，以不具致敏性的幾類海洋魚類(大西洋鮭魚、點(diǎn)帶石斑魚、鱖魚以及金槍魚)原肌球蛋白為依據(jù)統(tǒng)計(jì)分析得出相應(yīng)改良原肌球蛋白mmete1序列(seqidno：6)。

2.cdna序列獲取及合成

對所得改良原肌球蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，并逆向轉(zhuǎn)錄翻譯得到相應(yīng)的cdna序列，并合成得到相應(yīng)的cdna。

3.載體構(gòu)建及蛋白質(zhì)表達(dá)

獲得全長cdna基因序列，并在序列兩端引入限制性內(nèi)切酶ecorv及hindⅲ酶切位點(diǎn)，與pet30(a)+原核表達(dá)載體酶切、連接，使得插入片段的起始密碼子位于翻譯的起始密碼子位置，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

4.轉(zhuǎn)化培養(yǎng)

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒(5μl)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)菌株(100μl)，然后將所篩選得到的轉(zhuǎn)化菌株接種于大腸桿菌表達(dá)培養(yǎng)基magicmedia上37℃下培養(yǎng)過夜。

5.蛋白純化

組氨酸標(biāo)記大腸桿菌bl21(de3)菌株表達(dá)出的mmete1，并通過純化柱hispurcobatspincolumn進(jìn)行純化。純化后的蛋白通過sds-page對蛋白進(jìn)行純度、分子量進(jìn)行檢測，看到只有一條分子量大約為35kda的明顯單帶，經(jīng)檢測純度達(dá)95％以上，將純化后的蛋白凍干保存。

6.改良蛋白減低致敏效果的鑒定

用碳酸鹽包被緩沖液將mete1與mmete1稀釋至1-10μg/ml，于96孔板上每孔加200μl抗原，4℃下過夜，次日用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5min。每孔中加入200μl封閉液，置37℃恒溫箱中保持1h后洗滌。加入稀釋的人類患者血清200μl于上述包被抗原相應(yīng)的孔中，置于37℃下孵化1h后洗滌，同時(shí)做空白、陰性、陽性對照孔，對各反應(yīng)孔加入稀釋的酶標(biāo)二抗(山羊抗人)200μl，37℃下孵育30-60min后洗滌，最后用蒸餾水洗滌2次，置于酶標(biāo)儀上檢測，改良蛋白mmete1對ige反應(yīng)的抑制情況如圖2所示，結(jié)果表明，改良原肌球蛋白mmete1能有效減弱71.4％的ige釋放，證明其對過敏癥狀具有一定減緩作用。

以上所述僅為本發(fā)明專利的具體實(shí)施案例，但本發(fā)明專利的技術(shù)特征并不局限于此，任何相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的領(lǐng)域內(nèi)，所作的變化或修飾皆涵蓋在本發(fā)明的專利范圍之中。

序列表

sequencelisting

<110>浙江工商大學(xué)

<120>一種用于緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應(yīng)的改良蛋白mmete1及其制備方法和應(yīng)用

<130>

<160>6

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<213>新對蝦屬（metapenaeus）

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<213>金槍魚

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<213>人工合成

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