技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的lamp檢測(cè)用引物組及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
：

金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一。它廣泛分布在自然界中，如空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到，因此食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。在美國(guó)由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33％；加拿大則更多，占到45％；我國(guó)每年發(fā)生的此類(lèi)中毒事件也非常多。因此，建立一種快速、有效的檢測(cè)方法對(duì)各種食品進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)督，及時(shí)檢測(cè)出食品中是否含有該菌非常重要。

目前金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定、免疫檢測(cè)pcr方法等。細(xì)菌分離鑒定法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)；免疫學(xué)方法如乳膠微粒凝集試驗(yàn)、elisa等，可以縮短檢測(cè)時(shí)間，但可能受到食物成分及葡萄球菌a蛋白的干擾；采用pcr方法可以快速、靈敏的從食品中檢測(cè)金黃色葡萄球菌，但因pcr技術(shù)對(duì)模板dna的質(zhì)量有較高要求，需要的熱循環(huán)設(shè)備價(jià)格昂貴而很難在基層得到推廣。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是notomi等人在2000年發(fā)明的一種新的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。傳統(tǒng)的pcr技術(shù)離不開(kāi)反復(fù)升降溫這個(gè)耗時(shí)耗能的過(guò)程，且反應(yīng)程序設(shè)定也較繁瑣。相比之下lamp技術(shù)克服了這些問(wèn)題。根據(jù)lamp技術(shù)的原理，它可實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下(一般在60～65℃)快速連續(xù)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)過(guò)程快速、簡(jiǎn)便，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、便攜，檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。lamp擴(kuò)增結(jié)果觀察方式多，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果、肉眼觀察顏色變化及試紙條技術(shù)，也可使用實(shí)時(shí)熒光法和實(shí)時(shí)濁度法，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光pcr儀或?qū)崟r(shí)濁度儀對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

鑒于此，有必要設(shè)計(jì)一種檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便、特異性高、靈敏度好、成本低廉的檢測(cè)金黃色葡萄球菌的lamp檢測(cè)用引物組，及利用該引物組檢測(cè)金黃色葡萄球菌的lamp檢測(cè)方法。

一種用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的lamp檢測(cè)用引物組，由內(nèi)引物對(duì)fip/bip和外引物對(duì)f3/b3組成，fip、bip、f3、b3具體如下：

一種利用前述引物組檢測(cè)金黃色葡萄球菌的lamp檢測(cè)方法，包括以下步驟：

步驟1、提取待測(cè)樣品dna；

步驟2、配制lamp檢測(cè)反應(yīng)體系，反應(yīng)體系包括引物：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4；

步驟3、以步驟1中提取的dna為模版進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增反應(yīng)，用實(shí)時(shí)濁度法鑒定擴(kuò)增結(jié)果。

優(yōu)選的，lamp檢測(cè)反應(yīng)體系具體為：2×反應(yīng)液rm12～13ul，fip、bip各3.7～4.3ul，f3、b3各0.4～0.6ul，bstdna聚合酶0.9～1.2ul，待測(cè)樣品dna1.8～2.2ul，補(bǔ)超純水至25ul。

優(yōu)選的，fip、bip的濃度是40umol/l，f3、b3的濃度是5umol/l。

優(yōu)選的，lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)前的預(yù)熱溫度50.0℃，lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度為63.0℃且進(jìn)行40min，lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)后的酶失活溫度95℃進(jìn)行2min。

上述的lamp檢測(cè)方法中，檢測(cè)結(jié)果通過(guò)實(shí)時(shí)濁度儀實(shí)時(shí)測(cè)量濁度值來(lái)判斷核酸有無(wú)擴(kuò)增。

本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，根據(jù)金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因sirb的序列，設(shè)計(jì)4條特異性lamp引物，用來(lái)建立金黃色葡萄球菌lamp檢測(cè)方法。結(jié)果表明，建立的lamp檢測(cè)方法對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)特異性良好，且方法的靈敏度高。本發(fā)明方法不受培養(yǎng)條件的限制，可在50min內(nèi)完成核酸的檢測(cè)。本發(fā)明對(duì)金黃色葡萄球菌定性檢測(cè)靈敏度可達(dá)到7.8cfu/ml，優(yōu)于一般pcr檢測(cè)方法，其檢測(cè)靈敏度是普通pcr的10倍。

附圖說(shuō)明：

附圖1是lamp引物篩選試驗(yàn)圖，no.1-8分別為fema-1引物組、fema-2引物組、ebh引物組、rpib-1引物組、rpib-2引物組、sirb-1引物組、sirb-2引物組、空白對(duì)照。

附圖2是60℃時(shí)溫度對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖3是61℃時(shí)溫度對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖4是62℃時(shí)溫度對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖5是63℃時(shí)溫度對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖6是64℃時(shí)溫度對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖7是65℃時(shí)溫度對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖8是30min時(shí)時(shí)間對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖9是40min時(shí)時(shí)間對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖10是50min時(shí)時(shí)間對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖11是60min時(shí)時(shí)間對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖12是引物特異性鑒定試驗(yàn)圖，no.1-8依次為金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、金黃色葡萄球菌分離株dzj-ys-003、金黃色葡萄球菌分離株dzj-ys-004、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、鮑氏志賀氏菌、單增李斯特氏菌、空白對(duì)照。

附圖13是lamp反應(yīng)靈敏度試驗(yàn)圖，no.1-8分別是菌液濃度為7.8×10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10cfu/ml。

附圖14是普通pcr反應(yīng)靈敏度試驗(yàn)圖，m為dl1000marker，泳道1-7分別是菌液濃度為7.8×10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10cfu/ml。

具體實(shí)施方式：

以下敘述中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

一、引物設(shè)計(jì)

按照l(shuí)amp引物設(shè)計(jì)原則，根據(jù)genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的金黃色葡萄球菌特異基因組序列，進(jìn)行多序列比對(duì)，尋找一段高度保守區(qū)作為擴(kuò)增對(duì)象，然后設(shè)計(jì)7組引物，采用hplc純化方式。合成后的引物用超純水稀釋成100pmol/pl溶液，-20℃保存?zhèn)溆?。各引物序列?jiàn)表1。

表1金黃色葡萄球菌的lamp檢測(cè)用引物

二、金黃色葡萄球菌的lamp檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法的建立

細(xì)菌基因組dna快速抽提試劑盒為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品，lamp擴(kuò)增體系的2×反應(yīng)液rm、bstdna聚合酶為榮研生物科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品。

日本榮研l(wèi)t-16alpha恒溫?cái)U(kuò)增基因檢測(cè)系統(tǒng)，abiveriti96wellthermalcycler核酸擴(kuò)增儀、bioradgeldocxr凝膠成像系統(tǒng)。

金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物保存中心和北京路橋技術(shù)股份有限公司(見(jiàn)表2)。

表2實(shí)驗(yàn)用菌種名稱及編號(hào)

1、樣品dna的提取

樣品為金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、鮑氏志賀氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌分離株dzj-ys-003、金黃色葡萄球菌分離株dzj-ys-004，共計(jì)5株標(biāo)準(zhǔn)菌株和2株金黃色葡萄球菌分離株的液體純培養(yǎng)物。

dna的提取方法按照dna提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中關(guān)于細(xì)菌dna提取要求進(jìn)行，具體步驟如下：

(1)吸取1ml過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液，加入1.5ml離心管中，室溫8000rpm離心1min，棄上清，收集菌體。加入400ulbufferdigestion，震蕩混勻。65℃水浴1h至細(xì)胞完全裂解。

(2)加入200ulbufferpb，充分顛倒混勻，-20℃冰箱放置5min。

(3)室溫10000rpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。

(4)加入等體積的異丙醇，顛倒5～8次使之充分混勻，室溫靜置2-3min。室溫10000rpm離心5min，棄上清。

(5)加入1ml75％乙醇，顛倒漂洗1～3min，10000rpm離心2min，棄上清。

(6)重復(fù)步驟5一次。

(7)開(kāi)蓋室溫倒置5～10min至殘留的乙醇完全揮發(fā)。

(8)得到的dna用50～100ultebuffer溶解。

獲得的dna模板的260/280比值均在1.8-2.0之間,濃度在200-500ng/ul。提取的dna質(zhì)量和濃度較高，適合后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)。

2、lamp反應(yīng)體系

反應(yīng)體系為：2×反應(yīng)液rm12.5ul，內(nèi)引物fip、bip各4ul，外引物f3、b3各0.5ul，bstdna聚合酶1ul，dna模版2.0ul，補(bǔ)水至25ul。

內(nèi)引物fip、bip的濃度是40umol/l，外引物f3、b3的濃度是5umol/l。

dna模版由各細(xì)菌的培養(yǎng)物提取而得。

3、最優(yōu)引物的篩選

將表1的6組引物(fema-1、fema-2、rpib-1、rpib-2、sirb-1、sirb-2、ebh)以金黃色葡萄球菌dna為模板，在榮研l(wèi)t-16alpha恒溫?cái)U(kuò)增基因檢測(cè)系統(tǒng)上同時(shí)進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)，并設(shè)空白對(duì)照，圖1中no.1-8分別為fema-1引物組、fema-2引物組、ebh引物組、rpib-1引物組、rpib-2引物組、sirb-1引物組、sirb-2引物組、空白對(duì)照。

擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋悍磻?yīng)溫度為63℃，反應(yīng)時(shí)間為40min，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。結(jié)果顯示，引物組rpib-1擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間(tt值)最早(見(jiàn)圖1)，且曲線峰值高度(df)值最高，引物組rpib-1擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間(tt值)和曲線峰值高度(df值)具體數(shù)值見(jiàn)表3。

表3lamp引物篩選試驗(yàn)tt值和df值

4、lamp反應(yīng)條件的優(yōu)化

4.1、反應(yīng)溫度的優(yōu)化:以上述篩選的最優(yōu)引物組rpib-1作為擴(kuò)增引物，以金黃色葡萄球菌dna為模板，95℃酶失活2min，做6組對(duì)照，分別將反應(yīng)混合物放在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃反應(yīng)條件下進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)，并設(shè)空白對(duì)照，附圖2～7分別為60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃擴(kuò)增曲線圖，反應(yīng)時(shí)間為40min，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)溫度為63℃時(shí)，擴(kuò)增效果最好，各反應(yīng)組擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間(tt值)和曲線峰值高度(df值)具體數(shù)值見(jiàn)表4。因此，引物組rpib-1擴(kuò)增反應(yīng)的最佳溫度為63℃。

表4lamp反應(yīng)溫度優(yōu)化試驗(yàn)tt值和df值

4.2、反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化：以上篩選的最優(yōu)引物組rpib-1作為擴(kuò)增引物，以金黃色葡萄球菌dna為模板，以上述最優(yōu)63℃為反應(yīng)溫度，95℃酶失活2min，做4組對(duì)照，分別將反應(yīng)混合物放在30min、40min、50min、60min反應(yīng)條件下進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)，并設(shè)空白對(duì)照，附圖8～11分別為30min、40min、50min、60min擴(kuò)增曲線圖，left反應(yīng)槽的no.1和right反應(yīng)槽的no.9均為空白對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為40℃時(shí)，擴(kuò)增效果最好，用時(shí)最短，各反應(yīng)組擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間(tt值)和曲線峰值高度(df值)具體數(shù)值見(jiàn)表5。因此，引物組rpib-1擴(kuò)增反應(yīng)的最佳溫度為40min。

表5lamp反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)tt值和df值

通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)金黃色葡萄球菌的lamp反應(yīng)條件進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整優(yōu)化后的lamp反應(yīng)溫度為63℃，反應(yīng)時(shí)間為40min，95℃酶失活2min。

三、引物的特異性鑒定:

為了驗(yàn)證設(shè)計(jì)引物金黃色葡萄球菌檢測(cè)的特異性，用第二部分(檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法的建立)所述反應(yīng)體系和優(yōu)化后條件，以4種非金黃色葡萄球菌細(xì)菌和3株陽(yáng)性對(duì)照金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物提取的dna為模板進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增檢測(cè)，并設(shè)置空白對(duì)照，no.1-8依次為金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、金黃色葡萄球菌分離株dzj-ys-003、金黃色葡萄球菌分離株dzj-ys-004、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、鮑氏志賀氏菌、單增李斯特氏菌、空白對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。

檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖12，可以看出，只有以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株及金黃色葡萄球菌分離株純培養(yǎng)物提取的dna模板有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，其他反應(yīng)孔均無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，其它樣品為陰性。結(jié)果表明，引物組rpib-1對(duì)金黃色葡萄球菌具有專(zhuān)一性，可用于對(duì)金黃色葡萄球菌的特異性檢測(cè)。

四、靈敏度實(shí)驗(yàn)：

1、原菌液濃度的定量

經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌菌液，用生理鹽水10倍系列稀釋?zhuān)桨寰溆?jì)數(shù)，推算原菌液濃度。通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得金黃色葡萄球菌原菌液濃度為7.8×10⁷cfu/ml，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)

2、模板的稀釋以及l(fā)amp反應(yīng)：將上一步驟中(原菌液濃度的定量)測(cè)得的原菌液依次做10倍梯度稀釋?zhuān)♂尪葹?0^-1-10^-7，分別標(biāo)記為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)，然后每個(gè)稀釋度取2ul作為模板,用第二部分(檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法的建立)所述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。同時(shí)，也使用傳統(tǒng)的pcr方法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性60s，58℃退火30s，72℃延伸45s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度為194bp。

3、檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖13和附圖14，圖13中no.1-8分別是菌液濃度為7.8×10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10cfu/ml；圖14中m為dl1000marker，泳道1-7分別是菌液濃度為7.8×10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10cfu/ml。結(jié)果表明：傳統(tǒng)的pcr擴(kuò)增的敏感性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖14，1、2、3、4、5、6號(hào)泳道有特異性條帶，其它泳道無(wú)特異性擴(kuò)增，即pcr的擴(kuò)增的最低靈敏度為78cfu/ml。lamp擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖13，no.1-8號(hào)反應(yīng)孔有擴(kuò)增曲線出線，及l(fā)amp擴(kuò)增最低靈敏度為7.8cfu/ml，與普通pcr相比，靈敏度提高了10倍。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)最終確定了本發(fā)明的一種用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的lamp檢測(cè)用引物組，由內(nèi)引物對(duì)fip/bip和外引物對(duì)f3/b3組成，fip、bip、f3、b3具體如下：

一種利用前述引物組檢測(cè)金黃色葡萄球菌的lamp檢測(cè)方法，包括以下步驟：

步驟1、提取待測(cè)樣品dna；

步驟2、配制lamp檢測(cè)反應(yīng)體系，反應(yīng)體系包括引物：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4，2×反應(yīng)液rm12.5ul，fip、bip的濃度是40umol/l且各4ul，f3、b3的濃度是5umol/l且各0.5ul，bstdna聚合酶1.0ul，待測(cè)樣品dna2.0ul，補(bǔ)超純水至25ul；

步驟3、以步驟1中提取的dna為模版進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增反應(yīng)，lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)前的預(yù)熱溫度50.0℃，lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度為63.0℃且進(jìn)行40min，lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)后的酶失活溫度95℃進(jìn)行2min，用實(shí)時(shí)濁度法鑒定擴(kuò)增結(jié)果。

序列表

<110>寧夏出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心

<120>一種用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的lamp檢測(cè)用引物組及檢測(cè)方法

<170>patentinversion3.5

<160>4

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<213>人工序列

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