本發(fā)明涉及基因缺失檢測領(lǐng)域，更具體地，涉及一種檢測y染色體azfa和azfb微缺失的多重pcr引物組、包括多重pcr引物組的該試劑盒和所述多重pcr引物組及試劑盒作為檢測y染色體azfa和azfb微缺失試劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

世界衛(wèi)生組織(who)的研究調(diào)查表明，全世界約有10-15％的育齡夫婦存在不孕不育，其中男性因素約占50％。y染色體微缺失，是除了克氏綜合征以外導(dǎo)致男性不育的第二大遺傳學(xué)病因。y染色體長臂的無精子因子(azf)是被證實為控制精子生成的關(guān)鍵基因簇；在男性不育領(lǐng)域，y染色體微缺失特指azf區(qū)微缺失。azf區(qū)分為azfa、azfb和azfc三個亞區(qū)，任何一個亞區(qū)的微缺失都可能導(dǎo)致生精障礙。

azfa區(qū)長度約為1100kb，該區(qū)候選功能基因有usp9y、dby、tb4y和uty，主導(dǎo)精母細(xì)胞的增生。azfa區(qū)缺失將導(dǎo)致嚴(yán)重的生精障礙、睪丸發(fā)育不良，表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征，為絕對的無精子癥。azfa區(qū)完全缺失患者，即使通過睪丸穿刺手術(shù)無法獲得精子，因此不建議做單精子胞漿內(nèi)注射輔助生殖。有報道表明在azfa區(qū)部分缺失(sy83、sy86、sy84缺失)患者仍能自然生育男性后代，且子代與父代azfa缺失一致。

azfb區(qū)長度約為4.73mb，該區(qū)候選功能基因有smcy、eif1ay、rmby1a、cdy和xkry。azfb區(qū)缺失患者通常表現(xiàn)為生精阻滯，精子生成被阻滯在精母細(xì)胞或精子細(xì)胞階段，患者睪丸內(nèi)仍可見精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞，但沒有成熟精子生成。因此，azfb區(qū)完全缺失患者通過睪丸穿刺手術(shù)也無法獲得精子，也不能采用單精子胞漿內(nèi)注射輔助生殖。azfb區(qū)部分缺失患者臨床表現(xiàn)多樣，其睪丸組織內(nèi)尚存在一定的生精功能，可通過睪丸穿刺獲得精子進(jìn)行卵胞漿內(nèi)注射獲得后代。

azfc區(qū)域缺失是臨床上最常見的azf缺失類型，是引起生精障礙的一個重要原因。azfc缺失患者臨床表現(xiàn)多樣化，一般來說，患者尚存精子生成能力，因此可以通過輔助生殖技術(shù)獲得后代。

鑒于azfa區(qū)和azfb區(qū)部分缺失后生精能力的多樣性以及完全缺失導(dǎo)致的生精障礙的嚴(yán)重性，有必要對azfa區(qū)和azfb區(qū)缺患者的缺失程度及斷點位置進(jìn)行精確定位，確定其缺失類型是部分缺失或全部缺失，以正確評估患者睪丸生精障礙程度以及是否能夠獲得精子的可能性，為后續(xù)治療方案提供遺傳學(xué)依據(jù)。

azf微缺失的檢測主要是針對y染色體特定的序列標(biāo)簽位點(sts)檢測，2013年歐洲男科協(xié)會(eaa)和歐洲分子遺傳質(zhì)控網(wǎng)(emqn)聯(lián)合發(fā)布的《y染色體微缺失的最佳實踐操作指南》推薦檢測6個sts位點，即azfa(sy84，sy86)；azfb(sy127，sy134)；azfc(sy254，sy255)作為azf微缺失常規(guī)篩查位點。檢測這6個sts位點能夠診斷超過95％的azf缺失情形。然而，根據(jù)近幾年的基因型–臨床表型相關(guān)性數(shù)據(jù)，對于azfa(sy84，sy86)或者azfb(sy127，sy134)缺失，eaa/emqn指南推薦進(jìn)一步擴大檢測位點以明確y染色體微缺失區(qū)域及類型：利用靠近著絲粒端的sy82、sy83/sy1064和靠近遠(yuǎn)端的sy1065/sy1182、sy88判斷azfa區(qū)域是否發(fā)生片段的完全缺失；利用靠近著絲粒端的sy105、sy121/sy1224和靠近遠(yuǎn)端的sy143/sy1192，sy153判斷azfb區(qū)域是否發(fā)生片段的完全缺失。

目前檢測azf區(qū)微缺失的方法包括多重pcr-凝膠電泳法、多重?zé)晒鈖cr法、芯片雜交法、多重連接探針擴增(mlpa)等多種方法。最常用的是針對序列標(biāo)簽位點(sts)，采用多重pcr擴增-凝膠電泳檢測，根據(jù)條帶的有無對azf各區(qū)的缺失情況做出定性分析。目前該方法已成為檢測azf微缺失的行業(yè)“金標(biāo)準(zhǔn)”；但是該方法的檢測敏感性不高，凝膠電泳易造成pcr產(chǎn)物污染導(dǎo)致假陽性；操作繁瑣，其檢測通量小，不適用于對大樣本量的檢測。多重?zé)晒鈖cr方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確的特點，但是探針設(shè)計繁瑣并且需要報告基團修飾，價格昂貴，不適合臨床推廣使用。目前，根據(jù)上述這兩種檢測方法，已有多種的y染色體微缺失檢測試劑盒面世。芯片雜交技術(shù)也有報道用于檢測azf區(qū)微缺失，該方法具有極高的準(zhǔn)確度和靈敏度；但是該方法需要設(shè)計大量的探針，成本較高，并且其檢測、分析也較為復(fù)雜，不適合臨床醫(yī)生判讀。

因此，建立一種簡單快速、準(zhǔn)確度高且低成本的分子遺傳學(xué)檢測方法對臨床具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種操作簡單、高效、通過一次性擴增多個基因片斷用于檢測y染色體azfa和azfb微缺失的方法。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)多重pcr靈敏度低、非特異性擴增等缺點，通過一套新型的穩(wěn)定的通用引物-多重pcr的反應(yīng)體系結(jié)合熒光標(biāo)記通用引物的方法，擴增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析，確保了檢測的高靈敏度，有效降低了成本，并且可以實現(xiàn)大樣本量的高效檢測。毛細(xì)管的方法具有較高的分辨度和靈敏度，可以檢測單個核苷酸的差異，毛細(xì)管電泳圖清晰直觀，易于判讀，減少假陰性和假陽性結(jié)果率，提高了y染色體微卻缺診斷的準(zhǔn)確性。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種檢測y染色體azfa和azfb微缺失的多重pcr引物組，該多重pcr引物組包括通用引物和特異性引物，

所述通用引物具有如seqidno：1和seqidno：2所示的堿基序列：

正向dye-universalp-forward(fam-up-f)：5’-ggtgaccaagttcatgctct-3’(seqidno：1)

反向universalp-reverse(up-r)：5’-ggtccaggtcacgagatctt-3’(seqidno：2)

其中，seqidno：1所示堿基序列的5’端標(biāo)記有熒光基團dye；

所述特異性引物包括具有如seqidno：3～seqidno：28所示堿基序列的引物。具體如表1所示。

所述引物組包括了4個azfa和azfb區(qū)常規(guī)篩查位點和8個拓展分析位點(azfa：sy82、sy83、sy84、sy86、sy1065、sy88；azfb：sy105、sy121、sy127、sy134、sy1192、sy153)的特異性引物序列和一對通用引物序列。

通用引物中正向引物的5’端標(biāo)記有熒光基團，所述熒光基團為fam、hex、vic、tet、joe、rox、texas-red、cy3、cy5或cy5.5。

根據(jù)本發(fā)明，多重pcr引物組中，seqidno：1～seqidno：28的摩爾比優(yōu)選為(2-20)：(2-20)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)。上述優(yōu)選比例的各個引物，能夠獲得更好的檢測效果。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種檢測y染色體azfa和azfb微缺失的試劑盒，該試劑盒包括：

如上所述的多重pcr引物組；

多重pcr反應(yīng)試劑。

其中，所述多重pcr反應(yīng)試劑包括但不限于：mgcl2、甜菜堿、熱啟動taq酶、dntps和pcr反應(yīng)緩沖液。

上述pcr反應(yīng)試劑，可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方式進(jìn)行自行配制或通過普通市售獲得。

根據(jù)本發(fā)明，試劑盒中，所述mgcl2的濃度為50-200mmol/l；所述甜菜堿的濃度為5-20mol/l；所述dntps的濃度為5-20mmol/l。

使用時，所述mgcl2的終濃度為1.0～5.0mmol/l；所述甜菜堿的終濃度為0.5～2.5mol/l；所述dntps的終濃度為50～1000μmol/l。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，該試劑盒包括：對照dna標(biāo)本。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述dna標(biāo)本為正常男性對照標(biāo)本、azfa區(qū)缺失對照標(biāo)本和azfb區(qū)缺失對照標(biāo)本中的至少一種。優(yōu)選地，包括上述全部對照dna標(biāo)本。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明還提供上述的多重pcr引物組或上述的試劑盒作為檢測y染色體azfa和azfb微缺失試劑的應(yīng)用。

應(yīng)用本發(fā)明的多重pcr引物組或試劑盒可用于男性y染色體azfa和azfb微缺失通用引物-多重pcr檢測，檢測方法包括以下步驟：

1)從待測人外周血、口腔黏膜上皮細(xì)胞、干血片或者組織切片提取人基因組dna；

2)以步驟1)所得dna為模板，利用所述特異性擴增引物組進(jìn)行pcr擴增；

3)多重pcr產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析。

本發(fā)明的12對引物分別特異性擴增azfa和azfb亞區(qū)，1對內(nèi)對照引物擴增男性特有基因。每條引物的正反向引物的5’端含有一段20bp的共同序列。設(shè)計的通用引物序列與這一段序列完全一致，并在正向通用引物5’端連接熒光基團。本發(fā)明利用一管pcr反應(yīng)體系實現(xiàn)13對引物的特異性擴增，同時利用帶熒光的通用引物對所有特異性擴增的目的片段二次擴增并帶上熒光，擴增產(chǎn)物片段長度呈梯度分布，結(jié)果通過毛細(xì)管電泳分析，以達(dá)到簡單、快速、高通量和經(jīng)濟的目的。

與現(xiàn)有檢測試劑盒及方法相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點：

1)檢測體系里只需要一個單末端熒光標(biāo)記的引物，不需要多個taqman等熒光探針，大大降低了成本。

2)單管pcr即可完成所有位點的檢測，節(jié)省了成本又簡化了操作，既適用于小樣本的檢測，也適用于大樣本的通量檢測。

3)涵蓋了azfa和azfb亞區(qū)的12個缺失熱點的檢測，同時引入sry基因作為內(nèi)對照保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4)通過優(yōu)化的引物設(shè)計及反應(yīng)條件，本檢測具有穩(wěn)定的、高效的pcr反應(yīng)體系。不僅可以應(yīng)用于外周血樣本，同樣適用于極其微量的樣品，如口腔黏膜脫落細(xì)胞、干血片、組織切片等。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后具體實施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

通過結(jié)合附圖對本發(fā)明示例性實施方式進(jìn)行更詳細(xì)的描述。

圖1示出了azfa和azfb亞區(qū)微缺失拓展分析的13個檢測位點(12個sts位點+1個對照位點)在y染色體分布的模式圖。

圖2的a行示出了正常男性經(jīng)多重pcr在13個檢測位點的擴增峰；b行示出了azfa區(qū)完全缺失樣本經(jīng)多重pcr在10個檢測位點的擴增峰；c行示出了azfb區(qū)完全缺失樣本經(jīng)多重pcr在10個檢測位點的擴增峰；d行和e行分別示出了azfb區(qū)不完全缺失樣本經(jīng)多重pcr在10個檢測位點的擴增峰。

具體實施方式

下面將參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。

實施例1外周血樣本檢測azf區(qū)微缺失

1、材料：

1例正常已育男性樣本、4例已經(jīng)確診的azf微缺失型少精或無精癥男性患者樣本：1例azfa區(qū)完全缺失[sy82(+)、sy83(-)、sy84(-)、sy86(-)、sy1065(-)、sy88(+)]，1例azfb區(qū)完全缺失[sy105(+)、sy121(-)、sy127(-)、sy134(-)、sy1192(-)、sy153(+)]，2例azfb區(qū)部分缺失：[sy105(+)、sy121(-)、sy127(-)、sy134(-)、sy1192(+)、sy153(+)]和[sy105(+)、sy121(+)、sy127(-)、sy134(-)、sy1192(+)、sy153(+)]。所有樣本均已通過eaa/emqn(2013版)的y染色體微缺失檢測指南推薦的多重pcr-凝膠電泳方法驗證。

2、基因組dna的提取

使用omega公司“基因組dna抽提試劑盒”從edta抗凝全血中提取人基因組dna。

3、多重pcr擴增與檢測

所有引物在公司合成，其中通用引物的正向引物5’端選用fam修飾，其余引物無需特殊修飾，所有引物經(jīng)高效液相色譜(hplc)純化。。

多重引物組合：每對正、反向引物按照1：1混合，終濃度10μmol/l，然后將各組引物sy82：sy83：sy84：sy86：sy1065：sy88：sy105：sy121：sy127：sy134：sy1192：sy153：sry：fam-up-f：up-r按照1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：4：4的比例配置成多重pcr引物組合存儲液。

pcr實驗選擇kapabiosystems公司的kapa2gmultiplexpcr試劑盒(kk5802)。為了簡少人為誤差，簡化操作流程，本實施例中首先將pcr擴增試劑配置成mix(包括buffer、dntps、h2o、引物組、hotstartdnapolymerase)，分裝至每個反應(yīng)管；最后加入不同樣本dna(各反應(yīng)組分如表2所示)。

表2.多重pcr反應(yīng)體系

pcr反應(yīng)在abipcr儀器上進(jìn)行，按以下條件進(jìn)行擴增檢測：

第一階段：95℃3min；

第二階段：95℃15sec，62℃30sec，72℃45sec，10個循環(huán)；

第三階段：95℃15sec，58℃30sec，72℃45sec，15個循環(huán)。

第四階段：72℃15min。

4、毛細(xì)管電泳分析

多重pcr產(chǎn)物采用abiappliedbiosytems公司的3130xl分析儀。取1μl多重pcr產(chǎn)物與8.5μl甲酰胺、0.5ul分子量內(nèi)標(biāo)liz500size混合，95℃加熱3min，-20℃快速降溫并放置3min，上機檢測，結(jié)果經(jīng)gene-mapper軟件分析。檢測位點與相應(yīng)的電泳坐標(biāo)位置如下：sry(510±1)、sy82(304±1)、sy322(371±1)、sy84(366±1)、sy86(358±1)、sy1065(379±1)、sy88(165±1)、sy105(332±1)、sy121(230±1)、sy127(314±1)、sy134(342±1)、sy1192(295±1)、sy153(177±1)。

陽性對照：以正常男性基因組dna作為模板的多重pcr，在上述13個坐標(biāo)位置均有明確的擴增峰。

內(nèi)對照：以待測男性基因組dna作為模板的反應(yīng)管內(nèi)，sry(509±1)位置應(yīng)該有明確的擴增峰。

結(jié)果分析

(1)毛細(xì)管電泳結(jié)果的橫坐標(biāo)顯示為擴增片段的大小，縱坐標(biāo)顯示為擴增片段的熒光強度，間接反應(yīng)片段擴增的量。每一個單一擴增峰代表一個擴增片段，沒有擴增峰則表示該片段沒有擴增，該sts位點為缺失。

(2)陽性對照組在12個sts位點(sy82、sy83、sy84、sy86、sy1065、sy88、sy105、sy121、sy127、sy134、sy1192、sy153)和內(nèi)對照(sry)具有單一、清楚的擴增峰(如圖2的a行示)。

(3)azfa區(qū)微缺失判定：sy84、sy86位置不存在擴增峰，表明azfa亞區(qū)缺失；sy82和sy88位于azfa亞區(qū)兩端邊緣位置，存在擴增峰；sy83和sy1065分別位于sy84、sy86的兩側(cè)位置，sy83和sy1065位置不存在擴增峰，則可以判定為azfa亞區(qū)完全缺失(如圖2的b行示)；sy83和sy1065位置均存在或者其中之一存在擴增峰，則可以判定為azfa亞區(qū)不完全缺失。

(4)azfb區(qū)微缺失判定：sy127、sy134位置不存在擴增峰，表明azfb亞區(qū)缺失；sy105和sy153位于azfb亞區(qū)兩端邊緣位置，存在擴增峰；sy121和sy1192分別位于sy84、sy86的兩側(cè)位置，sy121和sy1192位置不存在擴增峰，則可以判定為azfb亞區(qū)完全缺失(如圖2的c行示)；sy121和sy1192位置均存在或者其中之一存在擴增峰，則可以判定為azfb亞區(qū)不完全缺失(如圖2的d行和e行所示)。

上述實驗結(jié)果證實，本發(fā)明的多重pcr引物和試劑盒用于檢測y染色體微缺失的方法可靠、靈敏度高，成本低，并且可以實現(xiàn)大樣本量的高效檢測。

以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的范圍和精神的情況下，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。

sequencelisting

<110>鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院

<120>檢測y染色體azfa和azfb微缺失的多重pcr引物組、試劑盒和應(yīng)用

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<212>dna

<213>人工序列

<400>28

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