本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，尤其涉及一種不依賴于高能能量分子的用于檢測(cè)人類免疫缺陷病毒1型的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及試劑盒。
背景技術(shù)：
艾滋病(acquiredimmunodeficiencysyndrome，aids)，又稱獲得性免疫缺陷綜合癥，是一類世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康和生命的病毒性傳染性疾病。在不到20年中，已使3000萬人受到感染，1000萬人失去生命。目前，世界上每天有萬余人新感染艾滋病病毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)，至2001年底，我國艾滋病的感染人數(shù)為100萬左右，現(xiàn)進(jìn)入快速增長期，根據(jù)衛(wèi)生部的資料，2001年上半年報(bào)告的艾滋病病毒感染者數(shù)量與上一年相比上升了67.4％。全球的研究結(jié)果表明hiv患者總數(shù)的1/2是通過被污染的血液、血液制品、輸血或密切個(gè)體間接觸而傳播傳染的，在特殊的人群中甚至出現(xiàn)交叉感染的跡象。不但醫(yī)學(xué)界在竭盡全力研究診斷預(yù)防治療艾滋病，各國政府，社會(huì)各階層都紛紛投入到抗擊艾滋的運(yùn)動(dòng)。但到目前為止，人類還沒有找到一種治療此病的方法。因而早期診斷及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染病人，控制其進(jìn)一步傳播仍然是艾滋病防治的重要手段之一。
近年來，國內(nèi)外主要采用酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)、pcr、細(xì)胞培養(yǎng)等方法檢測(cè)hiv-1抗體或病毒。這些方法都不同程度的存在一些缺點(diǎn)。
如elisa法操作程序較復(fù)雜，易造成假陽性和假陰性，并易造成操作者受害和環(huán)境污染，試驗(yàn)時(shí)間較長，需要兩個(gè)小時(shí)以上才能得出檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)必須具備酶標(biāo)儀和洗板機(jī)，這在基層實(shí)驗(yàn)室和小型門診較難達(dá)到，且試驗(yàn)受溫度等條件限制，給檢測(cè)帶來不便。
細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求具備很高的實(shí)驗(yàn)工作環(huán)境和條件(無菌操作間、超凈工作臺(tái)、操作間等)，需要大量的儀器設(shè)備(培養(yǎng)箱、離心機(jī)、顯微鏡等)，需要大量的專業(yè)實(shí)驗(yàn)器材，實(shí)驗(yàn)技術(shù)復(fù)雜，需要有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員操作，且實(shí)驗(yàn)周期很長，不適宜疾病的快速檢測(cè)。凝集試驗(yàn)包括明膠顆粒(pa)和乳膠顆粒(lat)屬半定量測(cè)定，須多次倍比稀釋測(cè)定費(fèi)試劑，且結(jié)果重復(fù)性差，且靈敏度低。
而普通的pcr技術(shù)雖然在靈敏度和特異性方面有優(yōu)勢(shì)，但是在技術(shù)應(yīng)用上也有幾點(diǎn)限制：第一，pcr技術(shù)需要昂貴的實(shí)驗(yàn)室儀器，同時(shí)儀器要具備精細(xì)的溫度控制程序和加熱模板，從而實(shí)現(xiàn)很高的溫度下的dna模板鏈的變性，較低的溫度下引物探針退火延伸模板，這樣重復(fù)溫度變化幾十個(gè)循環(huán)之后實(shí)現(xiàn)模板量的放大。由于每一個(gè)循環(huán)時(shí)間都較短，儀器必須能快速準(zhǔn)確升降溫度，這就需要銀制或金制的加熱模塊，加大儀器研制的成本。第二，pcr擴(kuò)增體系中有用的聚合酶必須具有耐受高溫的能力，否則必須在每一個(gè)循環(huán)中重新加入新酶，以實(shí)現(xiàn)下一循環(huán)的擴(kuò)增，這樣極容易造成污染也加大了成本。第三，在pcr循環(huán)中，每一個(gè)循環(huán)引物退火的時(shí)間都很短（幾秒到十幾秒）這就要求引物必須快速找到模板上同源匹配的區(qū)段，以實(shí)現(xiàn)延伸。這就要求pcr體系必須有過量的pcr引物。而過量的引物會(huì)與模板錯(cuò)配，錯(cuò)誤引發(fā)擴(kuò)增，引物二聚體等等，進(jìn)而抑制pcr擴(kuò)增，特別是在模板量低的情況，會(huì)使這種情況加劇。
與傳統(tǒng)的pcr技術(shù)相比，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要利用重組酶的活性，不進(jìn)行核酸解鏈和退火即可在恒溫條件下（如37℃）進(jìn)行核酸的擴(kuò)增，因此不需要昂貴的儀器，也避免了高溫對(duì)酶的損耗。同時(shí)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在體系中不需要加入過量的引物，降低了引物與模板錯(cuò)配或生成引物二聚體的可能性。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)日益受到重視。
常見的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有以下幾種：滾環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增（rca)，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(lamp)，依賴解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增（hda)等?，F(xiàn)有的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)體系比較復(fù)雜，同時(shí)絕大部分恒溫?cái)U(kuò)增體系要么依賴于atp，要么依賴于肌酸激酶和磷酸肌酸，或其他高能能量分子，所需的試劑種類繁多，擴(kuò)增速度受限于能量的供給，這導(dǎo)致恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)成本比較高，限制了其應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)常規(guī)的熒光檢測(cè)試劑需要配套的昂貴的儀器設(shè)備，現(xiàn)有的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑需依賴于atp等高能量分子導(dǎo)致所需的試劑種類繁多、擴(kuò)增速度受限等問題，本發(fā)明提供了一種不依賴于高能能量分子的用于檢測(cè)人類免疫缺陷病毒1型的恒溫檢測(cè)試劑盒，僅需常規(guī)的熒光pcr儀即可完成快速檢測(cè)。
本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，包括反應(yīng)液、啟動(dòng)液、反應(yīng)酶系、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，其中，反應(yīng)酶系的成分包括單鏈結(jié)合蛋白、重組酶、hiv特異性引物（正向引物和反向引物）和熒光探針等，其中，重組酶為不依賴于能量分子的重組酶。
一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，其反應(yīng)液成分包括：
tris-緩沖液10mm--150mm
硫酸銨0mm--150mm
二硫蘇糖醇0mm--10mm
甜菜堿0m-2m
tween200%-1%（質(zhì)量百分比）
peg1%--20%（質(zhì)量百分比）
bsa0mg/ml--1mg/ml
優(yōu)選的，tris-緩沖液可選自tris-h2so4、tris-乙酸、tris-hcl中的任意一種或多種，tris-緩沖液的ph為7.0～9.0。
一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，其啟動(dòng)液成分包括：
mg2+5mm--20mm
優(yōu)選的，mg2+來自于硫酸鎂、乙酸鎂、氯化鎂中的任意一種或多種。
一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，其反應(yīng)酶系（干粉反應(yīng)管）成分包括：
dntps200μm-500μm
聚合酶bsu10-100u
單鏈結(jié)合蛋白1-10μg
重組酶（e.colirect）1-10μg
逆轉(zhuǎn)錄酶10-100u
正向引物10-40pm
反向引物10-40pm
熒光探針10-30pm
聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的用量可以根據(jù)需要調(diào)整其添加量，或通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定其用量。
優(yōu)選的，其反應(yīng)液具體組成成分如下：
tris-h2so4（ph8.0）70mm
硫酸銨100mm
二硫蘇糖醇3mm
甜菜堿1m
peg5%
bsa1mg/ml
一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，其啟動(dòng)液具體組成成分如下：
硫酸鎂10mm
一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，其反應(yīng)酶系（干粉反應(yīng)管）具體組成成分如下：
dntps200μm
聚合酶bsu50u
單鏈結(jié)合蛋白6μg
重組酶（e.colirect）2.5μg
逆轉(zhuǎn)錄酶20u
正向引物20pm
反向引物20pm
熒光探針15pm
重組酶為不依賴于能量分子的重組酶。
人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒其特異性引物序列如下：
正向引物：ccctcagatgctgcatataagcagctgcttt
反向引物：ccctgttcgggcgccactgctagagatttt
熒光探針：
fam-cactg-dr-[t(bhq-1)]ttaagcctcaataaagcttgccttgagtg-spacerc3。
優(yōu)選的，熒光探針5’端標(biāo)記的fam熒光基團(tuán)可被常用的其他熒光基團(tuán)（如hex、vic、cy5等）替換。
優(yōu)選的，人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒采用的重組酶選自e.colirect蛋白；λ噬菌體β蛋白；啤酒酵母sepι/stpβ；啤酒酵母dpa蛋白；啤酒酵母stpα蛋白；粟酒裂殖酵母p140/exo∥蛋白以及rrpι、hpp-ι、v-sep、icp8蛋白。
一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，包括將反應(yīng)液、反應(yīng)酶系與啟動(dòng)液混合，加入待檢樣本，在熒光定量pcr儀上進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，得到檢測(cè)結(jié)果。
優(yōu)選的，恒溫?cái)U(kuò)增的溫度為35～42℃，優(yōu)選擴(kuò)增溫度為37℃。
本發(fā)明的有益效果是：
①本發(fā)明采取的擴(kuò)增方式是恒溫?cái)U(kuò)增方式，相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法具有快速、高效、特異等優(yōu)點(diǎn)。
②本發(fā)明的恒溫?cái)U(kuò)增體系，不依賴于atp、磷酸肌酸等高能能量分子，相對(duì)現(xiàn)有的恒溫?cái)U(kuò)增體系，其組成更為簡單，成本更為低廉，使用更為方便。
③本發(fā)明的恒溫?cái)U(kuò)增體系可以對(duì)人類免疫缺陷病毒1型核酸序列實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，擴(kuò)增速度快且穩(wěn)定，可以在30min以內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增的靈敏度和準(zhǔn)確度高，不易出現(xiàn)錯(cuò)配，擴(kuò)增效果好。
附圖說明
圖1是實(shí)施例1的恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，其反應(yīng)液具體組成成分如下：
tris-h2so4（ph8.0）70mm
硫酸銨100mm
二硫蘇糖醇3mm
甜菜堿1m
peg5%
bsa1mg/ml
一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，其啟動(dòng)液具體組成成分如下：
硫酸鎂10mm
一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，其反應(yīng)酶系（干粉反應(yīng)管）具體組成成分如下：
dntps200μm
聚合酶bsu50u
單鏈結(jié)合蛋白6μg
重組酶（e.colirect）2.5μg
逆轉(zhuǎn)錄酶20u
正向引物20pm
反向引物20pm
熒光探針15pm
重組酶為不依賴于能量分子的重組酶。
作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，所使用的tris-h2so4的ph為8.0。
聚合酶為恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中常用的聚合酶，優(yōu)選為bsu或klenow；逆轉(zhuǎn)錄酶為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中常用的逆轉(zhuǎn)錄酶，優(yōu)選為常溫條件下反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄酶如amv或者mmlv。重組酶選自e.colirect蛋白；λ噬菌體β蛋白；啤酒酵母sepι/stpβ；啤酒酵母dpa蛋白；啤酒酵母stpα蛋白；粟酒裂殖酵母p140/exo∥蛋白以及rrpι、hpp-ι、v-sep、icp8蛋白。
作為上述方法的進(jìn)一步改進(jìn)，恒溫?cái)U(kuò)增的溫度為37℃。
下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
實(shí)施例1：試劑盒構(gòu)成
一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，其反應(yīng)液具體組成成分如下：
tris-h2so4（ph8.0）70mm
硫酸銨100mm
二硫蘇糖醇3mm
甜菜堿1m
peg5%
bsa1mg/ml
一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，其啟動(dòng)液具體組成成分如下：
硫酸鎂10mm
一種人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒，其反應(yīng)酶系（干粉反應(yīng)管）具體組成成分如下：
dntps200μm
聚合酶bsu50u
單鏈結(jié)合蛋白6μg
重組酶（e.colirect）2.5μg
逆轉(zhuǎn)錄酶20u
正向引物20pm
反向引物20pm
熒光探針15pm
人類免疫缺陷病毒1型恒溫檢測(cè)試劑盒其特異性引物序列如下：
正向引物：ccctcagatgctgcatataagcagctgcttt
反向引物：ccctgttcgggcgccactgctagagatttt
熒光探針：
fam-cactg-dr-[t(bhq-1)]ttaagcctcaataaagcttgccttgagtg-spacerc3
實(shí)施例2：本發(fā)明試劑盒檢測(cè)hiv-1陽性樣本與陰性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)對(duì)比
本實(shí)施例用hiv-1核酸作為樣本，用人基因組dna作為陰性對(duì)照。取兩個(gè)干粉反應(yīng)管，分別標(biāo)記為反應(yīng)管1和反應(yīng)管2。在兩個(gè)干粉反應(yīng)管分別加入反應(yīng)液25μl，蓋上反應(yīng)管管蓋，上下顛倒干粉反應(yīng)管8-10次，確認(rèn)干粉完全溶解。在反應(yīng)管1中加入2μlhiv-1核酸，在反應(yīng)管2中加入2μl人基因組dna作為陰性對(duì)照，用滅菌水補(bǔ)足體系到45μl，混勻后再分別加入5μl啟動(dòng)液。
選擇熒光定量pcr儀進(jìn)行擴(kuò)增及收集熒光，具體上機(jī)條件為：37℃，30s，45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都搜集熒光，結(jié)果如圖1。
從圖1可以看出，反應(yīng)體系對(duì)應(yīng)的hiv-1核酸樣本檢測(cè)結(jié)果呈明顯的”s”型擴(kuò)增曲線，表明檢測(cè)結(jié)果為陽性。檢測(cè)陰性對(duì)照無”s”型擴(kuò)增曲線，表明檢測(cè)結(jié)果為陰性。本實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒的檢測(cè)特異性好、準(zhǔn)確度高。
通過實(shí)施例與傳統(tǒng)pcr檢測(cè)試劑的操作時(shí)長比較，實(shí)施例所述試劑盒所需反應(yīng)時(shí)間小于30min，而傳統(tǒng)pcr檢測(cè)試劑普遍需要3-5小時(shí)，可見本發(fā)明試劑盒能大幅度縮減檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)效率高。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
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<110>廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司
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